Citotoxicidad y captación celular dependientes de la forma de nanopartículas de oro reducidas con té verde en células cancerígenas

Resumen

En el presente informe, se sintetizaron tres formas diferentes de nanopartículas de oro recubiertas con quitosano (nanoesferas, nanoestrellas y nanorodas) para investigar los efectos de la forma sobre la citotoxicidad y la captación celular en células cancerígenas. El extracto de té verde se utilizó como agente reductor para reducir sales de oro a nanoesferas de oro. Las nanoestrellas de oro se prepararon usando una solución de nanoesferas preparada como solución semilla. Las nanorodas de oro se sintetizaron usando un método convencional. Los tres tipos de nanopartículas de oro mostraron sus bandas características de resonancia de plasmón de superficie en espectrofotometría UV-visible. En imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución, se observaron estructuras de red claras en las tres formas, confirmando la naturaleza cristalina de las nanopartículas. Las tres soluciones coloidales de nanopartículas de oro mantuvieron estabilidad coloidal en diversas soluciones. Para evaluar la citotoxicidad, se realizó el ensayo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) en cuatro líneas de células cancerígenas. La citotoxicidad fue más alta en nanorodas, seguida de nanoestrellas y finalmente nanoesferas. La captación celular de nanopartículas de oro en células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) se midió, y los resultados siguieron el orden nanoesferas > nanorodas > nanoestrellas. Los resultados del estudio actual pueden asistir en el diseño de forma de nanopartículas de oro para aplicaciones terapéuticas como vehículos de administración de fármacos en el campo de la nanomedicina.

Introducción

Las plantas contienen metabolitos primarios y secundarios naturales, incluyendo flavonoides, saponinas, alcaloides, esteroides, cumarinas, taninos, fenoles, terpenoides, carbohidratos, proteínas y aminoácidos. Recientemente, los extractos de plantas se han utilizado para la síntesis de nanomateriales, específicamente nanopartículas metálicas como oro, plata, óxido de titanio, cobre, paladio, óxido de zinc y nanopartículas de platino [1]. Diversos fitoquímicos participan activamente en la conversión de sales metálicas a nanopartículas metálicas como agentes reductores. Además, los extractos de plantas juegan un papel como agentes estabilizadores para mantener la estabilidad coloidal de nanopartículas metálicas en solución. Los agentes reductores químicos son generalmente nocivos y tóxicos para organismos vivos. Por el contrario, el uso de extractos de plantas en la síntesis de nanopartículas metálicas es verde, ecológico y sostenible. Diversas partes de plantas, como tallos, frutos, semillas, hojas y flores, se utilizan para sintetizar nanopartículas metálicas [1, 2]. Revisiones extensas han examinado la síntesis verde de nanopartículas de oro (AuNPs) usando extractos de plantas como agentes reductores [2,3,4]. Usando esta estrategia verde, el paso sintético se realiza en un solo paso y en un solo recipiente. Además, el proceso es simple, fácil, rentable y ecológico. El tamaño, forma y topografía de AuNPs dependen de las concentraciones de sales de oro y extractos, tiempo de reacción, temperatura de reacción y pH de la solución. Técnicas espectroscópicas y microscópicas se emplean para caracterizar AuNPs, incluyendo espectrofotometría UV-visible, difracción de rayos X, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica de barrido (SEM) y mediciones de tamaño hidrodinámico y potencial zeta. Estos AuNPs verdes se aplican como catalizadores, antioxidantes y agentes antimicrobianos y anticancerígenos [5,6,7,8].

En el laboratorio de los autores, extractos de plantas (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum y Garcinia mangostana) se han usado como agentes reductores para sintetizar verde tanto AuNPs como nanopartículas de plata (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. La parte aérea de A. capillaris se extrajo y usó para síntesis de AgNPs y AuNPs [9, 15, 16]. Los AgNPs preparados ejercieron excelente actividad antibacteriana contra Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes y Klebsiella oxytoca comparado con el extracto solo [15]. Este resultado indicó que el efecto sinérgico de combinar AgNPs y el extracto contribuyó a la actividad antibacteriana mejorada. Interesantemente, AgNPs sintetizados usando A. capillaris en presencia de bromuro de cetiltrimetilamonio exhibieron actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina [16]. Además, AuNPs sintetizados usando A. capillaris mostraron actividad catalítica hacia la reacción de reducción de 4-nitrofenol [9]. El extracto de L. japonicus se utilizó para síntesis de AgNPs exhibiendo mejoras notables en actividad antibacteriana [10]. Se observó que la actividad antibacteriana hacia bacterias Gram-negativas fue mayor que contra Gram-positivas. El extracto de raíz de P. tenuifolia también se utilizó para síntesis de AuNPs y AgNPs [11, 17]. Actividad anticoagulante mejorada y actividad antibacteriana se observaron en AuNPs y AgNPs, respectivamente, sintetizados usando extracto de P. tenuifolia. Lo más interesante, AgNPs sintetizados usando extracto de C. sappan mostraron actividad antibacteriana efectiva contra S. aureus resistente a meticilina [18]. El extracto de G. mangostana produjo AgNPs con forma de mancuerna asimétrica con efectos apoptóticos [14].

