MicroRNA-18a de macrófagos M2 impulsa la progresión del carcinoma nasofaríngeo al dirigirse a TGFBR3 en la vía TGF-β

Resumen

Objetivos

El carcinoma nasofaríngeo (CNP) es un tipo de enfermedad nasofaríngea con altas propiedades de metástasis e invasión. Los macrófagos alternativamente activados asociados al tumor (M2) están vinculados con el CNP. Basado en esto, este estudio tiene como objetivo explorar el mecanismo y participación de microRNA-18a (miR-18a) de macrófagos M2 en el CNP.

Métodos

Células mononucleares de sangre periférica se diferenciaron a macrófagos y se polarizaron a tipo M2 por interleucina-4. Células SUNE-1 y CNE2 se transfectaron con miR-18a restaurado o agotado o receptor III de factor de crecimiento transformante beta (TGFBR3) para explorar sus roles en la progresión del CNP con la participación de la vía de señalización TGF-β. Luego, células SUNE-1 y CNE2 se co-cultivaron con macrófagos M2 tratados con miR-18a o TGFBR3 restaurados o agotados para comprender sus roles combinados en el CNP con la participación de la vía TGF-β.

Resultados

MiR-18a estaba altamente expresado y TGFBR3 pobremente expresado en células CNP. La restauración de miR-18a, knockdown de TGFBR3 o co-cultivo con macrófagos M2 transfectados con miméticos de miR-18a o si-TGFBR3 promovieron la progresión de células SUNE-1, crecimiento tumoral en ratones, disminuyeron p-Smad1/t-Smad1 y elevaron p-Smad3/t-Smad3. La downregulación de miR-18a, sobreexpresión de TGFBR3, o co-cultivo con macrófagos M2 transfectados con inhibidores de miR-18a u OE-TGFBR3 deprimieron la progresión de células CNE2, crecimiento tumoral en ratones, aumentaron p-Smad1/t-Smad1 y disminuyeron p-Smad3/t-Smad3.

Conclusión

Nuestro estudio dilucida que miR-18a de macrófagos M2 resulta en progresión promovida de células CNP y crecimiento tumoral en ratones desnudos vía represión de TGFBR3, junto con inactivación de Smad1 y activación de Smad3.

Introducción

El carcinoma nasofaríngeo (CNP) es un tumor epitelial maligno inclinado a infiltración local y metástasis distante temprana. Los pacientes con CNP a menudo presentan parálisis del sexto nervio y síndrome de Horner. Actualmente, el tratamiento aplicado consiste predominantemente en radioterapia, y radioterapia y quimioterapia integradas. Desafortunadamente, la radioterapia y quimioterapia están inesperadamente acompañadas de complicaciones, y la resistencia adquirida a la radioterapia obstaculiza los resultados del CNP. Dado que la tarea de profundizar en terapias dirigidas potenciales es prioritaria.

MicroARNs (miARNs) desregulados están documentados en la tumorigenesis, metástasis, invasión y resistencia a radioterapia y quimioterapia del CNP. Como subfamilia de miARNs, miR-18a facilita la progresión del CNP mediante inhibición de supresor de morfogénesis en genitalia 1 y activación de vía mTOR. Además, miR-18a activa la proliferación y metástasis de células CNP vía regulación de DICER1. Adicionalmente, la progresión de células CNP es impulsada por miR-18a mediante deterioro de biogénesis de miARN. Además, miR-18a funciona críticamente en la metástasis del CNP. Los macrófagos alternativamente activados (M2) son componentes importantes de malignidades sólidas y hematológicas y están conectados con progresión, metástasis y resistencia a terapia. Los macrófagos asociados al tumor polarizados M2 se asocian con mal pronóstico del CNP. Se registra intrigantemente las diferencias de macrófagos M2 en CNP negativo y positivo para virus Epstein-Barr. Hay un estudio que describe que miR-18a inhibe la metástasis hepática de células de cáncer de colon induciendo macrófagos M1. El receptor III de factor de crecimiento transformante beta (TGFBR3) es un co-receptor TGF-β que proporciona el ligando del receptor tipo II TGF-β para estimular la señalización y equilibrio de superficie celular, y TGFBR3 soluble es un regulador durante la progresión del cáncer. TGFBR3 pobremente expresado induce un microambiente tumoral inmunotolerante. Opuesto, la sobreexpresión transitoria de TGFBR3 induce apoptosis en células CNP humanas. A nuestro mejor conocimiento, la polarización de macrófagos M2 inducida por miR-181a avanza la metástasis de células tumorales mediada por macrófagos M2 vía eje factor 6 tipo Kruppel-like y proteína de unión CCAAT/enhancer α.

