Nanopartículas de sílice para la administración intracelular de proteínas:un nuevo enfoque de síntesis que utiliza proteína verde fluorescente

Métodos

Materiales

Todos los productos químicos se utilizaron tal como se adquirieron en Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania) y sin purificación adicional. Para todos los pasos de síntesis y purificación, se utilizó agua ultrapura (18,2 MΩ, sistema de purificación de agua Milli-Q tipo ELIX 20, Millipore Corp., EE. UU.).

Preparación de GFP

La GFP se obtuvo mediante la expresión de proteínas y su posterior purificación, como se describe en otra parte [22]. Brevemente, GFP que incluye una etiqueta His6 N-terminal se expresó usando un vector de expresión bacteriana de alto nivel basado en el sistema de vector pQE (Qiagen, Hilden, Alemania) en E. coli XL1-Blue y purificado mediante cromatografía de afinidad cargada con Ni (Qiagen, Hilden, Alemania). Posteriormente, la proteína se transfirió a un dispositivo concentrador (membrana de corte de peso molecular de 3 kDa (MWCO), Pall, Dreieich, Alemania) para el intercambio de tampón. La GFP se lavó tres veces mediante la adición de 15 ml de solución de ʟ-arginina y bicarbonato de sodio, respectivamente, y posteriormente se recuperó en 3 ml de la solución de ʟ-arginina / bicarbonato de sodio. Después de eso, la suspensión de GFP se filtró en tubos estériles a través de filtros estériles de acetato de celulosa de 0,22 µm (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania). Antes de su uso, la concentración de proteína se ajustó a 1 mg mL ⁻¹ en 7,2 mmol L ⁻¹ ʟ-arginina (pH =10,3) o 10,0 mmol L ⁻¹ NaHCO ₃ (pH =9.2) solución.

Síntesis y purificación de nanopartículas

Las nanopartículas de sílice se prepararon de acuerdo con un protocolo modificado descrito anteriormente [23]. Brevemente, el tetraetoxisilano (TEOS), utilizado como precursor apolar, se hidrolizó en un sistema bifásico de agua / ciclohexano mediado por catálisis de ʟ-arginina.

Preparación de partículas centrales

En un matraz de fondo redondo de tres bocas, se disolvieron 91 mg (0,52 mmol) de ʟ-arginina en 69 ml de agua, antes de añadir 4,5 ml de ciclohexano como capa superior. La mezcla de reacción se calentó a 40ºC con agitación. Después de la adición de 5,5 ml (24,63 mmol) de TEOS, la mezcla se mantuvo en estas condiciones durante 20 h más.

Capas de caparazón de sílice

Para los pasos posteriores de crecimiento de la cáscara, se utilizaron las partículas del núcleo o las partículas resultantes del primer paso de crecimiento de la cáscara. Para el crecimiento de la cáscara, se disolvieron 14 mg (0.08 mmol) de ʟ-arginina en 36 mL de agua y se agregaron 10 mL de dispersiones de partículas previamente preparadas. Después de la adición de 5 ml de ciclohexano, la mezcla se calentó a 40ºC. Después de la adición de 3,52 ml (15,8 mmol) de TEOS, la mezcla se agitó durante 20 h más.

Preparación de nanopartículas dopadas con GFP. Para la preparación de nanopartículas dopadas con GFP, 30 min después de la adición de TEOS, se agregaron 200 μg (6,9 nmol) de GFP.

Purificación de partículas

Las nanopartículas se purificaron mediante diálisis posterior contra agua (4 L, intercambio de agua a los 30, 90 y 180 min) durante 4 h utilizando una membrana de hidrato de celulosa (tubo de diálisis Nadir, MWCO 10 kDa, Carl Roth, Karlsruhe, Alemania). Finalmente, las nanopartículas se filtraron en matraces estériles utilizando filtros de membrana de acetato de celulosa estériles de 0,22 µm (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania).

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

La morfología y el diámetro medio de partícula se determinaron utilizando un microscopio JEM-2100F (JEOL, Freising, Alemania). La distribución del tamaño de partícula se determinó en una muestra aleatoria de 50 nanopartículas utilizando el software X-ImageJ (Versión:1.45 s, winPenPack X-ImageJ Launcher del Instituto Nacional de Salud (http://rsb.info.nih.gov/ij /).

