Citotoxicidad dependiente de la forma y absorción celular de nanopartículas de oro sintetizadas con extracto de té verde

Resumen

En el presente informe, se sintetizaron tres formas diferentes de nanopartículas de oro cubiertas con quitosano (nanoesferas, nanoestrellas y nanobarras) para investigar los efectos de la forma sobre la citotoxicidad y la captación celular en las células cancerosas. El extracto de té verde se utilizó como agente reductor para reducir las sales de oro a nanoesferas de oro. Las nanoestrellas de oro se prepararon utilizando una solución de nanoesferas preparada como solución de semillas. Las nanovarillas de oro se sintetizaron utilizando un método convencional. Los tres tipos de nanopartículas de oro mostraron sus características bandas de resonancia de plasmón superficial en espectrofotometría UV-visible. En imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución, se observaron claramente estructuras reticulares en las tres formas, lo que confirma la naturaleza cristalina de las nanopartículas. Las tres soluciones coloidales de nanopartículas de oro retuvieron la estabilidad coloidal en varias soluciones. Para evaluar la citotoxicidad, se realizó el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) en cuatro líneas de células cancerosas. La citotoxicidad fue la más alta en nanobarras, seguida de nanoestrellas y finalmente nanoesferas. Se midió la captación celular de nanopartículas de oro en células de carcinoma de hepatocitos humanos (HepG2) y los resultados siguieron el orden nanoesferas> nanovarillas> nanoestrellas. Los resultados del estudio actual pueden ayudar en el diseño de formas de nanopartículas de oro para aplicaciones terapéuticas como vehículos de administración de fármacos en el campo de la nanomedicina.

Introducción

Las plantas contienen metabolitos primarios y secundarios naturales, que incluyen flavonoides, saponinas, alcaloides, esteroides, cumarinas, taninos, fenoles, terpenoides, carbohidratos, proteínas y aminoácidos. Recientemente, se han utilizado extractos de plantas para la síntesis de nanomateriales, específicamente nanopartículas metálicas como oro, plata, óxido de titanio, cobre, paladio, óxido de zinc y nanopartículas de platino [1]. Diversos fitoquímicos participan activamente en la conversión de sales metálicas en nanopartículas metálicas como agentes reductores. Además, los extractos de plantas juegan un papel como agentes estabilizantes para mantener la estabilidad coloidal de las nanopartículas metálicas en solución. Los agentes químicos reductores son generalmente nocivos y tóxicos para los organismos vivos. Por el contrario, el uso de extractos de plantas en la síntesis de nanopartículas metálicas es ecológico, ecológico y sostenible. Varias partes de la planta, como tallos, frutos, semillas, hojas y flores, se utilizan para sintetizar nanopartículas metálicas [1, 2]. Numerosas revisiones han estudiado la síntesis verde de nanopartículas de oro (AuNP) utilizando extractos de plantas como agentes reductores [2, 3, 4]. Usando esta estrategia verde, el paso sintético se realiza en un paso y en una olla. Además, el proceso es simple, fácil, rentable y ecológico. El tamaño, la forma y la topografía de los AuNP dependen de las concentraciones de sales y extractos de oro, el tiempo de reacción, la temperatura de reacción y el pH de la solución. Se emplean técnicas espectroscópicas y microscópicas para caracterizar las AuNP, que incluyen espectrofotometría UV-visible, difracción de rayos X, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica de barrido ( SEM) y medidas hidrodinámicas de tamaño y potencial zeta. Estos AuNP verdes se aplican como catalizadores, antioxidantes y agentes antimicrobianos y anticancerígenos [5,6,7,8].

