Nanopartículas de oro de forma redonda:efecto del tamaño de partícula y la concentración sobre el crecimiento de la raíz de Arabidopsis thaliana

Resumen

Hoy en día, debido a una amplia gama de aplicaciones de nanopartículas (NP) en muchas áreas industriales, las acumulaciones de esas entidades en el medio ambiente representan un gran riesgo. Debido a su inercia, los NP de metales nobles pueden permanecer en suelos contaminados casi sin cambios durante mucho tiempo. En este contexto, la absorción de partículas dependiente del tamaño, la forma y la concentración por las plantas pertenece a un área inexplorada. En este trabajo, presentamos soluciones de agua de AuNP esféricos sintetizados biológicamente amigables con una distribución de tamaño bastante estrecha en un rango de tamaño de 10 a 18 nm. Su completa caracterización por espectroscopia de absorción atómica, plasma acoplado inductivamente equipado con espectroscopia de masas, dispersión dinámica de luz (DLS) y métodos TEM fue seguida por el estudio de su efecto sobre el crecimiento de Arabidopsis thaliana (raíces primarias y laterales), en función del tamaño de las partículas y de la concentración. Debido a la forma estrictamente redonda de los AuNP y la ausencia de aglomeración de partículas, el tamaño derivado de DLS y la distribución del tamaño estaban en buena concordancia con los obtenidos a partir de TEM. La longitud y el número de A. thaliana las raíces laterales se vieron afectadas significativamente por todos los tipos de AuNP. Los AuNP más pequeños en la concentración más alta inhibieron la longitud de las raíces primarias y, en contraste, mejoraron el crecimiento de las raíces del cabello.

Antecedentes

Hoy en día, la química y la ingeniería modernas producen grandes cantidades de nanoobjetos para mejorar las propiedades de utilidad de la materia, no solo en aplicaciones especiales, sino cada vez más en productos de consumo diario. Los materiales nanoestructurados, es decir, nanopartículas [1, 2], nanobarras [3], nanotubos [4], nanotextiles no tejidos [5], tal como están o adheridos a diferentes tipos de soportes, aumentan significativamente los rendimientos en casi todas las áreas de aplicaciones industriales que van desde la cosmética [6] y el cuidado de la salud [7], pasando por la bioingeniería [8, 9], hasta las aplicaciones de conversión de energía [10] y los catalizadores [3]. Si bien la inclusión de nanomateriales en estos productos puede mejorar su rendimiento, su descomposición al final de su vida útil proporciona varios puntos clave de entrada para los NP sintéticos en el medio ambiente. Los NP especialmente diseñados, que se han utilizado ampliamente en catalizadores, estabilizadores de colorantes protectores de UV, agentes antimicrobianos en la industria textil o productos para el cuidado de la salud y cosméticos (en particular, los de alta inercia química como Au, Ag, Pt y Pd) deben Se debe prestar especial atención, ya que pueden acumularse en el medio ambiente casi sin cambios durante muchos años, desencadenando procesos hasta ahora desconocidos sobre su absorción por las plantas. En cuanto a las nanopartículas de metales nobles (NMNP), se han publicado algunos trabajos pioneros sobre el efecto de las nanopartículas de plata (AgNP) en las plántulas de thale berro ( Arabidopsis thaliana ), lo que indica que concentraciones muy bajas de AgNP (<1 ppm) podrían ser tóxicas para las plántulas [11]. Los AgNP de 20 a 80 nm claramente atrofian el crecimiento y su fitotoxicidad depende de la concentración y del tamaño de partícula. Se observó que la punta de la raíz (sombrero y columela) se volvió marrón claro cuando las raíces primarias se expusieron a los AgNP. La punta marrón se atribuyó a la adsorción de AgNP, ya sea en sí mismo o junto con materiales de la pared celular o metabolitos secundarios producidos por las puntas de las raíces. Sin embargo, el mecanismo exacto aún no se ha aclarado.

Aunque se han realizado algunos estudios que abordan el papel de las NP en el medio ambiente [12], los que se dirigen a las nanopartículas de oro (AuNP) siguen siendo raros [13]. Si están disponibles, la mayoría de los datos publicados sobre nanotoxicología se han centrado en la citotoxicidad en mamíferos [14,15,16] o los impactos en animales y bacterias [17,18,19,20], y solo unos pocos estudios han considerado la toxicidad de los NP a plantas. Además, la interacción de los NMNP con plantas y otros organismos que comparten similitudes con las células vegetales, como las algas, ha sido poco estudiada hasta ahora, lo que implica que las consecuencias generales de la exposición a los NMNP para las células vegetales aún no están claras [11]. La falta de estos datos conduce a una comprensión deficiente de cómo se transfieren y acumulan los PNNM en los distintos niveles de la cadena alimentaria.