Diámetro hidrodinámico

El diámetro hidrodinámico de las nanopartículas se registró utilizando un Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments, Herrenberg, Alemania). Antes de las mediciones, las dispersiones de partículas se diluyeron 1:10 en agua. Las mediciones se realizaron a 25 ° C. Cada muestra se midió 3 x 15 veces. El diámetro se determinó mediante el cálculo de la distribución de volumen. Esto se convirtió a partir de la distribución del tamaño de la intensidad utilizando la teoría de Mie.

ζ-potencial

El potencial ζ se midió utilizando el mismo instrumento con las condiciones descritas anteriormente, excepto que las muestras se diluyeron en KCl 0,01 M (9:1).

Ultracentrifugación analítica (AUC)

Para medir la velocidad de sedimentación, un Beckman-Coulter XL-80 K modificado con un rotor AnTi60. Para los experimentos, la temperatura se estableció en 20 ° C, la velocidad se estableció en 10,000 rpm y se realizaron 21 exploraciones. Las longitudes de onda se establecieron en 261 nm para sílice y 488 nm para detección de GFP.

Espectroscopia de fluorescencia

Los espectros de fluorescencia de nanopartículas, GFP pura y filtrados de experimentos de lixiviación se registraron utilizando el espectrofluorómetro Fluoromax-3 (Spex, Horiba Scientific, Oberursel, Alemania). Para las mediciones, la GFP pura, las dispersiones de partículas y el filtrado se diluyeron 1:10 en agua. La longitud de onda de excitación se estableció en 488 nm y el espectro se registró en un rango espectral de 498 a 800 nm.

Rendimientos cuánticos de fluorescencia

Los rendimientos cuánticos de las nanopartículas obtenidas y la GFP pura se determinaron utilizando el método relativo de Williamson et al. [24]. Como referencia para GFP, se utilizaron rodamina 6G y Atto488. Se tomaron medidas comparativas utilizando nanopartículas no dopadas que se han mezclado con el colorante de referencia. Los espectros de fluorescencia se registraron usando una longitud de onda de excitación de 450 nm. Se tomaron mediciones adicionales de UV / vis usando un Varian Cary 300 Scan UV (Agilent Technologies, Darmstadt, Alemania).

Para el cálculo del rendimiento cuántico, Eq. Se utilizó 2.

Aquí, φ _P es el rendimiento cuántico del producto, φ _S el rendimiento cuántico de la referencia. Los términos pendiente _S y pendiente _P representan las pendientes derivadas de los gráficos de intensidad de fluorescencia integrada frente a absorbancia de referencia y producto, respectivamente. n _P y n _S corresponden al índice de refracción del disolvente utilizado [25].

Fuga de proteínas

Para los experimentos de lixiviación, se ultrafiltraron dispersiones de partículas sin diluir a través de membranas de poliéter sulfona modificadas (MWCO =100 kDa o 300 kDa, Pall, Dreieich, Alemania) mediante centrifugación (16.000 g, 5 min).

Estabilidad térmica

Para el análisis de la estabilidad térmica, las nanopartículas y la GFP pura se mantuvieron durante 0 y 24 horas a 20 o 60 ° C. Las nanopartículas y la GFP pura se diluyeron como se describe anteriormente.

Fotoblanqueo

Para investigar la estabilidad de las nanopartículas dopadas con GFP y la GFP pura contra el fotoblanqueo, las soluciones se expusieron a la luz emitida por siete LED verdes durante un período de tiempo de hasta 20 minutos. La intensidad de fluorescencia de las muestras tomadas en t =Se midió 0, 2 y 20 min.

Estabilidad frente a la degradación de proteínas

Para determinar la estabilidad de la GFP contra la proteinasa K, las nanopartículas de sílice sin etiquetar de GFP pura (C _U S _1U S _2U ) con GFP adicional y nanopartículas de sílice etiquetadas tres veces (C _F S _1F S _2F ) se utilizaron en las mismas concentraciones de GFP y la misma cantidad de partículas. Todas las muestras se diluyeron 1:100. Para la cantidad de 10 moléculas de GFP, se eligió una molécula de proteinasa K. Antes de la adición de la enzima, se midió una muestra con las condiciones anteriores. Después de la adición, las mediciones se realizaron después de t =0, 15, 30, 45, 60 y 90 min.

Experimentos de captación celular

Para determinar la internalización de nanopartículas y GFP por parte de las células, se llevaron a cabo experimentos de captación celular utilizando la línea celular de carcinoma de pulmón A549 (ACC-107).