En el laboratorio de los autores, extractos de plantas ( Artemisia capillaris , Leonurus japonicus , Polygala tenuifolia , Caesalpinia sappan , Bupleurum falcatum y Garcinia mangostana ) se han utilizado como agentes reductores para sintetizar tanto AuNP como nanopartículas de plata (AgNP) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. La parte aérea de A. capillaris fue extraído y utilizado para la síntesis de AgNP y AuNP [9, 15, 16]. Los AgNP preparados ejercieron una excelente actividad antibacteriana contra Escherichia coli , Enterobacter cloacae , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella aerogenes y Klebsiella oxytoca en comparación con el del extracto solo [15]. Este resultado indicó que el efecto sinérgico de combinar los AgNP y el extracto contribuyó a mejorar la actividad antibacteriana. Curiosamente, los AgNP sintetizados usando A. capillaris en presencia de bromuro de cetiltrimetilamonio exhibió actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus resistente a la meticilina [dieciséis]. Además, AuNPs sintetizados usando A. capilares mostró actividad catalítica hacia la reacción de reducción del 4-nitrofenol [9]. L. japonicus extracto se utilizó para la síntesis de AgNP que exhiben mejoras notables en la actividad antibacteriana [10]. Observamos que la actividad antibacteriana frente a bacterias Gram negativas fue mayor que frente a las bacterias Gram positivas. El extracto de raíz de P. tenuifolia También se utilizó para la síntesis de AuNP y AgNP [11, 17]. Se observaron actividad anticoagulante y actividad antibacteriana mejoradas en AuNP y AgNP, respectivamente, sintetizados usando P. tenuifolia extraer. Lo más interesante es que los AgNP sintetizados usando C. sappan El extracto mostró una actividad antibacteriana eficaz contra S. aureus [18]. El extracto de G. mangostana produjo AgNP asimétricos en forma de mancuerna con efectos apoptóticos [14].

Informes anteriores han examinado la síntesis verde de AuNP y AgNP utilizando extracto de hoja de té [19,20,21,22,23]. Kamal y colaboradores informaron sobre la síntesis exitosa de 25 nm-AgNPs [19]. En otro informe, se sintetizaron AgNP esféricos que medían de 20 a 90 nm utilizando extracto de hoja de té [20]. Los AgNP sintetizados mostraron una ligera actividad antibacteriana contra E. coli . Loo y sus colaboradores también prepararon AgNP esféricos que miden 3,42 ~ 4,06 nm utilizando extracto de hoja de té [21]. Vaseeharan y sus colaboradores sintetizaron AgNP antibacterianos utilizando extracto de hoja de té [22]. Los AgNP sintetizados fueron eficaces contra el Vibrio harveyi patógeno. infección. Begum y colaboradores utilizaron extracto de hoja de té negro para sintetizar tanto AuNP como AgNP [23]. Hasta la fecha, la mayoría de los AgNP esféricos se han sintetizado utilizando extracto de hoja de té.

En el presente informe, el quitosano se utilizó como agente de remate para AuNP. El quitosano se ha explorado como vehículo de administración de fármacos / genes debido a su alta biocompatibilidad, baja alergenicidad, biodegradabilidad y baja toxicidad [24, 25, 26]. El quitosano se origina a partir de la quitina, que es abundante en los exoesqueletos de insectos y crustáceos como cangrejos, langostas y camarones. La quitina es un polisacárido compuesto de N -acetil-D-glucosamina unida por enlaces β (1-4) glicosídicos. El quitosano se puede obtener a partir de la quitina mediante un N heterogéneo -Proceso de desacetilación. El propio quitosano posee actividad antibacteriana, antifúngica, antitumoral y antioxidante [25]. Como agente de protección, el quitosano contacta directamente con las AuNP a través de un mecanismo electrostérico [26]. Las nanopartículas de quitosano afectan el mecanismo de captación celular por las células A549 sin modificar la citotoxicidad [24]. Además, el grado de desacetilación del quitosano influye más que el peso molecular en la captación celular y la citotoxicidad [24].