En este trabajo, informamos sobre el efecto de las nanopartículas de oro en el crecimiento de las plantas, particularmente en el desarrollo de raíces primarias y laterales de A. thaliana en presencia de partículas de diferentes tamaños. Las AuNP se sintetizaron por método húmedo bajo un protocolo biológicamente amigable sin estabilizadores, produciendo nanopartículas esféricas con un control preciso sobre su tamaño y distribución de tamaño. Antes del tratamiento de la planta, las AuNP se caracterizaban minuciosamente mediante un amplio espectro de métodos analíticos (AAS, ICP-MS, DLS y TEM).

Experimental

Materiales, aparatos y procedimientos

Las nanopartículas de oro se sintetizaron mediante un procedimiento ligeramente adaptado publicado por Batús et al. [20]. Brevemente, se calentó 149 ml de agua en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 250 ml hasta que comenzó a refluir. A continuación, se añadieron posteriormente 1 mL de citrato de sodio 0,33 M y 0,945 mL de tetracloroaurato de potasio (III) 10 mg / mL en agua. Después de 30 min, se detuvo el calentamiento y se dejó enfriar la mezcla de reacción. En todos los experimentos de preparación, se utilizó agua Milli-Q (18,2 MΩ a 25 ° C).

Para ensayos de raíces de A. thaliana , AuNP sintetizados de tres tamaños diferentes (10, 14 y 18 nm) se centrifugaron a 5000 g durante 1 h para aumentar la concentración de partículas hasta el valor límite de 2000 mg / L.

A. thaliana Las semillas de Columbia (Col-0) (obtenidas de Lehle Seeds, EE. UU.) Se esterilizaron en la superficie con un 30% ( v / v ) solución de lejía durante 10 min y enjuagar cinco veces con agua esterilizada. Se sembraron semillas estériles en placas de agar que contenían medio Murashige-Skoog (MS) y agar vegetal al 1% (pH 5,8). Para sincronizar la germinación de las semillas, las placas de agar se mantuvieron a 4 ° C durante 2 días. A. thaliana las plantas se cultivaron durante 5 días en placas orientadas verticalmente en una cámara de crecimiento a 22 ° C con 100 μmol m ^{- 2} s ^{- 1} intensidad de la luz en condiciones de días largos (ciclo de luz / oscuridad de 16 h / 8 h).

Se transfirieron plántulas de cinco días de tamaño similar a placas de agar (20 plantas por placa) que contenían medio MS 1/16, diferentes concentraciones de AuNP (0, 1, 10 y 100 mg / L) y agar vegetal al 1% ( pH 5,8). Se añadieron AuNP al medio después del autoclave. Como control, también se investigó el efecto del tampón de citrato de sodio. Se marcó la longitud de la raíz y se cultivaron plántulas durante los siguientes 5 días. Tanto el incremento de la raíz primaria como la longitud de las raíces laterales se midieron utilizando el software JMicroVision 1.2.7.

Métodos analíticos

Las soluciones preparadas de AuNP se caracterizaron por espectroscopía de absorción atómica (AAS), plasma acoplado inductivamente equipado con espectroscopía de masas (ICP-MS), dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Las concentraciones de NP preparadas se determinaron mediante AAS mediante un dispositivo VarianAA880 (Varian Inc., EE. UU.) Utilizando un atomizador de llama a una longitud de onda de 242,8 nm. La incertidumbre típica de la concentración determinada por este método es inferior al 3%.

Se usó plasma acoplado inductivamente con detector de espectroscopía de masas (ICP-MS) para determinar la concentración de iones de Au que se originan a partir de una fuente química de Au sin reaccionar, usando un espectrómetro de triple cuadrupolo Agilent 8800 (Agilent Technologies, Japón) conectado a un muestreador automático. La solución coloide de AuNP se pipeteó en microtubos hidrófobos de 1,5 ml y se centrifugó a 30000 g en la centrífuga Eppendorf 5430 durante 1 h. Después de la centrifugación, se retiraron cuidadosamente 0,3 ml de sobrenadante utilizando una pipeta y se analizó ICP-MS. La nebulización de la muestra se realizó utilizando un dispositivo MicroMist equipado con una bomba peristáltica. Se utilizó una solución tampón pura (citrato de sodio 2,2 mM) como muestra en blanco. La incertidumbre de la medición fue inferior al 3%.