Cultivo de células

Se cultivaron células A549 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) en matraces T75 (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania) utilizando medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Thermo-Fisher-Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Que contenía un 10% de fetal suero de ternera (FCS). 2 × 10 ⁴ cm ⁻² Se sembraron células A549 en cubreobjetos en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Luego, las células se trataron con nanopartículas dopadas con GFP y solución de GFP en 1 ml de medio durante 24 h. El SiO ₂ la concentración de las nanopartículas fue de 37 μg mL ⁻¹ mientras que la concentración de GFP fue de 5 μg mL ⁻¹ tanto para nanopartículas como para GFP pura. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Preparación de muestras e imágenes confocales

Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Para la tinción de la membrana celular, WGA conjugado con tetrametilrodamina (aglutinina de germen de trigo (2 μg mL ⁻¹ (en PBS), W849, Thermo-Fisher-Scientific (Invitrogen), Waltham, MA, EE. UU.) y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con PBS, las células se lavaron tres veces con PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio con Mowiol / DABCO (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania).

Las imágenes confocales se tomaron en un sistema TCS SP5 (Leica, Wetzlar, Alemania). Para obtener imágenes, un objetivo de inmersión en aceite de 63 × ( n =1,518). Se tomaron exploraciones secuenciales utilizando la línea láser de iones de argón en λ =488 nm (25%) para la excitación de GFP y un láser de estado sólido bombeado por diodos en λ =561 nm (25%) para la excitación de tetrametilrodamina.

Resultados y discusión

Este estudio tiene como objetivo funcionalizar nanopartículas de sílice con GFP en condiciones adecuadas que mantengan las características bioquímicas y la funcionalidad de la proteína. En un trabajo anterior, sintetizamos nanopartículas de sílice fluorescente monodispersas dopadas con colorante IR cercano en el rango de tamaño entre 15 y 80 nm, utilizando una hidrólisis controlada de ʟ-arginina de tetraetoxisilano (TEOS) en un sistema bifásico ciclohexano / agua [26]. Aquí, hemos adoptado este procedimiento de síntesis para incrustar GFP, como una proteína modelo, en la matriz de sílice. En el esquema 1, se representa esquemáticamente el procedimiento para la síntesis de partículas. Las estructuras dopadas con GFP y no dopadas (núcleo / conchas) se resaltan en verde y gris, respectivamente. En un primer paso, las partículas de núcleo de sílice dopadas con GFP (C _F ) se obtuvieron. Pasos posteriores para el recrecimiento (C _F S ₁ y C _F S ₁ S ₂ ) permitió la síntesis de partículas de mayor tamaño. Durante el primer paso de rebrote, la cáscara se modificó con (C _F S _1F ) o sin (C _F S _1U ) incorporación de proteína. De manera similar, en el segundo paso de rebrote, una etiqueta (C _F S _1F S _2F , C _F S _1U S _2F ) o sin etiqueta (C _F S _1F S _2U , C _F S _1U S _2U ) se añadió cáscara. Estas variaciones permiten un excelente control sobre la cantidad de proteína incrustada y su disposición personalizada en las capas designadas o el núcleo de partículas. Además, las nanopartículas de sílice pura sin GFP incrustado (C _U , C _U S _1U y C _U S _1U S _2U ) se sintetizaron para investigar una posible influencia de la proteína incrustada en las propiedades de las partículas. Además, para todos estos pasos, la GFP se disolvió en dos sistemas tampón diferentes (ʟ-arginina y NaHCO ₃ ) de varios valores de pH, para determinar la influencia del solvente proteico en la síntesis de partículas, la morfología, la intensidad de fluorescencia, la longitud de onda de emisión y el potencial ζ.

Descripción general de las partículas sintetizadas y su estructura de partículas. El color verde indica la incrustación de GFP en el núcleo o en las cáscaras, respectivamente. El color gris representa las conchas sin GFP (C _F =Núcleo fluorescente, C _U =Núcleo sin etiquetar, S _F =Caparazón fluorescente, S _U =Shell sin etiquetar, S ₁ =Primera capa de caparazón, S ₂ =Segunda capa de caparazón)