La mayoría de los estudios se han centrado en la síntesis de AgNP esféricos utilizando extracto de hoja de té. Aquí, el extracto de hoja de té verde se utilizó para sintetizar nanoesferas y nanoestrellas de oro. Las nanoesferas se utilizaron como semillas para la síntesis de nanoestrellas mediada por semillas. A modo de comparación, las nanovarillas se sintetizaron mediante un método convencional común [27]. Se cubrieron tres formas diferentes de AuNP (nanoesferas, nanoestrellas y nanobarras) con quitosano para aumentar su biocompatibilidad y estabilidad coloidal. Estos AuNP se caracterizaron por espectrofotometría UV-visible, microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HR-TEM) y FT-IR. Las mediciones de tamaño hidrodinámico realizadas por dispersión de luz dinámica (DLS) y las mediciones de potencial zeta se realizaron antes y después de la protección con quitosano. La estabilidad coloidal se evaluó en soluciones salinas, tampón y medio de cultivo celular. Para medir la citotoxicidad, se aplicó el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cuatro células cancerosas:AGS (células de adenocarcinoma gástrico humano), HeLa (adenocarcinoma de cuello uterino epitelial humano) células), HepG2 (células de carcinoma de hepatocito humano) y HT29 (células de adenocarcinoma colorrectal humano). La captación celular de AuNP en células HepG2 se midió cuantitativamente mediante espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) y espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente por ablación con láser (LA-ICP-MS).

Materiales y métodos

Materiales e instrumentación

Trihidrato de ácido cloroáurico (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), quitosano (de conchas de camarón, ≥ 75% desacetilado) y bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio se adquirieron de Sigma-Aldrich (St . Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron de calidad analítica. Se utilizó un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 o UV-2600 para adquirir espectros UV-visibles en una cubeta de cuarzo (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón). Las mediciones de tamaño hidrodinámico realizadas por DLS y las mediciones de potencial zeta se realizaron usando un NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Nueva York, EE. UU.). Se utilizó un Varian 640 IR para adquirir espectros FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.); la muestra medida se preparó mediante el método del disco KBr. Las imágenes HR-TEM se capturaron usando un JEM-3010 operado a 300 kV (JEOL, Tokio, Japón); la muestra se cargó en una rejilla de cobre recubierta de carbón (carbón tipo B, malla 300, Ted Pella, Redding, CA, EE. UU.) y se dejó secar en el horno a 37 ° C durante 24 h. Para la sonicación, se utilizó un modelo WUC-A22H (Daihan Scientific Co. LTD., Seúl, República de Corea). Se utilizaron una Centrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y una FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, República de Corea) para centrifugación y liofilización, respectivamente. Para la captación celular de AuNP, se utilizó un Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.) Y un J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, EE. UU.).

Preparación de extracto de té verde

El Instituto de Té Verde Hadong (Hadong, Gyeongnam, República de Corea) brindó amablemente un obsequio de hojas de té verde secas. Se usó una licuadora para preparar los polvos de las hojas secas. La extracción se realizó mezclando agua desionizada (2 L) y hojas en polvo (200 g). Se dejó que la extracción prosiguiera durante 1 h mediante sonicación a temperatura ambiente con tres repeticiones. Se utilizaron papeles de filtro Whatman para filtrar fracciones de agua para eliminar materiales insolubles. Luego, el filtrado se centrifugó (3.000 g fuerza, 18 ° C, 25 min), y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante recogido se filtró con jeringa y el filtrado se liofilizó. El material liofilizado se disolvió en agua desionizada para crear una solución madre con una concentración final del 2% ( p / v ) para la síntesis verde descrita en la siguiente sección.

Síntesis de nanoesferas de oro usando extracto

El proceso de síntesis de la nanoesfera se ilustra en la Fig. 1a. La solución madre descrita en la sección anterior se utilizó para la síntesis. En un vial de vidrio, se mezclaron el extracto (concentración final de 0,03%) y trihidrato de ácido cloroáurico (concentración final de 0,5 mM) y se añadió hidróxido de sodio (concentración final de 1 mM). Se añadió agua desionizada para hacer un volumen final de 2 ml. La incubación en el horno se realizó en un horno seco a 80 ° C durante 2 h. La resonancia de plasmón de superficie (SPR) de las nanoesferas se controló adquiriendo espectros UV-visible en el rango de 300 ~ 800 nm. Las nanoesferas también se utilizaron como semillas para la síntesis de nanoestrellas descritas en la siguiente sección.

