Promoción del crecimiento celular SH-SY5Y mediante nanopartículas de oro modificadas con 6-mercaptopurina y un péptido penetrante de neuronas

Métodos / Experimental

Síntesis del conjugado 6MP-AuNPs-RDP

Las AuNP recubiertas de citrato con un tamaño de 20 nm se sintetizaron mediante el método de reducción. Brevemente, una solución acuosa de HAuCl ₄ · 3H ₂ Se calentó O (100 ml, 0,01%) con agitación vigorosa durante 30 min, luego se añadió rápidamente una solución de citrato sódico (10 ml, 38,8 mM) al HAuCl ₄ solución. La mezcla se calentó a reflujo durante otros 30 minutos, hasta que se obtuvo una solución de color rojo oscuro, y se enfrió a temperatura ambiente de forma natural.

Se prepararon 6MP-AuNP mediante la mezcla de AuNP (0,33 mM) y una solución de 6MP (concentración final 0,046 nM) durante 5 horas a temperatura ambiente de acuerdo con un informe anterior [12]. Luego, la mezcla se centrifugó a 17.000 g durante 30 min. Posteriormente, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento (6MP-AuNP) y se lavó con agua desionizada tres veces.

Para obtener 6MP-AuNP modificadas con RDP, se añadió simultáneamente RDP (FAM con CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC; sintetizado por Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) y 6MP, con una concentración final respectiva de 0,023 nM, a la solución de AuNP (0,33 mM) durante 5 hy luego se centrifuga a 17.000 g durante 30 min. Como control, se sintetizó un péptido codificado con FAM (FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC) (Shanghai Ji’er Biotech. Co., China) y se preparó en paralelo 6MP-AuNPs-SP-FAM. Posteriormente, se descartó el sobrenadante de las partículas y las partículas se lavaron respectivamente con agua desionizada. Las soluciones de partículas se ajustaron respectivamente a pH 9,0 con NaOH 0,1 M y luego se pasaron a través de filtros de jeringa de 0,22 μm y se almacenaron a 4 ° C para su uso.

Características de las partículas

Los espectros de absorción se midieron a temperatura ambiente con un espectrofotómetro UV / vis (UV-2450, Shimadzu Corp, Kyoto, Japón) para detectar la absorción óptica de las partículas. El tamaño de partícula y el potencial zeta de las partículas se midieron respectivamente usando un aparato de dispersión dinámica de luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS; Malvern) después de la dilución con agua desionizada. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM; Shimadzu) para observar la estructura de las partículas.

Cultivo celular

Las células SH-SY5Y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio F-12 con una proporción de 1:1. Los medios se suplementaron respectivamente con suero de ternero fetal (FCS) al 10%, 100 unidades / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO ₂ en una incubadora humidificada (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Todos los reactivos para cultivo celular se adquirieron en HyClone (EE. UU.).

Captación de celda

Se sembraron células SH-SY5Y en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁴ células / pocillo. Cuando la confluencia celular alcanzó el 60%, se agregaron respectivamente 6MP-AuNPs-RDP y 6MP-AuNPs-SP marcados con FAM de concentración final 0,25 μg / ml al medio celular para una incubación de 2 h. Luego, los medios celulares se descartaron y se reemplazaron con medios nuevos. Las células se observaron y fotografiaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus, Japón).

Impacto de 6MP-AuNPs-RDP en el crecimiento neuronal

Se sembraron células SH-SY5Y en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁵ células / pocillo durante la noche. Luego, se agregaron RDP-6MP-AuNP con diferentes concentraciones (0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 μg / mL), respectivamente, al medio para una incubación de 24 h. El número de células se contó utilizando un contador de células automático (Bio-Rad, EE. UU.).

Además, la actividad metabólica celular se midió mediante el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) de acuerdo con el informe anterior [13]. Brevemente, las células SH-SY5Y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁴ células / pocillo y se incubaron en un medio que contenía FBS al 10% durante la noche. Luego, las partículas se agregaron respectivamente al medio durante 24 h. Las células se lavaron con PBS tres veces, luego se agregaron 100 μL de medio fresco y 10 μL de MTT (5 mg / mL en tampón PBS) a cada pocillo. Después de una incubación de 4 h, se retiraron los medios y se añadieron 200 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver el formazán producido. La absorbancia del sobrenadante se midió a 490 nm usando un lector de microplacas (Bio-Rad, EE. UU.). Las células sin ninguna adición se utilizan como blanco, y las células con solo disolvente (NaOH 0,1 M (pH 9,0) se ajustaron a pH 7,4 con HCl 0,1 M) como control. La actividad metabólica celular relativa se calculó como actividad metabólica (%) =DO ₄₉₀ (blanco de muestra) / OD ₄₉₀ (control-blanco). Cada valor se promedió a partir de cuatro experimentos independientes.