Colectivamente, aunque muchos estudios han descubierto el papel independiente de miR-18a, TGFBR3 y macrófagos M2 en CNP, las interacciones combinadas entre estos tres factores siguen siendo elusivas. Considerando que este estudio se lanza para descifrar los mecanismos y participación de estos factores en CNP.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

El experimento fue aprobado por el comité de ética del Tercer Hospital Xiangya, Universidad Central del Sur y cumplió los estándares de ética médica. Este estudio se realizó con consentimiento escrito de todos los donantes. Los experimentos con animales cumplieron los requisitos de las regulaciones nacionales de manejo y uso de animales de laboratorio.

Recolección de Células Mononucleares de Sangre Periférica

Los monocitos se obtuvieron de sangre periférica de donantes sanos por método de adherencia. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron de donantes sanos del Departamento de Hematología del Tercer Hospital Xiangya, Universidad Central del Sur. Los macrófagos derivados de monocitos se obtuvieron mediante adherencia plástica de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) previamente aisladas por centrifugación de gradiente de densidad (Ficoll-Paque, GE Healthcare) de preparaciones de capa leucocitaria de sangre de donantes sanos. Luego, 2,0 × 10⁶ PBMCs se cultivaron en medio Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) suplementado con 10% suero humano (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) y penicilina/estreptomicina en placas de 12 pocillos (NalgeNunc, NY, EE. UU.). Cuando PBMCs se adhirieron a la pared por 2–3 h, el sobrenadante y PBMCs en suspensión se removieron repetidamente para obtener monocitos adherentes.

Polarización de Macrófagos

Los monocitos se indujeron a diferenciar en macrófagos por factor estimulante de colonias de macrófagos humano (M-CSF) y se polarizaron en macrófagos M2 por interleucina (IL)-4.

Inducción de Macrófagos

Los monocitos se cultivaron en 20% suero fetal bovino (FBS)-DMEM y se añadió M-CSF (100 μg, Peprotech, NJ, EE. UU.) a concentración final de 100 ng/mL. El medio se renovó a la mitad cada 3 días y luego se suplementó con 100 ng/mL M-CSF. Cultivados al día 7–8, parte de las células se cosecharon, y marcadores superficiales de macrófagos CD68, CD163 y CD206 se probaron por inmunofluorescencia para identificar macrófagos.

Polarización de Macrófagos

Los macrófagos se polarizaron a macrófagos M2 suplementando 20 ng/mL IL-4 (Peprotech) al medio de diferenciación por otras 24 h. Parte de las muestras de macrófagos M2 se utilizaron para detección por citometría de flujo. Las muestras se dividieron en 3 tubos: tubo 1 fue el mismo lote de macrófagos adherentes sin estimulación IL-4; tubos 2 y 3 fueron macrófagos adherentes estimulados por IL-4. Las muestras se diluyeron a unas 10.000 células al cargar y se añadieron inmunoglobulina G no específica para bloquear el receptor Fc. Luego se añadieron anticuerpo isotipo no específico, anticuerpo CD68 marcado con PE, y anticuerpo CD163 marcado con PE (ambos de Biolegend, CA, EE. UU.). Incubados 30 min y enjuagados con 0,5% albúmina sérica bovina en fosfato salino amortiguado (PBS), las muestras se centrifugaron y se convirtieron en suspensión celular con 500 μL PBS para detección.

Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa de Transcripción Inversa

La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) se empleó para detectar expresión de miR-18a, CCL22, receptor gamma activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR-γ) y ARNm TGFBR3 en células recolectadas. El ARN total se extrajo de células por Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se transcribió inversamente a ARN complementario por kit Mir-X miRNA First Strand Synthesis (Clontech, Mountain View, CA, EE. UU.) para miR-18a y kit PrimeScriptTM RT Master Mix (Takara, Dalian, China) para CCL22, PPAR-γ y TGFBR3. U6 y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fueron controles de carga para miR-18a, CCL22, PPAR-γ y TGFBR3. SYBR®Premix Ex Taq™ II (Perfect Real Time) (Takara) en un sistema LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Indiana, EE. UU.) se utilizó en PCR. El cálculo de datos se evaluó por método 2^(-ΔΔCT). Los cebadores PCR se presentaron en Tabla 1.