Síntesis de nanoesferas de oro. un Un diagrama esquemático del proceso de síntesis y b Espectros UV-visible de nanoesferas antes y después del recubrimiento de quitosano. Una fotografía digital muestra nanoesferas inmediatamente después de la síntesis

Síntesis de nanoestrellas de oro

El proceso de síntesis de nanoestrellas se ilustra en la Fig. 2a. Las nanoesferas (50 μL) sintetizadas como se describe en la sección anterior se agitaron (750 rpm) con una barra magnética en una placa caliente a temperatura ambiente. A esta solución se le añadió trihidrato de ácido cloroaurico (0,25 mM, 5 ml). Después de 15 s, se agregaron dos soluciones simultáneamente:nitrato de plata (1 mM, 50 μL) y ácido ascórbico (recién preparado, 100 mM, 25 μL). Luego, la mezcla se agitó a 750 rpm durante 5 min. Los espectros UV-visible se adquirieron en el rango de 300 ~ 1100 nm.

Síntesis de nanoestrellas de oro. un Un diagrama esquemático del proceso de síntesis y b Espectros UV-visible de nanoestrellas antes y después del recubrimiento de quitosano. Una fotografía digital muestra nanoestrellas inmediatamente después de la síntesis

Síntesis de nanovarillas de oro

El proceso de síntesis de nanobarras se ilustra en la Fig. 3a. Para la síntesis de nanobarras de oro, la síntesis mediada por semillas se realizó de acuerdo con un informe anterior con modificaciones menores [27]. La solución de crecimiento se preparó como sigue. En un vial de vidrio de 20 mL, se mezclaron ácido cloroaurico trihidrato (10 mM, 500 μL) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, 100 mM, 9.5 mL). La solución era de color marrón amarillento. A continuación, se añadió ácido ascórbico (recién preparado, 100 mM, 55 µL) y esta solución se agitó hasta que cambió de marrón amarillento a incolora. Se añadió nitrato de plata (10 mM, 100 μL) y se agitó durante 10 s. Esta solución final se etiquetó como solución de crecimiento. La solución de semillas se sintetizó como sigue. En un vial de vidrio de 20 mL, se mezclaron ácido cloroaurico trihidrato (10 mM, 250 μL) y CTAB (100 mM, 9,75 mL). Luego, se añadió borohidruro de sodio recién preparado, enfriado con hielo (10 mM, 600 μL) y se agitó con vórtex durante 2 min. La solución se etiquetó como solución de semillas. La solución de semilla (12 μL) se mezcló con una solución de crecimiento sintetizada previamente. Los espectros UV-visible se adquirieron en el rango de 400 ~ 900 nm.

Síntesis de nanobarras de oro. un Un diagrama esquemático del proceso de síntesis y b Espectros UV-visible de nanobarras antes y después del recubrimiento de quitosano. Una fotografía digital muestra nanobarras inmediatamente después de la síntesis

Capa de quitosano de nanoesferas, nanoestrellas y nanobarras

Se empleó protección con quitosano para aumentar la estabilidad coloidal y la biocompatibilidad de las AuNP. Se disolvió quitosano en ácido acético al 1% y la concentración final se ajustó a 0,01%. Luego, se realizó la sonicación para disolver completamente el quitosano; esta solución se usó como solución madre para el taponamiento con quitosano en el siguiente procedimiento. Tanto las nanoesferas como las nanoestrellas que se sintetizaron previamente se taparon con la solución madre de quitosano (0,01%). La solución madre de quitosano (30%, v / v ) se mezcló con la solución de AuNP (70%, v / v ). La mezcla se agitó a 900 rpm durante 2 h para completar el taponamiento con quitosano. Para las nanovarillas, se usó un exceso de CTAB y, por lo tanto, se realizó una centrifugación (14.000 rpm, 15 min, 25 ° C) para eliminar el CTAB. Se recuperaron las nanovarillas del gránulo y se llevó a cabo el taponamiento con quitosano como se mencionó anteriormente. Luego, se adquirieron los espectros UV-visible.