Para determinar el efecto de 6MP-AuNPs-RDP sobre el crecimiento de neuritas, se trasplantaron células SH-SY5Y en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia del 30%. Luego, las células se trataron con 6MP-AuNPs-RDP (0,25 μg / ml) una vez al día durante 3 días. Las longitudes de las neuritas se observaron bajo un microscopio óptico (Olympus, Japón) y se calcularon utilizando un software ImageJ [14].

Proliferación celular en la superficie recubierta con 6MP-AuNPs-RDP

Se sembraron en placa 6MP-AuNPs-RDP de manera homogénea en el fondo de placas de cultivo de 3,5 cm de diámetro, luego las células se trasplantaron sobre las placas revestidas con partículas. Después de la incubación, las células se observaron al microscopio óptico y se contó la longitud de las neuritas. Las células con solo disolvente se utilizaron como control. Cada experimento se repitió cuatro veces independientes y se promediaron 200 neuritas para calcular la longitud de las neuritas.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± SEM. Los datos se analizaron con un programa informático mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de la prueba de rango múltiple de Dunnett, con el software SPSS 13.0. Diferencias con p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Apariencia y características de las nanopartículas

La solución acuosa de AuNP mostró un color escarlata bajo luz visible (Fig. 2a, 0 s). Después de la adición de 6MP, el color se oscureció gradualmente cuando se conjugó 6MP con AuNP y, finalmente, apareció una precipitación azul-negra de 6MP-AuNP después de 5 h de reacción. La precipitación se pudo resolver ajustando el pH a 9,0 y, en ese momento, la solución acuosa de 6MP-AuNP mostró un color rosa. La precipitación se volvería a formar cuando el pH se ajustara a pH 7,4.

Proceso de reacción y características de las nanopartículas. un Proceso de reacción para la preparación de 6MP-AuNP. Después de añadir 6MP a la solución de AuNP, el color de la solución cambió y la precipitación se formó gradualmente en 5 h. b La precipitación de 6MP-AuNPs-RDP se disolvió cuando el pH se ajustó a 9,0 con NaOH 0,1 M. c Medición DLS de la distribución de tamaño de las partículas. d Potencial zeta de AuNPs, 6MP-AuNPs y 6MP-AuNPs-RDP. e Estructuras de partículas bajo TEM

Se preparó 6MP-AuNPs-RDP conjugando las AuNP con grupos tiol de 6MP o RDP a pH 9,0. La solución acuosa de 6MP-AuNPs-RDP mostró el mismo color rosa que el de la solución de 6MP-AuNP (Fig. 2b). Cuando el pH de la solución de 6MP-AuNPs-RDP se ajustó a 7,4, las partículas precipitaron en el fondo de la solución.

El tamaño y el potencial zeta de la solución 6MP-AuNPs y 6MP-AuNPs-RDP (pH 9,0) se examinaron respectivamente mediante DLS (Fig. 2c). Los datos mostraron que el tamaño medio de 6MP-AuNPs-RDP era ligeramente mayor que el de 6MP-AuNPs (24,6 frente a 20,5 nm), mientras que el potencial zeta del primero era significativamente mayor que el del segundo (- 25,8 frente a - 37,2 mV), lo que sugiere que el RDP catiónico aumentó el potencial de superficie de la partícula. Las imágenes TEM mostraron que ambas nanopartículas tenían forma esférica (Fig. 2d).

Captación celular de las nanopartículas

Cuando las soluciones de partículas se ajustaron a pH 7,4 y se agregaron al medio celular, las partículas comenzaron a agregarse y se hundieron gradualmente hasta el fondo de los pocillos. Sin embargo, 30 minutos más tarde, apareció una placa en blanco obvia alrededor de las células, y el espacio de las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP tenía menos agregación de partículas que el de 6MP-AuNPs (Fig. 3a). Además, se observaron más nanopartículas dentro de las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP en comparación con las células tratadas con 6MP-AuNPs.