Reportes previos han examinado la síntesis verde de AuNPs y AgNPs usando extracto de hoja de té [19,20,21,22,23]. Kamal y colaboradores reportaron la síntesis exitosa de AgNPs de 25 nm [19]. En otro reporte, AgNPs esféricos de 20 a 90 nm se sintetizaron usando extracto de hoja de té [20]. Los AgNPs sintetizados mostraron ligera actividad antibacteriana contra E. coli. AgNPs esféricos de 3,42–4,06 nm también fueron preparados por Loo y colaboradores usando extracto de hoja de té [21]. Vaseeharan y colaboradores sintetizaron AgNPs antibacterianos usando extracto de hoja de té [22]. Los AgNPs sintetizados fueron efectivos contra infección patogénica por Vibrio harveyi. Begum y colaboradores usaron extracto de hoja de té negro para sintetizar tanto AuNPs como AgNPs [23]. Hasta la fecha, mayormente AgNPs esféricos se han sintetizado usando extracto de hoja de té.

En el presente informe, el quitosano se usó como agente de recubrimiento para AuNPs. El quitosano ha sido explorado como vehículo de administración de fármacos/genes debido a su alta biocompatibilidad, baja alergenicidad, biodegradabilidad y baja toxicidad [24,25,26]. El quitosano origina de la quitina, abundante en los exoesqueletos de insectos y crustáceos como cangrejos, langostas y camarones. La quitina es un polisacárido compuesto de N-acetil-D-glucosamina unida por enlaces glucosídicos β(1-4). El quitosano se obtiene de la quitina por un proceso heterogéneo de N-desacetilación. El quitosano en sí posee actividad antibacteriana, antifúngica, antitumoral y antioxidante [25]. Como agente de recubrimiento, el quitosano contacta directamente AuNPs a través de un mecanismo electrostérico [26]. Las nanopartículas de quitosano afectan el mecanismo de captación celular por células A549 sin modificar la citotoxicidad [24]. Además, el grado de desacetilación del quitosano es más influyente que el peso molecular en la captación celular y citotoxicidad [24].

La mayoría de estudios se han centrado en la síntesis de AgNPs esféricos usando extracto de hoja de té. Aquí, extracto de hoja de té verde se utilizó para sintetizar nanoesferas y nanoestrellas de oro. Las nanoesferas se usaron como semillas para la síntesis mediada por semilla de nanoestrellas. Para comparación, nanorodas se sintetizaron por un método convencional común [27]. Tres formas diferentes de AuNPs (nanoesferas, nanoestrellas y nanorodas) se recubrieron con quitosano para aumentar su biocompatibilidad y estabilidad coloidal. Estas AuNPs se caracterizaron por espectrofotometría UV-visible, microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HR-TEM) y FT-IR. Mediciones de tamaño hidrodinámico por dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones de potencial zeta se realizaron antes y después del recubrimiento con quitosano. La estabilidad coloidal se evaluó en soluciones de sal, buffer y medio de cultivo celular. Para medir citotoxicidad, el ensayo MTT se aplicó a cuatro células cancerígenas: AGS (adenocarcinoma gástrico humano), HeLa (adenocarcinoma epitelial cervical humano), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano) y HT29 (adenocarcinoma colorrectal humano). La captación celular de AuNPs en células HepG2 se midió cuantitativamente por espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) y espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente con ablación láser (LA-ICP-MS).