Ensayo Western Blot

El ensayo Western blot se aplicó a la detección de TGFBR3, Smad1 total (t), Smad1 fosforilado (p), t-Smad3 y p-Smad3 en células recolectadas. La proteína total de células se extrajo y la concentración de proteína se determinó basada en kit de ácido bicinconínico. La muestra de proteína se cargó a los pocillos en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico y se transfirió a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana PVDF se bloqueó con leche desnatada e incubó con anticuerpos primarios TGFBR3 (1:2000, R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.), t-Smad1 (1:1000), p-Smad1 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), t-Smad3 (1:1000), p-Smad3 (1:1000), y GAPDH (1:1000, todos de Abcam, Cambridge, MA, Reino Unido) seguido de incubación con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, EE. UU.). Lavada 3 veces con salino amortiguado con Tris con Tween 20, la membrana se desarrolló por quimioluminiscencia mejorada. La cuantificación de señales se completó por el software National Institutes of Health ImageJ Imaging Processing Analysis con intensidad de señal normalizada a GAPDH.

Cultivo y Criba Celular

Líneas celulares humanas de CNP CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 y línea celular normal nasofaríngea humana NP96 (Institutos de Shanghai para Ciencias Biológicas, Academia China de Ciencias, Shanghai, China) se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (Gibco, CA, EE. UU.) conteniendo FBS (Gibco), 100 μg/mL penicilina y 100 μg/mL estreptomicina y se pasaron al 80% de confluencia. RT-qPCR se utilizó para detectar expresión de miR-18a. Entre esas líneas celulares CNP, células CNE2 y SUNE-1 mostraron la mayor y menor diferencia en expresión de miR-18a de células NP96, así que se seleccionaron para ensayos de down-regulación o up-regulación de miR-18a.

Agrupamiento y Tratamiento Celular

Entre todas las líneas celulares CNP, células SUNE-1 con la menor diferencia de células NP96 en expresión de miR-18a fueron seleccionadas. Guiados por especificaciones de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), células SUNE-1 se transfectaron con miméticos miR-18a, control negativo (NC) de miméticos miR-18a, si-TGFBR3, o si-TGFBR3 NC. Entre todas las líneas celulares CNP, células CNE2 con la mayor diferencia de células NP96 en expresión de miR-18a fueron seleccionadas y transfectadas con inhibidores miR-18a, NC inhibidores miR-18a, sobreexpresión (OE)-TGFBR3 u OE-TGFBR3 NC por Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Guiados por especificaciones de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), macrófagos M2 se transfectaron con miméticos miR-18a, NC miméticos miR-18a, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, inhibidores miR-18a, NC inhibidores miR-18a, OE-TGFBR3, u OE-TGFBR3 NC.

Co-cultivo de Macrófagos M2 y Células CNP

El co-cultivo celular en cámara Transwell se adoptó para explorar los efectos de miARN de macrófago M2 en células CNP. La cámara superior se llenó con macrófago M2 con tamaño de poro 0,4 μm, que solo detuvo células de la cámara superior de pasar pero no las moléculas pequeñas secretadas por las células como vesículas, factores de crecimiento, nutrientes, etc. La cámara inferior se extendió con células CNP. Células SUNE-1 y CNE2 se incubaron en FBS normal (Gibco). Las células en fase de crecimiento logarítmico se adoptaron para experimentos. Células SUNE-1 y CNE2 se co-cultivaron con macrófagos M2 en medio 10% FBS-RPMI-1640 (ambos de Gibco) en plato de cultivo celular con inserto Transwell (Coring, Corning, NY, EE. UU.) con tamaño de poro 0,4 μm.

Ensayo MTT

La viabilidad celular se probó por ensayo 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolium Bromuro (MTT), que fue un ensayo colorimétrico aplicado para determinar la actividad de deshidrogenasa mitocondrial, que redujo MTT a formazán. Tripsinizadas y sembradas en placas de 96 pocillos a 4 × 10⁴ células/pocillo, las células se privaron de medio de cultivo en el 0, 12, 24, 36 y 48 h respectivamente y se suplementaron con solución MTT (500 μL, 0,5 g/L). Incubadas 4 h, el sobrenadante se desechó y las células se incubaron con 200 μL solución de dimetilsulfóxido. Los valores de densidad óptica (DO, 490 nm) se midieron en un lector de microplacas (ELX808IU, BioTek, VT, EE. UU.). Cada grupo se configuró con 6 pocillos paralelos.

Ensayo de Formación de Colonias

La capacidad de formación de colonias de células CNP se probó por ensayo de formación de colonias, que reflejó la dependencia de población celular y proliferación clonal celular. Cultivadas 24 h y desprendidas con 0,25% tripsina, 300 células se sembraron en plato de 35 mm con 3 pocillos paralelos en cada grupo. Con medio de cultivo renovado cada 3 días, las células se cultivaron una semana y se fijaron con 5 mL 4% paraformaldehído. Después, las células se tiñeron con solución de tinción violeta de cristal y se secaron al aire. El plato se invirtió sobre el cual se superpuso una película transparente de cuadrícula, y el número de colonias (más de 50 células) se contó bajo microscopio (Olympus, Tokio, Japón).