Evaluación de la estabilidad coloidal

La estabilidad coloidal de las AuNP es importante para aplicaciones in vitro e in vivo. Se evaluó la estabilidad coloidal de los tres tipos de AuNP con recubrimiento de quitosano y nanoesferas sin recubrimiento de quitosano en las siguientes soluciones:agua desionizada, albúmina de suero bovino (BSA) al 5%, NaCl al 5%, PBS (pH 7,4), medio de Eagle modificado por Dulbecco ( DMEM) y medio completo. El medio completo era DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%. Se mezcló un mililitro de cada tipo de solución de AuNP con la solución de prueba como se mencionó anteriormente (0,5 ml). La mezcla se incubó a 25 ° C durante 30 min y se adquirieron los espectros UV-visible.

Cultivo celular y citotoxicidad

Las siguientes líneas de células cancerosas se adquirieron del Korean Cell Line Bank (Seúl, República de Corea):AGS, HeLa, HepG2 y HT29. El ensayo MTT se realizó para evaluar la citotoxicidad in vitro de AuNP. Se utilizó DMEM que contenía piruvato de sodio. El medio de cultivo celular contenía suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina al 1% (100 unidades / ml) y estreptomicina (100 unidades / ml). Las células se cultivaron en placas de cultivo de 100 mm y se mantuvieron a aproximadamente un 70% de confluencia. Antes del cultivo celular, las AuNP de tres formas diferentes se sometieron a evaporación al vacío para obtener una concentración final de Au de 5 mM. En placas de 96 pocillos, las células se sembraron a una densidad de 5,0 × 10 ³ células / pocillo, y la incubación se realizó durante 24 h en un horno a 37 ° C bajo un CO ₂ (5%) atmósfera. A continuación, se trataron cinco concentraciones diferentes de AuNP (500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM y 31,25 μM) y se incubaron en el horno durante otras 24 horas a 37 ° C bajo CO ₂ (5%) atmósfera. A continuación, se añadió reactivo MTT (5 μL, 5% en agua desionizada) y se incubó en un horno a 37 ° C bajo CO ₂ (5%) atmósfera durante 3 h adicionales. La absorbancia se midió a 570 nm usando un lector de detección múltiple de fluorescencia (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.). Las células no tratadas se utilizaron como control.

Captación celular

La captación celular de cada tipo de AuNP se midió cuantitativamente usando células HepG2. En placas de 24 pocillos, las células se sembraron a una densidad de 5,0 × 10 ⁴ células / pocillo, y la incubación se realizó durante 24 h en un horno a 37 ° C bajo un CO ₂ (5%) atmósfera. A continuación, se trató 5 μM (concentración final) de cada tipo de solución de AuNP y se incubó en el horno durante 24 horas más a 37 ° C bajo CO ₂ (5%) atmósfera. Después de la incubación, se eliminó la solución que contenía el exceso de AuNP y las células se trataron con tripsina. La concentración de Au en las células tripsinizadas se midió cuantitativamente mediante ICP-OES y LA-ICP-MS, que proporcionó la concentración de captación de Au en las células. El control fue 5 μM de la solución coloidal original de cada tipo de AuNP, que también fue analizada por ICP-OES y LA-ICP-MS para obtener la concentración de Au.