Materiales y métodos

Materiales e instrumentación

Ácido cloroáurico trihidratado (HAuCl₄·3H₂O), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), quitosano (de caparazones de camarón, ≥ 75 % desacetilado) y 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron de grado analítico. Un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 o UV-2600 se utilizó para adquirir espectros UV-visible en cubeta de cuarzo (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón). Mediciones de tamaño hidrodinámico por DLS y potencial zeta se realizaron usando un NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, EE. UU.). Un Varian 640 IR se usó para adquirir espectros FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.); la muestra medida se preparó por método de disco KBr. Imágenes HR-TEM se capturaron usando un JEM-3010 operado a 300 kV (JEOL, Tokio, Japón); la muestra se cargó en una rejilla de cobre recubierta de carbono (tipo-B de carbono, malla 300, Ted Pella, Redding, CA, EE. UU.) y se permitió secar en horno a 37 °C durante 24 h. Para sonicación, se usó un modelo WUC-A22H (Daihan Scientific Co. LTD., Seúl, República de Corea). Una centrífuga 5424R (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y un FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, República de Corea) se usaron para centrifugación y liofilización, respectivamente. Para la captación celular de AuNPs, se utilizaron un Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.) y un J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, EE. UU.).

Preparación de extracto de té verde

El Instituto de Té Verde de Hadong (Hadong, Gyeongnam, República de Corea) proporcionó amablemente hojas de té verde secas. Una batidora se usó para preparar polvos de las hojas secas. La extracción se realizó mezclando agua desionizada (2 L) y hojas en polvo (200 g). La extracción se permitió proceder durante 1 h por sonicación a temperatura ambiente con tres repeticiones. Papeles de filtro Whatman se usaron para filtrar fracciones de agua para remover materiales insolubles. Luego, el filtrado se centrifugó (3000g, 18 °C, 25 min), y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante recogido se filtró por jeringa, y el filtrado se liofilizó. El material liofilizado se disolvió en agua desionizada para crear una solución stock con concentración final de 2 % (p/v) para la síntesis verde descrita en la siguiente sección.

Síntesis de nanoesferas de oro usando extracto

El proceso de síntesis de nanoesferas se ilustra en la Fig. 1a. La solución stock descrita en la sección anterior se usó para la síntesis. En un vial de vidrio, el extracto (concentración final 0,03 %) y ácido cloroáurico trihidratado (concentración final 0,5 mM) se mezclaron, e hidróxido de sodio (concentración final 1 mM) se añadió. Agua desionizada se añadió para hacer un volumen final de 2 mL. La incubación en horno se realizó en horno seco a 80 °C durante 2 h. La resonancia de plasmón de superficie (SPR) de las nanoesferas se monitoreó adquiriendo espectros UV-visible en el rango 300–800 nm. Las nanoesferas también se usaron como semillas para la síntesis de nanoestrellas descrita en la siguiente sección.

Síntesis de nanoestrellas de oro

El proceso de síntesis de nanoestrellas se ilustra en la Fig. 2a. Las nanoesferas (50 µL) sintetizadas como se describió en la sección anterior se agitaron (750 rpm) con una barra magnética en una placa caliente a temperatura ambiente. Ácido cloroáurico trihidratado (0,25 mM, 5 mL) se añadió a esta solución. Tras 15 s, dos soluciones se añadieron simultáneamente: nitrato de plata (1 mM, 50 µL) y ácido ascórbico (recién preparado, 100 mM, 25 µL). Luego, la mezcla se agitó a 750 rpm durante 5 min. Se adquirieron espectros UV-visible en el rango 300–1100 nm.

Síntesis de nanorodas de oro

El proceso de síntesis de nanorodas se ilustra en la Fig. 3a. Para la síntesis de nanorodas de oro, la síntesis mediada por semilla se realizó según un reporte previo con modificaciones menores [27]. La solución de crecimiento se preparó de la siguiente manera. En un vial de vidrio de 20 mL, ácido cloroáurico trihidratado (10 mM, 500 µL) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) se mezclaron. La solución fue amarillenta. Luego, ácido ascórbico (recién preparado, 100 mM, 55 µL) se añadió, y esta solución se agitó hasta que cambió de amarillenta a incolora. Nitrato de plata (10 mM, 100 µL) se añadió y se agitó durante 10 s. Esta solución final se etiquetó como solución de crecimiento. La solución semilla se sintetizó de la siguiente manera. En un vial de vidrio de 20 mL, ácido cloroáurico trihidratado (10 mM, 250 µL) y CTAB (100 mM, 9,75 mL) se mezclaron. Luego, borohidruro de sodio (10 mM, 600 µL) recién preparado y enfriado en hielo se añadió y se vortexó durante 2 min. La solución se etiquetó como solución semilla. La solución semilla (12 µL) se mezcló con una solución de crecimiento sintetizada previamente. Se adquirieron espectros UV-visible en el rango 400–900 nm.