Prueba de Rayado

La migración celular se probó por prueba de rayado. Las células se tripsinizaron, sembraron en placas de 6 pocillos con 3 pocillos paralelos para cada grupo, y se cultivaron al 90% de confluencia. Luego, las células se incubaron en medio con 2% FBS y rayados verticales se dibujaron con punta de 100 μL. Las células se fotografiaron en el 0 y 24 h bajo microscopio invertido para medir distancia de migración celular.

Ensayo Transwell

La invasión y migración celular se probaron por ensayo Transwell. La cámara superior de la cámara Transwell se pre-sumergió y añadió 100 μL Matrigel (Coring) diluido por medio RPMI 1640 libre de suero a 1:100. Las cámaras superior e inferior se añadieron con 200 μL y 600 μL medio RPMI 1640 libre de suero respectivamente. Subsecuentemente, la cámara inferior se añadió con 600 μL medio RPMI 1640 conteniendo 10% FBS mientras la superior con 200 μL suspensión celular (12,5 × 10⁴ células/mL). Incubadas 40 h, las células se tiñeron con solución de tinción violeta de cristal y se limpiaron con hisopo de algodón para contar células que pasaron a través del Matrigel bajo microscopio.

Citometría de Flujo

La apoptosis celular y distribución de ciclo celular se determinaron por citometría de flujo. La distribución de ciclo celular se evaluó por tinción con yoduro de propidio (PI). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 4 × 10⁵ células/pocillo, y se cultivaron al 70-80% de confluencia. Fijadas en etanol 70% pre-enfriado durante la noche, las células se centrifugaron (el sobrenadante se desechó), se añadieron RNAasa (1 g/L, 200 μL) y Triton X-100 (2 μL), y se tiñeron con solución de tinción PI por 30 min. Después, la distribución de ciclo celular se detectó por citómetro de flujo (BD Bioscience, NJ, EE. UU.) a 488 nm según diferentes intensidades de fluorescencia celular en cada fase (fase G0/G1, fase S, y fase G2/M). La apoptosis celular se midió por doble tinción Annexin V-fluoresceína isotiocianato (FITC) y PI. Las células se resuspendieron en 500 μL buffer de unión y se tiñeron con 5 μL solución de tinción Annexin V-FITC y 10 μL solución PI. La apoptosis celular también se probó por citómetro de flujo (BD Bioscience) dentro de 30 min sin exposición a luz. En el gráfico de dispersión, células vivas en cuadrante inferior izquierdo (Q4) fueron FITC⁻/PI⁻, células apoptóticas en etapa temprana en cuadrante inferior derecho (Q3) fueron FITC⁺/PI⁻, y células necróticas y apoptóticas en etapa tardía en cuadrante superior derecho (Q2) fueron FITC⁺/PI⁺. Tasa de apoptosis = porcentaje apoptosis temprana (Q3) + porcentaje apoptosis tardía (Q2).

Xenoinjertos Tumorales en Ratones Desnudos

El crecimiento tumoral se observó estableciendo un modelo de CNP en ratones desnudos. Desprendidas por 0,25% tripsina, células SUNE-1 y CNE2 en fase logarítmica se configuraron en suspensión celular única a 5 × 10⁷ células/mL. La suspensión celular (0,2 mL) se inyectó en la axila derecha de ratones por un microinyector para establecer modelos de ratones. Los ratones modelados se criaron en ambiente libre de patógenos específicos. Empezando desde el 4º día, el crecimiento tumoral se observó y los ratones se pesaron cada 4 días. Los ratones desnudos fueron eutanasiados el 20º día después de la inyección y los tumores se reseccionaron, pesaron por balanza electrónica y fotografiaron.

Ensayo de Gen Reportero Luciferasa Dual

El sistema de gen reportero luciferasa dual se adoptó para confirmar los sitios de unión de miR-18a y región 3' no traducida (UTR) de ARNm TGFBR3. Un sitio web de predicción biológica (https://www.microrna.org/microrna/home.do) se usó para analizar el gen objetivo de miR-18a, y descubrir la existencia del sitio de unión complementario de miR-18a en el 3'UTR de TGFBR3. El ensayo de gen reportero luciferasa dual se empleó para verificar además si TGFBR3 fue dirigido directamente por miR-18a. Un pmirGLO-TGFBR3-tipo salvaje (WT) y un pmirG-LO-TGFBR3-tipo mutante (MUT) de sitio de unión 3'UTR TGFBR3 se construyeron. TGFBR3-WT o TGFBR3-MUT y miméticos miR-18a o NC miméticos se co-transfectaron en células SUNE-1 y CNE2 por Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e incubaron 48 h. Un kit de ensayo luciferasa (Promega, Madison, WI, EE. UU.) se utilizó para analizar células.