Resultados y discusión

Espectros UV-visible

Los espectros UV-visible se adquieren comúnmente para confirmar la síntesis de AuNP. La SPR característica de las AuNP se puede observar en el rango de longitud de onda visible del infrarrojo cercano. Además, la limitación de AuNP generalmente induce un cambio bathocrómico (o rojo) o hipsocrómico (o azul). Además, generalmente se induce un cambio hipocrómico junto con cambios al rojo y al azul. Como se muestra en la Fig. 1b, los espectros UV-visible se controlaron en un rango de 300 ~ 800 nm. Las nanoesferas mostraron una SPR característica de 532 nm con un color burdeos intenso. Después de la protección de las nanoesferas con quitosano, la SPR máxima se desplazó hacia el rojo a 537 nm junto con un desplazamiento hipocrómico (Fig. 1b). Se observó una amplia gama de longitudes de onda SPR (600 ~ 800 nm) con una solución azul oscuro para las nanoestrellas (Fig. 2b). El recubrimiento de quitosano de las nanoestrellas mostró un cambio hipocrómico, donde la absorbancia fue menor que la de las AuNP sin recubrimiento de quitosano (Fig. 2b). Los nanorods mostraron dos longitudes de onda SPR distintas de 514 nm y 815 nm, con la formación de una solución de color rosa claro (Fig. 3b). El recubrimiento de quitosano de las nanovarillas indujo un cambio de azul a 797 nm junto con un cambio hipocrómico (Fig. 3b). Teniendo en cuenta todos estos resultados, la limitación de AuNP con quitosano cambió la longitud de onda de SPR e indujo cambios. Un examen cuidadoso de los espectros UV-visible demostró que los tres tipos de AuNP se cubrieron con éxito con quitosano.

Tamaño hidrodinámico y potenciales zeta

A continuación, se midieron el tamaño hidrodinámico y los potenciales zeta; los resultados se muestran en la Tabla 1. Sin el recubrimiento de quitosano, los tamaños hidrodinámicos de nanoesferas y nanoestrellas fueron 28,4 y 97,8 nm, respectivamente. El tamaño hidrodinámico de las nanovarillas no se midió porque el tamaño hidrodinámico estaba bien ajustado a las formas esféricas de las nanopartículas. Con la protección de quitosano, el tamaño hidrodinámico se incrementó a 190,7 nm para nanoesferas y a 123,9 nm para nanoestrellas. El taponamiento con quitosano se confirmó mediante un aumento del tamaño hidrodinámico. El cambio en los potenciales zeta también reflejó el recubrimiento de quitosano en la superficie de los AuNP. El quitosano es un polisacárido cargado positivamente; por tanto, la protección con quitosano dio como resultado potenciales zeta positivos para los tres tipos de AuNP. Para las nanoesferas, el potencial zeta se alteró de - 12,73 a 42,28 mV. El potencial zeta de las nanoestrellas se alteró de - 42,46 a 47,44 nm. En el caso de las nanovarillas, se utilizó CTAB (un tensioactivo catiónico) para la síntesis. Por tanto, el potencial zeta original era de 27,96 mV sin limitación. El recubrimiento de quitosano de las nanovarillas aumentó el potencial zeta a 33,23 nm. Por lo tanto, el cambio en los potenciales zeta de valores negativos a positivos para las nanoesferas y nanoestrellas indicó claramente un taponamiento exitoso con quitosano. Además, el potencial zeta de las nanovarillas aumentó, lo que sugiere que la superficie estaba cubierta con quitosano.