Recubrimiento de quitosano de nanoesferas, nanoestrellas y nanorodas

El recubrimiento de quitosano se empleó para aumentar la estabilidad coloidal y biocompatibilidad de AuNPs. El quitosano se disolvió en ácido acético 1 %, y la concentración final se ajustó a 0,01 %. Luego, se realizó sonicación para disolver completamente el quitosano; esta solución se usó como solución stock para recubrimiento de quitosano en el siguiente procedimiento. Tanto nanoesferas como nanoestrellas sintetizadas previamente se recubrieron con la solución stock de quitosano (0,01 %). La solución stock de quitosano (30 %, v/v) se mezcló con la solución de AuNP (70 %, v/v). La mezcla se agitó a 900 rpm durante 2 h para completar el recubrimiento de quitosano. Para nanorodas, se usó exceso de CTAB, y así, centrifugación (14000 rpm, 15 min, 25 °C) se realizó para remover CTAB. Las nanorodas se recuperaron del pellet, y el recubrimiento de quitosano se realizó como se mencionó arriba. Luego, se adquirieron espectros UV-visible.

Evaluación de estabilidad coloidal

La estabilidad coloidal de nanopartículas es una preocupación importante para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Se probaron seis soluciones diferentes para estabilidad coloidal: (i) agua desionizada, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM, y (vi) medio completo (DMEM con 10 % FBS). Tras mezclar cada tipo de AuNPs con la solución de prueba, se adquirieron espectros UV-visible; los resultados se muestran en la Tabla 2 y Fig. 8. Se observó un desplazamiento hipocrómico junto con un ligero desplazamiento rojo o azul para los tres tipos de AuNPs en los espectros UV-visible (Fig. 8a, c, e). La forma de los espectros se mantuvo, y no se observó agregación de la solución coloidal (Fig. 8b, d, f). Este resultado demostró que la estabilidad coloidal se mantuvo bastante bien en las soluciones de prueba mencionadas.

Cultivo celular y citotoxicidad

Las siguientes líneas de células cancerígenas se compraron del Banco Coreano de Líneas Celulares (Seúl, República de Corea): AGS, HeLa, HepG2 y HT29. El ensayo MTT se realizó para evaluar la citotoxicidad in vitro de AuNPs. DMEM con piruvato de sodio se utilizó. El medio de cultivo celular contenía 10 % suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 1 % penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 unidades/mL). Las células se cultivaron en platos de cultivo de 100 mm y se mantuvieron a aproximadamente 70 % confluencia. Antes del cultivo celular, las AuNPs de tres formas diferentes se sometieron a evaporación al vacío para obtener una concentración final de Au de 5 mM. En placas de 96 pocillos, las células se sembraron a una densidad de 5,0 × 10³ células/pocillo, y la incubación se realizó durante 24 h en horno a 37 °C bajo atmósfera de CO₂ (5 %). Luego, cinco concentraciones diferentes de AuNPs (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62,5 µM y 31,25 µM) se trataron e incubaron en el horno durante otras 24 h a 37 °C bajo atmósfera de CO₂ (5 %). Luego, reactivo MTT (5 µL, 5 % en agua desionizada) se añadió e incubó en horno a 37 °C bajo atmósfera de CO₂ (5 %) durante 3 h adicionales. La absorbancia se midió a 570 nm usando un lector de multi-detección de fluorescencia (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.). Las células no tratadas se utilizaron como control.

Captación celular

La captación celular de cada tipo de AuNP se midió cuantitativamente usando células HepG2. En placas de 24 pocillos, las células se sembraron a una densidad de 5,0 × 10⁴ células/pocillo, y la incubación se realizó durante 24 h en horno a 37 °C bajo atmósfera de CO₂ (5 %). Luego, 5 µM (concentración final) de cada tipo de solución AuNP se trató e incubó en el horno durante 24 h adicionales a 37 °C bajo atmósfera de CO₂ (5 %). Tras la incubación, la solución conteniendo AuNPs en exceso se removió, y las células se trataron with tripsina. La concentración de Au en las células tripsinizadas se midió cuantitativamente por ICP-OES y LA-ICP-MS, lo que proporcionó la concentración de captación de Au en las células. El control fue 5 µM de la solución coloidal original de cada tipo de AuNP, que también se analizó por ICP-OES y LA-ICP-MS para obtener la concentración de Au.