Las imágenes TEM se midieron usando JEOL JEM-1010 (JEOL Ltd., Japón) operado a 400 kV. Se colocó una gota de solución coloidal sobre una rejilla de cobre revestida con una fina película de carbón amorfo sobre un papel de filtro. Se eliminó el exceso de disolvente. Las muestras se secaron al aire y se mantuvieron al vacío en un desecador antes de colocarlas en un portamuestras. El tamaño de las partículas se midió a partir de las micrografías TEM y se calculó teniendo en cuenta al menos 500 partículas.

La distribución del tamaño de partículas fue determinada por Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Inglaterra) en el régimen DLS para la distribución del tamaño de partículas, equipado con un fotodiodo de avalancha para la detección de señales. Se utilizó un láser de estado sólido bombeado por diodos (50 mW, 532 nm) como fuente de luz. Las medidas se realizaron en cubetas de poliestireno a temperatura ambiente.

Resultados y discusión

Caracterización de nanopartículas

El tamaño y la distribución del tamaño de las AuNP se determinaron mediante análisis TEM y DLS. Los resultados se resumen en la Tabla 1, junto con las concentraciones de AuNP determinadas por AAS inmediatamente después de la síntesis de NP y las concentraciones de iones de Au residuales determinadas por ICP-MS. A partir de estos datos, es evidente que nuestro protocolo de síntesis proporciona nanopartículas de Au bien controladas por tamaño con una distribución de tamaño bastante estrecha. Aquí, utilizamos el método modificado publicado por Batús et al. [20] para la síntesis de AuNP estabilizados con citrato de tamaño y forma controlados. El protocolo desarrollado permite una extensión de tamaño específica basada en la ampliación de AuNPs pre-sintetizados por medio de la reducción catalizada por la superficie de Au ³⁺ junto con una inhibición simultánea eficaz de la nucleación secundaria.

Wang y col. [21] encontró que durante una exposición hidropónica de 3 días de A. thaliana a Ag ⁺ y AgNP (5 nm) a la misma concentración, la concentración de Ag disminuyó más rápidamente en el Ag ⁺ solución tratada que en la de AgNP, lo que indica una absorción más rápida de Ag ⁺ iones. Por lo tanto, prestamos especial atención a minimizar el posible efecto de los iones Au en la distorsión del resultado. Las AuNP sintetizadas se centrifugaron hasta una concentración límite de 2000 mg / L y se diluyeron con medio MS a las concentraciones requeridas (1, 10 y 100 mg / L). Después de este procedimiento, la concentración de iones de Au residuales en soluciones que contienen 100 mg / L de AuNP se determinó mediante ICP-MS (ver Tabla 1). Aparentemente, la centrifugación tuvo un efecto positivo tanto en la presencia de iones de Au residuales cuyas concentraciones se redujeron en dos órdenes de magnitud en comparación con las soluciones tal como se sintetizaron (Tabla 1, AAS) como en el contenido de tampón de citrato en sí.

Para cuantificar la polidispersidad NP, realizamos la medición DLS, que es muy sensible a la presencia de conglomerados de partículas eventualmente formados (Fig. 1). En esta medición, incluso una pequeña cantidad de NP aglomeradas provoca el predominio del pico correspondiente en diámetros considerablemente más altos, especialmente en la distribución de tamaño ponderada por intensidad (ver recuadro en la Fig. 1). Afortunadamente, no se detectó aglomeración de partículas y, por lo tanto, la credibilidad de la evaluación del tamaño puede verse afectada solo por la aproximación esférica [22]. A pesar de esta desventaja, la medición DLS proporciona una imagen general estadísticamente más significativa de la distribución del tamaño de partículas en comparación con TEM, ya que evalúa todo el volumen de la muestra de una vez. Debido a la naturaleza predominantemente redonda de los NP preparados (ver Fig. 2), los tamaños derivados de DLS estaban en buen acuerdo con los obtenidos por TEM (Tabla 1). Los aglomerados de partículas aparentes, visibles en la imagen de TEM (Fig. 2, 10 nm), probablemente fueron causados por la necesidad de eliminar el solvente en las mediciones de TEM, en lugar de la interconexión de partículas individuales en la solución coloide en sí.