Imágenes HR-TEM

La microscopía es crucial para la investigación de nanopartículas, ya que proporciona información esencial sobre el tamaño y la forma de las nanopartículas. Las herramientas de microscopía brindan una variedad de información detallada, como el estado de dispersión, la morfología y topografía bidimensionales y tridimensionales, y la suavidad / dureza relativa de los materiales. Las nanoesferas midieron 8,7 ± 1,7 nm, basado en el promedio de 75 nanopartículas discretas seleccionadas al azar en imágenes HR-TEM (Fig. 4). El tamaño más abundante fue de 8 ~ 9 nm (29,3%), seguido de 9 ~ 10 nm (12,0%). Con el recubrimiento de quitosano, la forma de las nanoesferas se conservó sin ningún cambio de forma (Fig. 4c, d). La naturaleza cristalina de las partículas quedó claramente indicada por las estructuras reticulares mostradas en la Fig. 4d. Se midió que la distancia entre las celosías vecinas era de 0,24 nm (Fig. 4d). Además, también se visualizó la capa de quitosano, como lo indican las flechas rojas en la Fig. 4d. Las nanoestrellas se visualizaron mediante HR-TEM, como se muestra en la Fig. 5. Las nanoestrellas midieron 99,0 ± 47,0 nm, lo que representa el promedio de 19 nanopartículas discretas. La estructura de celosía se indica en una imagen ampliada (Fig. 5c). Como se muestra, la distancia entre las celosías vecinas se midió en 0,24 nm (Fig. 5c). Las flechas rojas en la Fig. 5c indican la capa de quitosano. Las nanovarillas se visualizaron como se muestra en la Fig. 6. La longitud y el ancho promedio de las partículas fueron 60,4 nm y 16,4 nm, respectivamente, según las mediciones realizadas para 28 partículas. La relación de aspecto, definida como la longitud de las partículas dividida por el ancho de las partículas, fue de 3,7. La estructura reticular se muestra en la Fig. 6c, lo que confirma la estructura cristalina de las nanovarillas. Se midió que la distancia entre las celosías vecinas era de 0,23 nm (Fig. 6c). Las flechas rojas indican la capa de quitosano (Fig. 6c).

Imágenes HR-TEM de nanoesferas de oro. Las barras de escala representan a 5 millas náuticas, b 20 millas náuticas, c 20 nm y d 5 nm. Imágenes a y b se obtuvieron sin recubrimiento de quitosano, y c y d se obtuvieron con recubrimiento de quitosano. Se midió que la distancia entre las celosías vecinas era de 0,24 nm. Las flechas rojas indican la capa de quitosano después de tapar

Imágenes HR-TEM de nanoestrellas de oro. Las barras de escala representan a 200 millas náuticas, b 50 nm y c 5 nm. d Una representación esquemática de nanoestrellas con un tamaño medio de 99,0 ± 47,0 nm. Imagen a se obtuvo sin recubrimiento de quitosano, y b y c se obtuvieron con recubrimiento de quitosano. Se midió que la distancia entre las celosías vecinas era de 0,24 nm. Las flechas rojas indican la capa de quitosano después de tapar

Imágenes HR-TEM de nanobarras de oro. Las barras de escala representan a 100 nm, b 200 nm y c 5 nm. d Una representación esquemática de nanobarras con una longitud y un ancho promedio de 60,4 nm y 16,4 nm, respectivamente. Imagen a se obtuvo sin recubrimiento de quitosano, y b y c se obtuvieron con recubrimiento de quitosano. Se midió que la distancia entre las celosías vecinas era de 0,23 nm. Las flechas rojas indican la capa de quitosano después de tapar

Espectros FT-IR

El té verde contiene diversos metabolitos primarios y secundarios. Específicamente, los componentes principales del té verde son los polifenoles, que incluyen epigalocatequina-3-galato, (-) - epicatequina-3-galato, (-) - epigalocatequina y (-) - epicatequina [28]. Los espectros FT-IR se adquirieron para obtener información sobre los grupos funcionales que contribuyeron a la síntesis de AuNP. Comparamos el espectro FT-IR de nanoesferas con el espectro del extracto (Fig. 7). El grupo funcional principal que probablemente participó en la reacción de reducción de las sales de Au fue –OH. En el extracto, los grupos funcionales –OH aparecieron a 3255 cm ⁻¹ (Figura 7a). Tras la síntesis, este pico se desplazó a un número de onda más alto a 3300 ~ 3341 cm ⁻¹ . Este resultado demostró que los grupos funcionales –OH se originaron a partir de polifenoles oxidados a C =O mientras reducían las sales de Au a AuNP. Sorprendentemente, la aparición de grupos funcionales C =O a 1716 cm ⁻¹ en nanoesferas apoyaba claramente la oxidación de los grupos funcionales –OH durante la síntesis (Fig. 7b).