Resultados y discusión

Espectros UV-visible

Los espectros UV-visible se adquieren comúnmente para confirmar la síntesis de AuNPs. La SPR característica de AuNPs puede observarse en el rango de longitud de onda visible-infrarrojo cercano. Además, el recubrimiento de AuNPs generalmente induce un desplazamiento batocrómico (rojo) o hipocrómico (azul). Además, un desplazamiento hipocrómico generalmente se induce junto con desplazamientos rojo y azul. Como se muestra en la Fig. 1b, los espectros UV-visible se monitorearon en un rango de 300–800 nm. Las nanoesferas mostraron una SPR característica de 532 nm con color burdeos intenso. Tras el recubrimiento de quitosano de nanoesferas, el SPR máximo se desplazó hacia el rojo a 537 nm junto con un desplazamiento hipocrómico (Fig. 1b). Un amplio rango de longitudes de onda SPR (600–800 nm) con solución azul oscuro se observaron para nanoestrellas (Fig. 2b). El recubrimiento de quitosano de nanoestrellas mostró un desplazamiento hipocrómico, donde la absorbancia fue menor que la de AuNPs sin recubrimiento (Fig. 2b). Las nanorodas mostraron dos longitudes de onda SPR distintas de 514 nm y 815 nm, con formación de solución rosa claro (Fig. 3b). El recubrimiento de quitosano de nanorodas indujo un desplazamiento azul a 797 nm junto con un desplazamiento hipocrómico (Fig. 3b). Considerando todos estos resultados, el recubrimiento de AuNPs con quitosano cambió la longitud de onda SPR e indujo desplazamientos. Un examen cuidadoso de los espectros UV-visible demostró que los tres tipos de AuNPs fueron recubiertos exitosamente con quitosano.

Tamaño hidrodinámico y potenciales zeta

Luego, se midieron el tamaño hidrodinámico y potenciales zeta; los resultados se muestran en la Tabla 1. Sin recubrimiento de quitosano, los tamaños hidrodinámicos de nanoesferas y nanoestrellas fueron 28,4 y 97,8 nm, respectivamente. El tamaño hidrodinámico de nanorodas no se midió porque se ajustó bien a las formas esféricas de las nanopartículas. Con recubrimiento de quitosano, el tamaño hidrodinámico aumentó a 190,7 nm para nanoesferas y a 123,9 nm para nanoestrellas. El recubrimiento de quitosano se confirmó por un aumento en el tamaño hidrodinámico. El cambio en potenciales zeta también reflejó el recubrimiento de quitosano en la superficie de AuNPs. El quitosano es un polisacárido cargado positivamente; así, el recubrimiento de quitosano resultó en potenciales zeta positivos para los tres tipos de AuNPs. Para nanoesferas, el potencial zeta cambió de −12,73 a 42,28 mV. El potencial zeta de nanoestrellas cambió de −42,46 a 47,44 mV. En el caso de nanorodas, CTAB (un surfactante catiónico) se utilizó para síntesis. Así, el potencial zeta original fue 27,96 mV sin recubrimiento. El recubrimiento de quitosano de nanorodas aumentó el potencial zeta a 33,23 mV. Por tanto, el cambio en potenciales zeta de valores negativos a positivos para nanoesferas y nanoestrellas indicó claramente recubrimiento exitoso con quitosano. Además, el potencial zeta de nanorodas aumentó, sugiriendo que la superficie fue recubierta con quitosano.