Análisis dinámico de dispersión de luz (distribución de tamaño ponderada en número) de soluciones acuosas de AuNP de diferentes tamaños. El recuadro muestra datos ponderados por intensidad "sin procesar". Los números se refieren al diámetro medio de las partículas en nm

Imágenes TEM del conjunto preparado de AuNP. Tenga en cuenta que la ampliación de la imagen difiere para tamaños de NP particulares

Adaptación de soluciones de nanopartículas para cumplir con las condiciones de biología vegetal

Debido a la fuerte tendencia de agregación de AuNPs en medios de crecimiento de plantas (medio MS), comúnmente utilizado para el crecimiento de plantas in vitro [23], tuvimos que optimizar la relación mutua de estos dos componentes para evitar la agregación de NPs preservando las condiciones aceptables para el crecimiento de plantas. Se probaron diferentes diluciones de MS. La agregación de AuNP fue fácilmente visible por el cambio de color (transición de rojo a púrpura). Debido a la baja concentración inicial de AuNP sintetizados (alrededor de 30 mg / L, ver Tabla 1), insuficiente para experimentos biológicos, fue necesario aumentar la concentración de NP por centrifugación. Mediante este procedimiento, aumentamos la concentración de partículas hasta el valor límite de 2000 mg / L. Estas soluciones de NP se diluyeron luego a concentraciones finales, lo que también disminuyó la concentración del tampón de citrato en nuestros experimentos. Para experimentos de cultivo de A. thaliana , diluimos AuNP en medio MS 1/16. La agregación mínima de NP fue detectable en este medio y las NP fueron mucho más estables en comparación con 1/2 MS, 1/4 MS y 1/8 MS con un crecimiento de la planta casi inalterado. La concentración de AuNP en las soluciones finales se determinó mediante AAS. Dado que los experimentos de crecimiento de plantas se realizaron in vitro (en condiciones estériles), también se estudió el efecto del procedimiento de esterilización en las NP. El autoclave de uso común (121 ° C, 20 min) de los medios de cultivo preparados provocó la agregación completa de las NP investigadas. Por tanto, este procedimiento no fue adecuado para nuestros experimentos. La adición de NP en medio de agar esterilizado en autoclave a aproximadamente 60 ° C se utilizó finalmente como un procedimiento alternativo en el que no se detectó agregación de NP y el proceso de esterilización seguía siendo eficaz.

Efecto de los NP en el crecimiento de la raíz de Arabidopsis thaliana in vitro

Plantas modelo como dicot A. thaliana tienen el potencial de ayudar a comprender los factores de estrés que reducen el rendimiento global de los cultivos con el objetivo de identificar genes que pueden mejorar la viabilidad en condiciones de estrés [24]. Todas las formas probadas de AuNP tuvieron un efecto significativo sobre las raíces laterales (LR). Tanto la longitud (Fig. 3a) como el número (Fig. 3b) de LR se redujeron en las plantas tratadas con AuNP. Las concentraciones más altas de AuNP (100 mg / L) de todos los tamaños de partículas investigados indujeron una disminución de la longitud de LR hasta aproximadamente el 50%. El número de LR disminuye a aproximadamente el 70% en el caso de AuNP de 18 nm y la concentración más alta (100 mg / L). Se observó una reducción ligeramente menor del número de LR cuando se usó la concentración más alta de AuNP más pequeños (14 y 10 nm) (Fig. 3b). La longitud de las raíces primarias también se redujo después del tratamiento con AuNP (Fig. 3c). El efecto negativo de AuNP de 10 nm fue considerable, especialmente a concentraciones de partículas más altas. El efecto de las partículas más grandes (14, 18 nm) fue mucho más pequeño y similar al efecto del tampón de citrato de sodio que se usó como control. La mayoría de los estudios publicados con NP modificadas indicaron cierto grado de fitotoxicidad, especialmente a concentraciones elevadas de NP. Por ejemplo, los AgNP recubiertos con citrato inhibieron A. thaliana elongación de la raíz de la plántula con una respuesta lineal a la dosis de 67 a 535 μg / L después de 2 semanas [25]. Varios otros estudios que utilizaron ensayos de elongación de raíces y germinación de semillas han demostrado que la fitotoxicidad se ve afectada por el tamaño de las NP. Numerosos estudios han concluido que cuanto más pequeños son los NP, más fitotóxicos son. Sin embargo, esta generalización sobre la toxicidad dependiente del tamaño de los nanomateriales modificados no siempre es cierta para todas las combinaciones de plantas y tipos de NP [21, 25]. Contrariamente a eso, los nanotubos de carbono de pared simple afectaron positivamente el alargamiento de la raíz del tomate, el repollo, la zanahoria y la lechuga en 24 a 48 h [26]. Kumar et al. [13].