Espectros FT-IR de a extracto de té verde utilizado para síntesis y b nanoesferas de oro

Evaluación de la estabilidad coloidal bajo varias soluciones

La estabilidad coloidal de las nanopartículas es una preocupación importante para las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Se probaron seis soluciones diferentes para determinar la estabilidad coloidal:(i) agua desionizada, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM y (vi) ) medio completo (DMEM con FBS al 10%). Después de mezclar cada tipo de AuNP con la solución de prueba, se adquirieron los espectros UV-visible; los resultados se muestran en la Tabla 2 y la Fig. 8. Se observó un desplazamiento hipocrómico junto con un ligero desplazamiento de rojo o azul para los tres tipos de AuNP en los espectros UV-visible (Fig. 8a, cye). Se mantuvo la forma de los espectros y no se observó agregación de la solución coloidal (Fig. 8b, dyf). Este resultado demostró que la estabilidad coloidal se mantuvo bastante bien en las soluciones de prueba mencionadas anteriormente.

Evaluación de la estabilidad coloidal. un y b nanoesferas con recubrimiento de quitosano, c y d nanoestrellas con cobertura de quitosano, e y f nanovarillas con cobertura de quitosano, g y h nanoesferas sin recubrimiento de quitosano. DW representa agua desionizada

En la Tabla 2, el cambio hipocrómico se expresa como el porcentaje de absorbancia retenida, con la absorbancia de la solución original ajustada al 100%. En los tres AuNP, la estabilidad coloidal se mantuvo mejor en medio completo, que se utilizó para los experimentos de citotoxicidad posteriores:nanoesferas (65,3%), nanoestrellas (93,4%) y nanobarras (80,2%). La solución de proteína, BSA (5%), también proporcionó una estabilidad coloidal razonable:nanoesferas (61,8%), nanoestrellas (70,2%) y nanobarras (72,0%). Estos resultados indicaron que las proteínas que recubren las nanopartículas tienen efectos beneficiosos adicionales sobre la estabilidad coloidal de las AuNP junto con el recubrimiento de quitosano. También se evaluó la estabilidad coloidal de las nanoesferas sin recubrimiento de quitosano (Fig. 8g, h). Todas las soluciones indujeron un cambio hipocrómico. Entre las soluciones probadas, solo la solución de NaCl (5%) mostró un gran desplazamiento hacia el rojo junto con un desplazamiento hipocrómico.

Citotoxicidad

Se realizó un ensayo MTT para medir la citotoxicidad contra cuatro tipos de células cancerosas (Fig. 9):AGS, HeLa, HepG2 y HT29. La citotoxicidad de los tres tipos de AuNP dependía de la concentración de Au. Entre los cuatro tipos de células, se observó la mayor citotoxicidad para las células HepG2. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). un AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.

Conclusion

The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.

Abreviaturas

AFM:: Microscopía de fuerza atómica
AgNPs:: Silver nanoparticles
AGS:: Human gastric adenocarcinoma cells
AuNPs:: Nanopartículas de oro
CTAB:: Bromuro de cetiltrimetilamonio
DLS:: Dispersión de luz dinámica
DMEM:: Medio Eagle modificado de Dulbecco
FBS:: Suero fetal bovino
FT-IR:: Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier
HeLa:: Human epithelial cervix adenocarcinoma cells
HepG2:: Human hepatocyte carcinoma cells
HR-TEM:: Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución
HT29:: Human colorectal adenocarcinoma cells
ICP-OES:: Espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente
LA-ICP-MS:: Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry
SEM:: Microscopía electrónica de barrido
SPR:: Resonancia de plasmón superficial

Puntos de nano-biomasa fluorescentes:extracción asistida por ultrasonidos y su aplicación como nanoprobe para la detección de Fe3 + Sobre la figura de méritos de Baliga (BFOM) Mejora de un nuevo transistor de efecto de campo vertical (FET) de nanopilar GaN con canal 2DEG y Sustrato estampado

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

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