Imágenes HR-TEM

La microscopía es crucial para la investigación de nanopartículas, proporcionando información esencial sobre el tamaño y forma de nanopartículas. Las herramientas de microscopía entregan una gama de información detallada, como estado de dispersión, morfología y topografía bi- y tridimensional, y blandura/dureza relativa de materiales. Las nanoesferas midieron 8,7 ± 1,7 nm, basado en el promedio de 75 nanopartículas discretas seleccionadas al azar en imágenes HR-TEM (Fig. 4). El tamaño más abundante fue 8–9 nm (29,3 %), seguido de 9–10 nm (12,0 %). Con recubrimiento de quitosano, la forma de las nanoesferas se conservó sin ningún cambio en la forma (Fig. 4c, d). La naturaleza cristalina de las partículas fue claramente indicada por las estructuras de red mostradas en la Fig. 4d. La distancia entre redes vecinas se midió en 0,24 nm (Fig. 4d). Además, la capa de quitosano también se visualizó, como indican las flechas rojas en la Fig. 4d. Las nanoestrellas se visualizaron por HR-TEM, como se muestra en la Fig. 5. Las nanoestrellas midieron 99,0 ± 47,0 nm, representando el promedio de 19 nanopartículas discretas. La estructura de red se indica en una imagen ampliada (Fig. 5c). Como se muestra, la distancia entre redes vecinas se midió en 0,24 nm (Fig. 5c). Las flechas rojas en la Fig. 5c indican la capa de quitosano. Las nanorodas se visualizaron como se muestra en la Fig. 6. La longitud y anchura promedio de partícula fueron 60,4 nm y 16,4 nm, respectivamente, según mediciones hechas para 28 partículas. La relación de aspecto, definida como longitud de partícula dividida por anchura de partícula, fue 3,7. La estructura de red se muestra en la Fig. 6c, confirmando la estructura cristalina de las nanorodas. La distancia entre redes vecinas se midió en 0,23 nm (Fig. 6c). Las flechas rojas indican la capa de quitosano (Fig. 6c).

Espectros FT-IR

El té verde contiene diversos metabolitos primarios y secundarios. Específicamente, los constituyentes principales del té verde son polifenoles, incluyendo epigalocatequina-3-galato, (-)-epicatequina-3-galato, (-)-epigalocatequina y (-)-epicatequina [28]. Los espectros FT-IR se adquirieron para obtener información sobre grupos funcionales que contribuyeron a la síntesis de AuNPs. Comparamos el espectro FT-IR de nanoesferas con el espectro del extracto (Fig. 7). El grupo funcional principal que más probablemente participó en la reacción de reducción de sales de Au fue –OH. En el extracto, grupos funcionales –OH aparecieron a 3255 cm⁻¹ (Fig. 7a). Tras la síntesis, este pico se desplazó a un número de onda más alto a 3300–3341 cm⁻¹. Este resultado demostró que grupos funcionales –OH originados de polifenoles se oxidaron a C=O mientras reducían sales de Au a AuNPs. Notablemente, la aparición de grupos funcionales C=O a 1716 cm⁻¹ en nanoesferas apoyó claramente la oxidación de grupos funcionales –OH durante la síntesis (Fig. 7b).

Evaluación de estabilidad coloidal bajo diversas soluciones

La estabilidad coloidal de nanopartículas es una preocupación importante para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Se probaron seis soluciones diferentes para estabilidad coloidal: (i) agua desionizada, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM, y (vi) medio completo (DMEM con 10 % FBS). Tras mezclar cada tipo de AuNPs con la solución de prueba, se adquirieron espectros UV-visible; los resultados se muestran en la Tabla 2 y Fig. 8. Se observó un desplazamiento hipocrómico junto con un ligero desplazamiento rojo o azul para los tres tipos de AuNPs en los espectros UV-visible (Fig. 8a, c, e). La forma de los espectros se mantuvo, y no se observó agregación de la solución coloidal (Fig. 8b, d, f). Este resultado demostró que la estabilidad coloidal se mantuvo bastante bien en las soluciones de prueba mencionadas.

En la Tabla 2, el desplazamiento hipocrómico se expresa como porcentaje de absorbancia retenida, con la absorbancia de la solución original establecida en 100 %. En los tres AuNPs, la estabilidad coloidal se retuvo mejor en medio completo, que se usó para los experimentos de citotoxicidad subsiguientes: nanoesferas (65,3 %), nanoestrellas (93,4 %) y nanorodas (80,2 %). La solución de proteína, BSA (5 %), también proporcionó estabilidad coloidal razonable: nanoesferas (61,8 %), nanoestrellas (70,2 %) y nanorodas (72,0 %). Estos resultados indicaron que las proteínas que cubren las nanopartículas tienen efectos beneficiosos adicionales en la estabilidad coloidal de AuNPs junto con el recubrimiento de quitosano. La estabilidad coloidal de nanoesferas sin recubrimiento de quitosano también se evaluó (Fig. 8g, h). Todas las soluciones indujeron un desplazamiento hipocrómico. Entre las soluciones probadas, solo la solución NaCl (5 %) mostró un gran desplazamiento rojo junto con un desplazamiento hipocrómico.