Efecto de los AuNP en a longitud y b número de raíces laterales y c alargamiento de la raíz primaria de A. thaliana plántulas. Las plantas se expusieron a diferentes concentraciones (0,1, 10 y 100 mg / L) de AuNP de 10, 14 y 18 nm. Los datos son medias + DE de 19 a 20 plantas. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0,001; t prueba

Se observó un efecto positivo sustancial de las AuNP de 10 nm sobre el crecimiento del pelo de la raíz durante los experimentos de crecimiento de la raíz (Fig. 4). Este efecto mostró una fuerte dependencia de la concentración. El aumento de la concentración de NP indujo un crecimiento más pronunciado de los pelos radiculares (Fig. 4e). Este comportamiento se ha observado a menudo en raíces cultivadas en suelos pobres en fósforo [27]. No se observó un efecto similar en el caso de AuNP de 14 y 18 nm. Contrario a eso, García-Sánchez et al. [28] observado, durante A. thaliana tratamiento con AgNPs disponibles comercialmente, inhibición en varios pelos radicales relacionada con 1 cm de raíz de la planta. Se observó una disminución de las raíces del cabello en el caso de todas las partículas analizadas, independientemente de su tamaño específico (10, 20, 40 y 80 nm), utilizando una concentración uniforme de soluciones de tratamiento de 200 mg / L. Los pelos de la raíz aumentan sustancialmente el área de la superficie de la raíz en contacto con el suelo, y la mayor parte del agua y los nutrientes que ingresan a la planta se absorben a través de ellos. Por lo tanto, su desarrollo se ve afectado significativamente por los estímulos ambientales y las señales de estrés [29].

Efecto de diferentes concentraciones de AuNP de 10 nm sobre el crecimiento del vello radicular en A. thaliana plántulas. un Control, b - d plántulas tratadas con 1, 10 y 100 mg / L de AuNP, respectivamente, y e detalle del crecimiento inducido del pelo de la raíz en una planta expuesta a 100 mg / L de AuNP. Las barras de escala corresponden a 1 cm

Conclusiones

Hemos preparado con éxito nanopartículas de oro mediante una reducción suave de dos componentes (citrato de sodio-tetracloroaurato de potasio) en un ambiente acuático, lo que proporciona partículas de forma redonda y distribución estrecha con un excelente control sobre su tamaño resultante. La centrifugación posterior a la síntesis permitió alcanzar las concentraciones de NP deseadas y eliminó la influencia de los iones y el tampón de citrato en la distorsión de los resultados en los experimentos con plantas. El efecto de AuNP de diferentes tamaños (10, 14 y 18 nm de diámetro) y concentraciones (1, 10 y 100 mg / L) sobre el crecimiento de las raíces de A. thaliana fue investigado. El número y la longitud de las raíces laterales disminuyó significativamente después del tratamiento con soluciones de NP de concentraciones más altas de partículas, independientemente de su tamaño específico. Se observó un efecto negativo sobre el crecimiento de la raíz primaria en el caso de AuNP de 10 nm. Sorprendentemente, las AuNP más pequeñas (10 nm) indujeron claramente el crecimiento del vello radicular. En general, este estudio mostró que la exposición directa de las plantas a los AuNP contribuyó significativamente a la fitotoxicidad y subraya la necesidad de una eliminación eco-responsable de los desechos y lodos que contienen nanopartículas de Au.

Abreviaturas

AAS:: Espectroscopía de absorción atómica
AgNPs:: Nanopartículas de plata
AuNPs:: Nanopartículas de oro
DLS:: Dispersión de luz dinámica
ICP-MS:: Plasma acoplado inductivamente equipado con espectroscopia de masas
LR:: Raíces laterales
MS:: Murashige y Skoog
NMNP:: Nanopartículas de metales nobles
NP:: Nanopartículas
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión

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