Captación celular de las nanopartículas. un Las soluciones de 6MP-AuNPs y 6MP-AuNPs-RDP de 0,25 μg / ml se ajustaron respectivamente a pH 7,4 y se añadieron al medio celular para una incubación de 30 min. Las partículas se internalizaron en células SH-SY5Y o se precipitaron en el fondo de los pocillos. b Diagrama esquemático de AuNP modificado con péptido marcado con 6MP y marcado con fluorescencia. Después de que las células SH-SY5Y se incubaron con las partículas durante 2 h, se tomaron imágenes ( c ) e intensidad de fluorescencia ( d ) fue medido. Los datos se presentan como media ± SEM. Los valores se promediaron para cuatro experimentos independientes. ^** p <0,01 en comparación con las células tratadas con 6MP-AuNPs-SP

Para identificar adicionalmente que las partículas podrían entrar en las células neuronales, se conjugaron péptidos marcados con fluorescencia con las partículas (Fig. 3b). Después de 2 h de incubar las células con estas nanopartículas, se observó una fuerte fluorescencia en las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP, mientras que una fluorescencia verde relativamente débil fue visible en las células tratadas con 6MP-AuNPs-SP. (Figura 3c). El resultado de la medición de la intensidad de la fluorescencia con el espectrómetro de fluorescencia (Hitachi Ltd. Co. Tokio, Japón) mostró que las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP tenían una intensidad de fluorescencia significativamente mayor que la de las células tratadas con 6MP-AuNPs-SP (Fig. 3d ), lo que sugiere que el RDP, un tipo de péptidos que penetran en las células (CPP), podría aumentar la eficiencia de absorción celular de la partícula.

Efectos de las nanopartículas en el crecimiento neuronal

Para examinar si las partículas tenían efectos sobre el crecimiento neuronal, se utilizaron tanto el ensayo MTT como el recuento celular para medir la actividad metabólica celular y el número después de la incubación de las células con las partículas durante 24 h. Los resultados indicaron que RDP solo no afectó el crecimiento celular, mientras que 6MP-AuNPs-RDP y 6MP-AuNPs en la concentración respectiva por encima de 0,125 y 0,5 μg / ml, aumentaron la actividad metabólica celular y el número de células de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4a, b). Además, las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP mostraron una mayor actividad metabólica que las células tratadas con 6MP-AuNPs, lo que probablemente se relacionó con la mayor eficiencia de penetración celular de 6MP-AuNPs-RDP que 6MP-AuNPs.

Las partículas aumentaron la actividad metabólica celular ( a ) y números ( b ), y la concentración de 6MP-AuNPs y 6MP-AuNPs-RDP varió de 0 a 1.0 μg / mL Los datos se presentan como media ± SEM. Las células con solo disolvente {0,1 M NaOH (pH 9,0) se ajusta a pH 7,4 con 0,1 M HCl} se utilizaron como control. Los valores se promediaron para cuatro experimentos independientes. ^* p <0.05, ^** p <0.01 en comparación con las células tratadas con RDP, ^# p <0.05 y ^## p <0.01 en comparación con las células tratadas con 6MP-AuNPs

Efectos de las nanopartículas en la longitud de las neuritas

Además de que las partículas podrían aumentar la actividad metabólica celular, también se observó el impacto de las partículas en la longitud de las neuritas a una alta concentración (1 μg / mL) de las partículas. Las imágenes (Fig. 5a) mostraron que las nanopartículas agregadas se asentaron en el fondo de los pocillos y apareció un área de placa en blanco más grande alrededor de las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP.

Las nanopartículas promovieron el crecimiento de neuritas. Imágenes ( a ) y longitud de neuritas ( b ) después de que las células se trataron respectivamente con RDP, 6MP-AuNPs y 6MP-AuNPs-RDP durante 24 h. Las células con solo disolvente se utilizaron como control. Los valores se promediaron para 200 neuritas. ^* p <0.05 y ^** p <0.01 en comparación con el control

Después de la incubación de 24 h, los resultados mostraron que las células tratadas con las partículas tenían neuritas más largas que las células de control, mientras que no hubo diferencias significativas entre las células tratadas con RDP y las de control. Además, la neuritis de las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP fue notablemente más prolongada que la de las células tratadas con 6MP-AuNPs (Fig. 5b).

A partir del resultado de la Fig. 5, 6MP mató a todas las células SH-SY5Y debido a su citotoxicidad; por lo tanto, no usamos 6MP para recubrir la placa. Además, como se muestra en las Figs. 3, 4 y 5, una cantidad relativamente pequeña de 6MP-AuNP entraron en las células, y tanto la longitud de neuritas como el número de células fueron obviamente menores que 6MP-AuNPs-RDP. Por lo tanto, se eligió 6MP-AuNPs-RDP para el estudio adicional a fin de examinar el efecto sobre el crecimiento celular.