Citotoxicidad

Se realizó un ensayo MTT para medir citotoxicidad contra cuatro tipos de células cancerígenas (Fig. 9): AGS, HeLa, HepG2 y HT29. La citotoxicidad de los tres tipos de AuNPs dependió de la concentración de Au. Entre los cuatro tipos de células, la citotoxicidad más alta se observó para células HepG2. Además, las nanorodas mostraron la mayor toxicidad contra los cuatro tipos de células, seguidas de nanoestrellas y finalmente nanoesferas. Específicamente, las nanorodas mostraron toxicidad muy alta; así, la citotoxicidad de nanorodas conteniendo un rango bajo de concentraciones de Au también se evaluó (Fig. 9e). A concentraciones tan bajas como 8 µM Au, las nanorodas mostraron citotoxicidad dependiente de concentración. Contra células HepG2, el valor IC₅₀ fue 127,1 µM Au para nanoesferas, 81,8 µM Au para nanoestrellas y 22,7 µM Au para nanorodas. Así, las nanorodas fueron las más citotóxicas, seguidas de nanoestrellas, y las nanoesferas fueron las menos citotóxicas contra células HepG2.

Se ha reportado que la citotoxicidad de AuNPs se ve afectada por tamaño, forma y carga superficial [29, 30]. Favi y colaboradores investigaron la citotoxicidad de nanoesferas de Au (61 nm) y nanoestrellas de Au (34 nm) contra dos tipos de células (fibroblastos de piel humana y células endoteliales de almohadilla de grasa de rata) [31]. En ambos tipos de células, una concentración letal se observó a 40 µg/mL para nanoesferas y a 400 µg/mL para nanoestrellas. Sus resultados sugirieron que las nanoesferas eran más citotóxicas que las nanoestrellas, sugiriendo que tamaño, forma y química superficial son muy probablemente influyentes en la citotoxicidad de AuNPs. Woźniak y colaboradores reportaron la citotoxicidad de AuNPs con formas diversas contra HeLa y HEK293T (células renales embrionarias humanas), a saber, nanoesferas (~10 nm), nanoflores (~370 nm), nanorodas (~41 nm), nanoprismas (~160 nm) y nanoestrellas (~240 nm) [30]. Curiosamente, nanoesferas y nanorodas fueron más citotóxicas que nanoflores, nanoprismas y nanoestrellas. Los autores explicaron que el tamaño pequeño de las nanopartículas y el proceso de agregación fueron las principales fuerzas impulsoras para la citotoxicidad de nanoesferas y nanorodas en su trabajo. En efecto, muchos estudios han abordado el efecto del tamaño de AuNPs en la citotoxicidad [32, 33]. A medida que AuNPs se vuelven más pequeños, su captación por células aumenta. Esta mayor captación resulta en una mayor concentración de AuNPs en la célula, lo que lleva a mayor citotoxicidad contra células. Sin embargo, una baja concentración de AuNPs en la célula también muestra alta citotoxicidad [34]. La concentración de AuNPs en la célula afecta la citotoxicidad; sin embargo, es vital considerar y entender las características de AuNPs. La citotoxicidad de AuNPs de dos formas diferentes (nanoesferas 43 nm, nanorodas 38 × 17 nm) se evaluó en células epiteliales por Tarantola y colaboradores [35]. Las nanoesferas se determinaron más citotóxicas que las nanorodas. Además, las nanoesferas indujeron disfunción en membranas de células epiteliales, medida por detección de impedancia de sustrato de célula eléctrica [35]. Como se discutió previamente, muchos estudios investigan actualmente la citotoxicidad de diferentes formas de AuNPs en diversas células. Aunque las formas de AuNPs puedan permanecer iguales, muchos factores aún afectan la citotoxicidad de AuNPs. Al evaluar citotoxicidad, factores incluyendo tamaño, forma, propiedades fisicoquímicas de superficie, concentración, tiempo de exposición y tipo de célula también deben considerarse [34, 36,37,38]. Además de las características de AuNPs, mecanismos citotóxicos incluyendo disrupción de membrana celular, estrés oxidativo, destrucción del citoesqueleto y pérdida de función mitocondrial también son importantes [38, 39]. Actualmente, autofagia y disfunción lisosomal están emergiendo como explicaciones de la citotoxicidad de nanomateriales [40]. En lisosomas, nanomateriales inducen citotoxicidad por estrés oxidativo mediado por hierro lisosomal y liberación de cathepsinas y otras hidrolasas lisosomales asociadas, lo que causa disfunción mitocondrial y muerte celular. En el informe actual, las nanorodas fueron las más citotóxicas contra los cuatro tipos de células cancerígenas probadas. Así, nuestro trabajo futuro examinará los mecanismos detallados de citotoxicidad.