Análisis Estadístico

El software estadístico SPSS21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.) se usó para análisis. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar. Diferencias entre dos grupos se analizaron por prueba t mientras diferencias entre múltiples grupos por análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de prueba post hoc Tukey. Una diferencia significativa se consideró en P < 0,05.

Resultados

Identificación de Macrófagos M2

Los monocitos enriquecidos por método de adherencia e inducidos por M-CSF se recolectaron de sangre periférica de donantes sanos. La detección por inmunofluorescencia de CD68, CD206 y CD163 confirmó que PBMCs inducidos por M-CSF in vitro se convirtieron en macrófagos con características moleculares típicas, que cumplieron nuestros requisitos (Fig. 1a). Los macrófagos obtenidos se polarizaron por IL-4 y se observaron bajo microscopio para morfología. Se manifestó que macrófagos (M0) sin estimulación IL-4 eran diversos e irregulares, mostrando forma redonda, ovalada o fusiforme. Estimulados por IL-4, los macrófagos M2 se volvieron más grandes y predominantemente redondos, conformes a las características morfológicas de macrófagos M2 descritas previamente (Fig. 1b). La citometría de flujo probó los antígenos superficiales de células adherentes estimuladas por 20 ng/mL IL-4 por 24 h y encontró que CD68 se expresó en 21,16% mientras CD163 en 98,69% del total de células (Fig. 1c), confirmando las células adherentes como macrófagos M2. RT-qPCR reveló que con células M0 por contraste, CCL22 y PPAR-γ (moléculas polares típicas) aumentaron en macrófagos M2 (Fig. 1d, e), indicando la inducción exitosa de macrófagos M2. RT-qPCR también manifestó que la expresión de miR-18a aumentó en macrófagos M2 en contraste a macrófagos M0 (P < 0,05) (Fig. 1f).

MiR-18a Altamente Expresado y TGFBR3 Pobremente Expresado en Células CNP

El sitio web de bioinformática (miRanda) predijo los objetivos potenciales de miR-18a y TGFBR3 fue considerado como un objetivo de miR-18a (Fig. 2a). El ensayo de gen reportero luciferasa dual se implementó para verificar que miR-18a dirigía 3'UTR de TGFBR3. TGFBR3-WT o TGFBR3-MUT se clonaron en vector pmirGLO y se co-transfectaron con miméticos miR-18a o NC en células SUNE-1 y CNE2. Los miméticos miR-18a no tuvieron influencia en la actividad luciferasa de TGFBR3 3'UTR-MUT pero deterioraron la de TGFBR3 3'UTR-WT en células SUNE-1 y CNE2, sugiriendo que TGFBR3 fue un gen objetivo regulado por miR-18a (Fig. 2b). La eficiencia de transfección de miméticos miR-18a o inhibidores miR-18a en macrófagos M2 se manifestó por determinación de expresión de miR-18a y TGFBR3 en macrófagos M2 por RT-qPCR y ensayo Western blot. Fue obvio que (Fig. 2c, d) la sobreexpresión de miR-18a elevó la expresión de miR-18a y redujo la de TGFBR3 en macrófagos M2. Opuesto, la inhibición de miR-18a redujo la expresión de miR-18a e aumentó la expresión de TGFBR en macrófagos M2. La expresión de miR-18a y TGFBR3 en líneas celulares CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 y NP96 se probó por RT-qPCR y ensayo Western blot. En células CNP, por comparación con células NP96, la expresión de miR-18a aumentó y la de TGFBR3 disminuyó (Fig. 2e). Debido a que células CNE2 y SUNE-1 manifestaron las mayores y menores diferencias en expresión de miR-18a de células NP96, se seleccionaron para los ensayos de downregulación y upregulación de miARN, respectivamente.

Para identificar los efectos de miR-18a y TGFBR3 en células CNP, células SUNE-1 se transfectaron con miméticos miR-18a o si-TGFBR3 mientras CNE2 con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3. RT-qPCR y ensayo Western blot demostraron que miméticos miR-18a elevaron expresión de miR-18a y redujeron TGFBR3 en células SUNE-1. Transfección de si-TGFBR3 no tuvo efecto en expresión de miR-18a mientras redujo TGFBR3 en células SUNE-1. Inhibidores miR-18a disminuyeron expresión de miR-18a y elevaron TGFBR3 en células CNE2. Transfección OE-TGFBR3 en células CNE2 no afectó expresión de miR-18a pero elevó TGFBR3 (Fig. 2f, g). Para explorar los efectos de miR-18a de macrófagos M2 en células CNP, macrófagos M2 transfectados con miméticos miR-18a, inhibidores miR-18a, si-TGFBR3, u OE-TGFBR3 se co-cultivaron con células SUNE-1 o CNE2 en cámara Transwell, respectivamente. RT-qPCR y ensayo Western blot probaron expresión de miR-18a y TGFBR3 en células SUNE-1 o CNE2.