Caracterización de nanopartículas

Determinación de los atributos de partículas físicas

Para describir el tamaño de partícula y la morfología después de la incorporación de GFP y para determinar la influencia de los dos diferentes sistemas de amortiguación en estas propiedades, se registraron imágenes TEM (Fig. 1). Más imágenes TEM de GFP (NaHCO ₃ ) modificado, GFP (ʟ-arginina) modificado y nanopartículas sin etiquetar se presentan en el SI (Archivo adicional 1:Figura S1, Archivo adicional 2:Figura S2, Archivo adicional 3:Figura S3, Archivo adicional 4:Figura S4). Siguiendo el procedimiento de síntesis con dos pasos de rebrote, se obtuvieron tres tamaños de partículas diferentes. Las partículas del núcleo tenían un tamaño de aproximadamente 15 nm, las partículas después del primer paso de rebrote aproximadamente 22 nm y las partículas después del segundo paso aproximadamente 32 nm. En resumen, todas las nanopartículas eran aproximadamente esféricas y exhibían una distribución de tamaño estrecha ( p <10%). Las tres generaciones de nanopartículas de GFP (ʟ-arginina) completamente teñidas (C _F , C _F S _1F y C _F S _1F S _2F ) y GFP (NaHCO ₃ ) (C _F ) nanopartículas centrales fueron elegidas como modelo.

Imágenes TEM de tres generaciones de nanopartículas modificadas con GFP-ʟ-arginina y partículas centrales de GFP (NaHCO ₃ ) nanopartículas modificadas. En a , c y d , se muestran las tres generaciones de GFP (ʟ-arginina):C _F partículas de núcleo ( a , d _TEM =15,5 ± 1,1 nm); C _F S _1F nanopartículas después del primer paso de rebrote (núcleo + caparazón 1) ( c , d _TEM =23,5 ± 2,0 nm) y C _F S _1F S _2F después del segundo paso de rebrote (núcleo + caparazón 1 + caparazón 2) ( d , d _TEM =35,3 ± 2,0 nm). En b , el GFP (NaHCO ₃ ) nanopartículas de núcleo marcadas (d _TEM =15,2 ± 1,2 nm) se muestran

Al comparar los tamaños de las diferentes nanopartículas dopadas con GFP y no marcadas (Tabla 1), cabe destacar que el mismo número de pasos de recrecimiento dio como resultado el mismo tamaño medio de partícula, independientemente de la presencia de proteína o de la solución tampón utilizada. Las partículas sin etiquetar también tenían tamaños similares (C _U :d _TEM =13,4 ± 0,4 nm, d _DLS =10 ± 3 nm; C _U S _1U :d _TEM =20,9 ± 1,3 nm, d _DLS =20 ± 6 nm; C _U S _1U S _2U :d _TEM =33,2 ± 1,0 nm, d _DLS =38 ± 10 nm).

En conclusión, se demostró que la incorporación de proteína a la matriz de sílice y la solución tampón, en la que se proporcionó la proteína, no tuvo una influencia significativa en el tamaño y morfología de las partículas resultantes.

Hasta donde sabemos, no hay otras nanopartículas de sílice incluidas en GFP descritas en la literatura, que exhiban tamaños pequeños similares, así como distribuciones de tamaño igualmente estrechas (<10%) [20, 27]. Estas pequeñas nanopartículas tienen un potencial de aplicación prometedor en el campo de la administración de proteínas intracelulares, así como en el diagnóstico y la terapia del cáncer [28].

ζ-Potencial

El potencial ζ de todas las nanopartículas se determinó mediante cálculos utilizando su movilidad electroforética. Todos los tipos de nanopartículas dopadas exhibieron un potencial ζ negativo con valores absolutos en el rango de - 28 a - 36 mV (Fig. 2). En comparación, el potencial ζ de las partículas no marcadas indica valores muy similares con - 35,5 ± 2,0 mV para las partículas del núcleo, - 34,0 ± 3,7 mV después del primer paso de rebrote y - 34,5 ± 1,2 mV después del segundo paso de rebrote. Estos valores de potencial ζ altamente negativos (<- 28 mV) indican una alta estabilidad de las nanopartículas frente a la aglomeración debida a la repulsión electrostática. En comparación con el potencial ζ de las nanopartículas no etiquetadas, los datos indican que ni el tamaño de partícula resultante ni la incorporación de GFP en la matriz de partículas del núcleo o la cáscara de las partículas tuvieron una influencia significativa en la carga de las partículas.