Proliferación celular y crecimiento de neuritas después de la administración repetida de 6MP-AuNPs-RDP

Para identificar aún más los resultados de 6MP-AuNPs-RDP sobre la proliferación celular y el crecimiento de neuritas, se agregaron 6MP-AuNPs-RDP al medio celular tres veces los días 1, 2 y 3 después de cultivar las células en placas de 6 pocillos (día 0). Los resultados mostraron que la longitud de las neuritas de las células tratadas con partículas se volvió obviamente más larga que la del control (Fig. 6a, b), y la actividad metabólica celular aumentó cuando las células se trataron con las partículas (Fig. 6c).

La nanopartícula indujo la proliferación celular y el crecimiento de neuritas. un imágenes de celda en los días 1, 2, 3 y 4. b Longitudes de neuritas de células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP y el control. Los valores se promediaron para 200 neuritas. ^** p <0,01 en comparación con el control. c Actividad metabólica de células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP. Las células recibieron tratamiento tres veces al día durante 3 días. La primera vez, se añadió 6MP-AuNPs-RDP al medio celular después de que las células se cultivaron durante 24 h desde el trasplante celular. Cada concentración de partículas fue de 0,25 μg / mL. d Imágenes del crecimiento de neuritas de las células sobre el recubrimiento superficial con 6MP-AuNPs-RDP. Se sembró en placa 6MP-AuNPs-RDP en el fondo de placas de cultivo de 3,5 cm de diámetro, y luego, las células se trasplantaron sobre las placas. e La longitud de las neuritas se midió a los 0 ~ 3 días. Las células con solo disolvente se utilizaron como control. Los valores se promediaron para 200 neuritas. ^** p <0.01 en comparación con el control, ^* p <0.05, ^** p <0.01 en comparación con las células del día 1. La flecha azul apunta a las neuritas representativas

Para examinar el efecto de 6MP-AuNPs-RDP sobre el crecimiento de neuritas cuando la partícula se usó como material de revestimiento de superficie, el fondo de las placas de cultivo se recubrió con 6MP-AuNPs-RDP y luego, las células se trasplantaron sobre los recubrimientos. Las imágenes mostraron que las partículas se adhirieron rápidamente a la membrana celular (Fig. 6d), luego las partículas se internalizaron y distribuyeron en todas las células, incluido el citoplasma, la membrana del núcleo y el núcleo celular. Los resultados también mostraron que las células tratadas con partículas tenían neuritas significativamente más largas que el control (Fig. 6e).

Efectos de la nanopartícula en el crecimiento celular después del almacenamiento congelado

Para examinar la tolerancia celular a las partículas e identificar si las células mantenían la capacidad proliferativa después del estado de crecimiento desprendido, las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP se congelaron y almacenaron durante varios días cuando alcanzaron la fase de crecimiento exponencial. Luego, las células se recuperaron y cultivaron en placas de 24 pocillos (Fig. 7a). Los resultados mostraron que el número de células tratadas con partículas aumentó significativamente y las neuritas se hicieron más largas que el control (Fig.7b, c), lo que sugiere que el crecimiento de las células tratadas con partículas no podría verse afectado por un proceso de congelación y recuperación. .

La nanopartícula aumentó la longitud de las neuritas y el número de células después del almacenamiento en congelación. ( a ) Las células se trataron con 6MP-AuNPs-RDP (1,0 µg / ml) antes del almacenamiento, y las células se recuperaron y continuaron en cultivo durante 3 días. Longitud de la neurita ( b ) y números de celda ( c ) de las células tratadas con 6MP-AuNPs-RDP aumentaron significativamente después del almacenamiento. Las células con solo disolvente se utilizaron como control. Los datos se presentan como media ± SEM. ^** p <0,01 en comparación con el control. La flecha azul apunta a las neuritas representativas

Discusión

Las AuNP han mostrado un gran potencial de aplicaciones en diversos campos de la química, la física, los materiales, la biología, la medicina y áreas interdisciplinarias relacionadas. Para estabilizar la estructura de las AuNP, se utilizaron con mayor frecuencia ligandos modificados con tiol como agentes estabilizantes que podrían unirse a la superficie de las AuNP mediante la formación de enlaces Au-S. En el estudio, los grupos tiol de 6MP y RDP se conjugaron con la superficie de AuNP, y la estructura de las partículas era estable y podría usarse para estudios adicionales.