MiR-18a de Macrófagos M2 Promueve Viabilidad y Capacidad de Formación de Colonias de Células CNP

Ensayo MTT y de formación de colonias se aplicaron para identificar los impactos de miR-18a y TGFBR3 en viabilidad y capacidad de formación de colonias de células SUNE-1 y CNE2. Se indicó que en células SUNE-1, la upregulación de miR-18a o downregulación de TGFBR3 mejoraron la viabilidad celular y elevaron el número de colonias (Fig. 3a, e). En células CNE2, la viabilidad celular se deterioró y el número de colonias se redujo por inhibición de miR-18a u sobreexpresión de TGFBR3 (Fig. 3b, f). Para examinar los efectos de miR-18a de macrófago M2 en viabilidad y capacidad de formación de colonias de células CNP, macrófagos M2 transfectados con miméticos miR-18a, inhibidores miR-18a, si-TGFBR3, u OE-TGFBR3 se co-cultivaron con células SUNE-1 o CNE2 en cámara Transwell. MTT y ensayo de formación de colonias mostraron que células SUNE-1 co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados, o transfetados con miméticos miR-18a o si-TGFBR3 presentaron viabilidad celular reforzada y número de colonias aumentado (Fig. 3c, g). Células CNE2 co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados se destacaron con viabilidad celular fortalecida y colonias aumentadas. Sin embargo, células CNE2 co-cultivadas con macrófagos M2 transfetados con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3 exhibieron viabilidad celular disminuida y colonias disminuidas (Fig. 3d, h).

MiR-18a de Macrófagos M2 Promueve Habilidades de Invasión y Migración de Células CNP

Para mejor comprensión de cómo miR-18a y TGFBR3 afectaron migración e invasión de células CNP, se implementaron prueba de rayado y ensayo Transwell. Los resultados revelaron que células SUNE-1 transfetadas con miméticos miR-18a o si-TGFBR3 se caracterizaron por distancia de migración celular aumentada y células de invasión (Figs. 4a y 5a). En células CNE2 transfetadas con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3, las reducciones aparecieron en distancia de migración celular y células de invasión (Figs. 4b y 5b). Cómo miR-18a de macrófagos M2 influyó habilidades de invasión y migración de células CNP se descifró por macrófagos M2 transfetados con miméticos miR-18a, inhibidores miR-18a, si-TGFBR3, u OE-TGFBR3 co-cultivando con células SUNE-1 o CNE2. Los resultados destacaron que células SUNE-1 co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados, o transfetados con miméticos miR-18a o si-TGFBR3 se manifestaron con distancia de migración celular aumentada y células de invasión (Figs. 4c y 5c). Ambas distancia de migración celular y células de invasión aumentaron en células CNE2 co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados. Al co-cultivar con macrófagos M2 transfetados con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3, células CNE2 mostraron distancia de migración reducida y células de invasión (Figs. 4d y 5d).

MiR-18a de Macrófagos M2 Arresta Menos Células CNP en Fase G0/G1 y Suprime Apoptosis

La distribución de ciclo celular y apoptosis se probaron por citometría de flujo para estratificar los efectos de miR-18a y TGFBR3 en células CNP. Se indicó que transfección de miméticos miR-18a o si-TGFBR3 redujo células SUNE-1 arrestadas en fase G0/G1, aumentó células en fases S y G2/M, y redujo tasa de apoptosis celular (Figs. 6a y 7a). Al transfectar con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3, células CNE2 en fase G0/G1 tendieron a elevación mientras aquellas en fases S y G2/M a reducción, y tasa de apoptosis celular aumentó (Figs. 6b y 7b). Con el propósito de descifrar el mecanismo de miR-18a de macrófagos M2 en distribución de ciclo celular y apoptosis de células CNP, macrófagos M2 transfetados con miméticos miR-18a, inhibidores miR-18a, si-TGFBR3, u OE-TGFBR3 se co-cultivaron con células SUNE-1 o CNE2 en cámara Transwell. Co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados, o transfetados con miméticos miR-18a o si-TGFBR3, se mostraron células SUNE-1 reducidas en fase G0/G1 y aumentadas en fases S y G2/M, y tasa de apoptosis de células SUNE-1 disminuyó (Figs. 6c y 7c). Co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados, células CNE2 en fase G0/G1 redujeron, células en fases S y G2/M aumentaron, y tasa de apoptosis declinó. Por el contrario, co-cultivadas con macrófagos M2 transfetados con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3, células CNE2 en fase G0/G1 elevaron mientras aquellas en fases S y G2/M disminuyeron, y tasa de apoptosis elevó (Figs. 6d y 7d).