Captación celular en células HepG2

Las células HepG2 mostraron la citotoxicidad más alta entre los cuatro tipos de células cancerígenas; en consecuencia, seleccionamos este tipo de célula para evaluar captación celular. Dos instrumentos, ICP-OES y LA-ICP-MS, se usaron para analizar cuantitativamente la concentración de Au en células, y los resultados se muestran en la Fig. 10. Una concentración de Au de 5 µM se usó para evaluar captación celular porque no se observó toxicidad a esta concentración entre los cuatro tipos de células cancerígenas. La captación fue más alta para nanoesferas (58,0 %), seguida de nanorodas (52,7 %) y nanoestrellas (41,5 %). Como se indicó en la sección previa, la citotoxicidad dependió de la forma de partícula (nanorodas > nanoestrellas > nanoesferas). Sin embargo, el orden de captación celular (nanoesferas > nanorodas > nanoestrellas) no coincidió con el orden de citotoxicidad. La captación celular de nanoesferas fue la más alta; sin embargo, la citotoxicidad de estas partículas fue la más baja. Estos resultados sugieren que alta captación celular no siempre induce alta citotoxicidad. Como se mencionó previamente, diversos factores incluyendo tamaño, forma, propiedades fisicoquímicas de superficie, concentración, tiempo de exposición y tipo de célula son importantes para influir en la citotoxicidad.

Los diferentes grados de captación de los tres tipos de AuNPs (41,5–58,0 %) posiblemente dependen de la competencia entre envoltura (es decir, cómo una membrana encierra una nanopartícula) bajo una fuerza impulsora termodinámica y cinética de difusión de receptores [41, 42]. Chithrani y Chan compararon la captación celular de nanoesferas de Au recubiertas con transferrina y nanorodas de Au por células HeLa [42]. Al mismo tamaño (es decir, mismo valor para diámetro de nanoesfera y anchura de nanoroda), las nanoesferas mostraron mayor captación que las nanorodas. Este resultado es consistente con nuestras observaciones en el informe actual de mayor captación de nanoesferas comparado con nanorodas. Para captación de nanorodas, la anchura es más importante que la longitud, y una relación de aspecto creciente disminuye la tasa de captación [42]. El tamaño de nanoestrellas fue 99,0 ± 47,0 nm, haciéndolas las partículas más grandes entre los tres tipos de AuNPs. Para nanopartículas grandes (> 50 nm), la cinética lenta de difusión de receptores lleva a tiempos de envoltura cortos [42]. Así, la captación celular de nanopartículas grandes es baja, es decir, nanoestrellas en el informe actual. El quitosano se usó para recubrir AuNPs para aumentar su estabilidad coloidal y biocompatibilidad. El recubrimiento de quitosano también puede jugar un papel en la captación celular de AuNPs al interactuar con receptores en la superficie celular. Un estudio mecánico detallado es necesario para elucidar este asunto.

Conclusión

El continuo desarrollo de la nanotecnología requiere diseños elaborados de forma y tamaño de nanopartículas para aplicaciones exitosas, incluyendo como vehículos de administración de fármacos o portadores para compuestos biológicamente activos como agentes anticancerígenos. El extracto de té verde se usó como agente reductor verde para la síntesis de nanoesferas y nanoestrellas de Au. Curiosamente, la citotoxicidad de nanorodas fue mayor que la de nanoesferas y nanoestrellas, mientras que las nanoesferas mostraron la menor citotoxicidad contra cuatro tipos de células cancerígenas. La captación celular por células HepG2 dependió muy probablemente de forma y tamaño; las nanoesferas mostraron la mayor captación por las células, mientras que las nanoestrellas mostraron la menor. La optimización de tamaño y forma junto con modificación de superficie y funcionalización llevará al desarrollo de nanopartículas para uso futuro en nanomedicina.