Como se puede ver en los resultados, las partículas poseían una propiedad ácido-base obvia, que estaba relacionada con la disociación del grupo N (9) -H de la molécula 6MP que tuvo lugar en un rango de pH de 10,4 ~ 11,2 en solución, y la agregación se produjo cuando el valor de pH de la solución de 6MP-AuNP estaba por debajo de 6. La protonación de N9 de la molécula de 6MP neutralizó las 6MP-AuNP con un valor de pH inferior a 6, y luego, las interacciones intermoleculares (interacciones de apilamiento de bases) se volvieron muy fuertes y compensadas la repulsión electrostática. Después de la modificación de RDP, las partículas mostraron un comportamiento ácido-base más complejo porque el pI de tiol-RDP era aproximadamente 11,5 además de la propiedad ácido-base de las 6MP-AuNP. A partir de la titulación, el valor pI de 6MP-AuNPs-RDP fue de 7,8, cercano a la condición fisiológica (pH 7,4). Por lo tanto, 6MP-AuNPs-RDP y 6MP-AuNPs podrían precipitar de los medios celulares.

En este estudio, identificamos que RDP mejoró la captación celular de 6MP-AuNP, lo que fue consistente con los estudios anteriores. Se sabe comúnmente que el RDP es un péptido largo que consta de 39 aminoácidos, que se deriva de la glicoproteína del virus de la rabia que tiene la capacidad de transportar macromoléculas extrañas al interior de las células neuronales [15, 16]. En nuestro estudio anterior, la eficiencia de absorción celular de los nanoclusters de oro mejoró significativamente cuando los nanoclusters se conjugaron con RDP [17]. El mecanismo de penetración de RDP en las células puede estar asociado con la endocitosis mediada por el receptor del ácido γ-aminobutírico (GABA) de la membrana celular neural o por el receptor nicotínico de acetilcolina [18, 19].

El estudio también sugirió un efecto opuesto de 6MP-AuNPs-RDP en relación con 6MP que 6MP-AuNPs-RDP promovió la proliferación celular y el crecimiento de neuritas, mostrando una obvia actividad neurófica. El mecanismo de esta diferencia distintiva de 6MP-AuNPs-RDP y 6MP podría estar asociado con la estructura química de 6MP (un derivado de purina del grupo tiol C6) [20]. En la superficie de 6MP-AuNPs-RDP, el grupo tiol de 6MP participó en la unión con AuNP y, por tanto, se bloqueó. Por tanto, el grupo purina quedó expuesto en la superficie de la partícula. Está bien aceptado que la purina desempeña un papel vital en la promoción del crecimiento neuronal (como la diferenciación celular, la formación y extensión de neuritas, la sinaptogénesis) a través de vías de señalización purinérgicas intracelulares [21, 22], incluida la proteína quinasa activada por mitógenos / proteína regulada por señales extracelulares cinasa (MAPK / ERK) y fosfatidilinositol 3-cinasa / serina-treonina cinasa Akt (PI3K / Akt) rutas (las mismas rutas inducibles por neurotrofinas y citocinas) [23]. Por lo tanto, la purina de 6MP-AuNPs-RDP podría estar contribuyendo a los efectos de la proliferación celular y el crecimiento de neuritas.

Cabe señalar que las células SH-SY5Y mostraron una buena tolerancia excelente al 6MP-AuNPs-RDP. Cuando las células tratadas con partículas recibieron la administración repetida de las partículas o se recuperaron del almacenamiento congelado, incluso cuando las células crecieron en la superficie cubierta con las partículas, aún mantienen la actividad proliferativa, lo que sugiere que el 6MP-AuNPs-RDP debería tener el potencial de aplicación.

Conclusiones

Aquí, sugerimos que las AuNP modificadas con 6MP y RDP podrían promover eficazmente la proliferación celular y el crecimiento de neuritas. Debido a la excelente biocompatibilidad y bioseguridad de las nanopartículas, son un biomaterial prometedor que se puede utilizar como nanomaterial neurófico para el crecimiento neuronal.

Abreviaturas

6MP:

6-mercaptopurina

ANUNCIO:

Enfermedad de Alzheimer

AuNPs:

Nanopartículas de oro

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

DMSO:

Dimetilsulfóxido

FCS:

Suero de ternero fetal

MTT:

Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio

PD:

Enfermedad de Parkinson

RDP:

Péptido derivado del virus de la rabia

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

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