MiR-18a de Macrófagos M2 Reduce p-Smad1/t-Smad1 y Eleva p-Smad3/t-Smad3 en Células CNP

El ensayo Western blot detectó proteínas relacionadas con vía de señalización TGF en células CNP para explicar más los efectos de miR-18a y TGFBR3 en vía de señalización TGF. Se explicó que transfección de miméticos miR-18a o si-TGFBR3 redujo p-Smad1/t-Smad1 y elevó p-Smad3/t-Smad3 en células SUNE-1 (Fig. 8a). La transfección con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3 llevó a p-Smad3/t-Smad3 declinado y p-Smad1/t-Smad1 aumentado en células CNE2 (Fig. 8b). MiR-18a de macrófagos M2 influyendo vía de señalización TGF en células CNP se determinó por ensayo Western blot mediante prueba de proteínas relacionadas con vía TGF en células SUNE-1 y CNE2 que co-cultivaron con macrófagos M2 transfetados con miméticos miR-18a, inhibidores miR-18a, si-TGFBR3, u OE-TGFBR3 en cámara Transwell. Células SUNE-1 co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados, transfetados con miméticos miR-18a, o si-TGFBR3 se manifestaron con p-Smad1/t-Smad1 reducido y p-Smad3/t-Smad3 incremental (Fig. 8c). Co-cultivadas con macrófagos M2 no transfetados, células CNE2 tendieron a p-Smad1/t-Smad1 declinado y p-Smad3/t-Smad3 elevado. En forma opuesta, células CNE2 se demostraron con p-Smad1/t-Smad1 aumentado y p-Smad3/t-Smad3 disminuido cuando co-cultivadas con macrófagos M2 transfetados con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3 (Fig. 8d).

MiR-18a de Macrófagos M2 Induce Crecimiento Tumoral en Ratones Desnudos con CNP

Los xenoinjertos tumorales se condujeron en ratones desnudos para dilucidar más los impactos de miR-18a y TGFBR3 en crecimiento tumoral de CNP. Se indicó que inyectados con células SUNE-1 transfetadas con miméticos miR-18a o si-TGFBR3, los ratones se manifestaron con volumen tumoral agrandado y peso tumoral más pesado (Fig. 9a). Volumen tumoral reducido y peso se presentaron en ratones con inyección de células CNE2 transfetadas con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3 (Fig. 9b). El crecimiento tumoral se observó en ratones inyectados con macrófagos M2 transfetados con miméticos miR-18a, inhibidores miR-18a, si-TGFBR3, u OE-TGFBR3 para ilustrar el mecanismo de miR-18a de macrófagos M2 en CNP. Después de co-cultivo con macrófagos M2 no transfetados, transfetados con miméticos miR-18a o si-TGFBR3, células SUNE-1 se inyectaron en ratones y se observaron con mayor volumen tumoral y peso tumoral más pesado (Fig. 9c). Células CNE2 se co-cultivaron con macrófagos M2 e inyectaron en ratones con resultados sugiriendo crecimiento de volumen tumoral y peso. Ambos volumen tumoral y peso se inclinaron a reducir cuando ratones se inyectaron con células CNE2 que co-cultivaron con macrófagos M2 transfetados con inhibidores miR-18a u OE-TGFBR3 (Fig. 9d).

Discusión

El CNP se refiere a una enfermedad poligénica amenazada por una amplia gama de factores. Los miARNs están previamente implicados en la patogénesis del CNP vía regulación de sus genes objetivo que son indicadores de procesos y vías celulares. Concretamente, miR-18a avanza la progresión del CNP por deterioro de biogénesis de miARN. Dado que este estudio avanza para descifrar las interacciones combinadas de miR-18a de macrófagos M2 y TGFBR3 en CNP con la conclusión dilucidando que miR-18a de macrófagos M2 estimula la progresión del CNP vía inhibición de TGFBR3 (Fig. 10). Al inicio de este estudio, los macrófagos son estimulados por IL-4 para diferenciar a macrófagos M2 que se encuentran enriqueciendo la expresión de miR-18a. Como sabemos, durante la polarización de macrófagos, la expresión de miARN se alteró. Además, la polarización M2 enriquece genes involucrados en ciclo celular y procesos metabólicos, y el fenotipo M2 es conducente al crecimiento tumoral y angiogénesis en tejidos neoplásicos. Basado en macrófagos M2 enriquecidos en miR-18a, una serie de experimentos se condujeron exitosamente.

Inicialmente, nuestro estudio descubrió que miR-18a está altamente expresado mientras TGFBR3 pobremente expresado en células CNP. De un estudio previo, se concluye que miR-18a está sobreexpresado en tejidos CNP con su asociación con metástasis de ganglios linfáticos y etapa clínica. Además, miembros del cluster miR-17-92 incluyendo miR-18a están documentados sobreexpresados en tejidos CNP. Además, miR-18a upregulado se reporta demostrado en tejidos CNP conectado con etapa de metástasis ganglio tumoral y tamaño tumoral. Experimentalmente, excepto por TGFBR3 downregulado en carcinoma escamoso de lengua, ha habido otro estudio describiendo TGFBR3 reducido en carcinomas renales de células claras acompañado por pronóstico no deseado. De cualquier forma, los resultados en este estudio son consistentes con estos hallazgos de estudio en cierta medida.

Para explorar los roles de miR-18a y TGFBR3 en progresión de células CNP, hemos conducido una serie de ensayos con resultados indicando que miR-18a upregulado o TGFBR3 downregulado gatilla progresión de células CNP mientras represión de miR-18a o elevación de TGFBR3 tiene efectos opuestos en células CNP. Ampliamente, supresión de miR-18a está evidenciada para obstaculizar progresión celular en malignidades incluyendo cáncer ovárico, cáncer colorrectal asociado a colitis, y carcinoma hepatocelular. Estrechamente, un estudio existente ha pronunciado que miR-18a upregulado promueve progresión de células CNP vía mediación de DICER1. Además, se nota que miR-18a sobreexpresado en CNP se cree conectado con metástasis CNP y miR-18a reprimido contribuye parcialmente a mejor pronóstico de pacientes CNP. Recientemente, se encuestó que downregulación de miR-18a es capaz de desalentar proliferación, invasión y migración CNP. Adicionalmente, una disminución en expresión TGFBR3 se considera vinculada con invasión de carcinoma escamoso laríngeo (CEL) y regulación de eje miR-223/TGFBR3 participa en inhibición de progresión CEL. La elevación de TGFBR3 está documentada para restringir viabilidad de células CNP, inducir apoptosis, y activar vías de señalización pro-apoptosis. Previamente, un estudio indicó que upregulación de TGFBR3 promueve apoptosis y células arrestadas en fase G2/M, resultando en viabilidad celular y migración deterioradas en carcinoma quístico adenoide de glándula salival. Intrigantemente, se describió anteriormente que inducción de TGFBR3 contribuye a interrumpir progresión de colangiocarcinoma intrahepático.

A pesar del papel protector de miR-18a pobremente expresado y TGFBR3 sobreexpresado en células CNP in vitro, hemos realizado xenoinjertos tumorales en ratones desnudos in vivo para verificación adicional con resultados explicando que knockdown de miR-18a o elevación de TGFBR3 restringe crecimiento tumoral en ratones desnudos. Como se demostró en un estudio previo, ratones desnudos inyectados con miR-18a muestran crecimiento tumoral mejorado y, por el contrario, ratones desnudos inyectados con antagomir miR-18a se muestran con crecimiento tumoral suprimido en CNP. En la luz de la reducción de TGFBR3 en crecimiento tumoral, se sugiere que TGFBR3 pobremente expresado provoca formación tumoral en carcinoma renal de células claras. En forma opuesta, un aumento en TGFBR3 es reconocido para obstaculizar crecimiento tumoral en cáncer de pulmón con presencia de ARN largo no codificante ADAM metalopeptidasa con tipo trombospondina 1 motivo, 9 ARN antisenso 2 elevación, y supresión miR-223-3p. Este estudio también predijo y verificó que TGFBR3 es un gen objetivo de miR-18a. Pero, más estudios aún necesitan conducirse para verificación adicional.

Conclusión

En general, este estudio elabora los mecanismos concretos que miR-18a de macrófagos M2 inhibe expresión de TGFBR3 para exacerbar la progresión del CNP vía vía de señalización TGF-β, los resultados de los cuales son abrogados por knockdown de miR-18a o elevación de TGFBR3. Este estudio actualiza el objetivo terapéutico para CNP. Sin embargo, investigaciones de gran cohorte aún son necesarias para exploraciones en profundidad.