Potencial ζ [mV] de nanopartículas marcadas. Las nanopartículas se prepararon a partir de GFP disuelto en ʟ-arginina 7,2 mM o NaHCO ₃ 10 mM . Barras de error indicar la desviación estándar derivada de tres mediciones

Estudios de espectroscopia

Espectroscopia de fluorescencia

Todas las nanopartículas de sílice dopadas con GFP exhibieron un máximo de emisión similar ( λ _em =508 nm), que también era comparable al máximo de emisión de GFP libre (SI, archivo adicional 5:Figura S5). Para comparar la intensidad de fluorescencia de las distintas nanopartículas marcadas, se normalizó la concentración de nanopartículas (cálculos en SI 5.). Como era de esperar, la adición escalonada de conchas marcadas provocó un aumento en la fluorescencia de las nanopartículas (Fig. 3).

Intensidad de fluorescencia normalizada del máximo de emisión a 508 nm, para cada uno de los distintos sistemas de partículas. Además, la intensidad de fluorescencia teórica ( puntos grises ) de las partículas en relación con el aumento del volumen de partículas

Las nanopartículas con un núcleo marcado únicamente, pero con cubiertas no dopadas, exhibieron la fluorescencia más baja. Las nanopartículas con una capa adicional marcada exhibieron una fluorescencia intermedia, y las nanopartículas con dos capas marcadas mostraron la fluorescencia más fuerte (Fig. 3). Sorprendentemente, la adición de una capa exterior no dopada pareció reducir ligeramente la fluorescencia de las nanopartículas en comparación con las nanopartículas que poseen una capa exterior dopada. Este efecto puede ser provocado por los efectos de protección de la capa de sílice sin marcar. En resumen, la adición de conchas dopadas con GFP a las partículas del núcleo provocó un aumento en la intensidad de la fluorescencia de las nanopartículas resultantes que parecía estar correlacionado con el cambio de volumen que acompaña al crecimiento de las nanopartículas.

La incrustación de GFP disuelta inicialmente en ʟ-arginina después de la purificación dio como resultado una intensidad de fluorescencia 1,3 veces mayor de las nanopartículas resultantes en comparación con las nanopartículas obtenidas mediante el proceso de incrustación análoga a partir de GFP disuelto en NaHCO ₃ . De manera similar, la GFP diluida en ʟ-arginina mostró una mayor intensidad de fluorescencia en comparación con la GFP diluida en NaHCO ₃ (Archivo adicional 5:Figura S5). El efecto podría explicarse por los diferentes valores de pH de los tampones (pH _ʟ-arginina =10,3, pH \ (_ {{\ mathrm {NaHCO}} _ 3} \) =9,2).

Por esta razón, la fluorescencia de la GFP pura se midió sistemáticamente en función del valor de pH (SI, archivo adicional 6:Figura S6). Los datos mostraron un aumento de la fluorescencia en forma hiperbólica con el aumento del pH en el rango de pH 5,5 - 10,5. Los resultados son consistentes con otros informes sobre la fluorescencia de GFP dependiente del pH. Para GFP de tipo salvaje, se ha informado que la fluorescencia no se altera en el rango de pH 6 - 10, pero disminuye a un pH más bajo y aumenta a valores de pH> 10 [29]. Además, la sensibilidad al pH de la GFP podría modificarse mediante la introducción de mutaciones puntuales [30]. La GFP utilizada en este estudio posee mutaciones de tres puntos en comparación con Aequorea proteína de tipo salvaje, a saber, S2A, F64L, S65T. De estos, se ha demostrado que la sustitución de serina en la posición 65 por treonina aumenta la intensidad de fluorescencia de la proteína, cuando se excita a 480 nm, ya que este aminoácido participa en la formación del cromóforo. Además, la variante S65T / F64L exhibe una fluorescencia dependiente del pH [30]. Las nanopartículas dopadas con GFP (C _F ) exhibió una fluorescencia dependiente del pH comparable (Fig. 3), lo que indica que el mecanismo de dependencia del pH no se vio afectado por el proceso de inclusión.

Rendimiento cuántico de fluorescencia

Para caracterizar aún más las propiedades de las nanopartículas fluorescentes, se determinaron sus rendimientos cuánticos. Esto se logró trazando la intensidad de fluorescencia integrada frente a la absorbancia a 488 nm (Fig. 4). Posteriormente, los rendimientos cuánticos se calcularon utilizando la Ec. 2. Utilizando rodamina 6G como referencia, los rendimientos cuánticos de las nanopartículas C _F dopadas con GFP S _1F y se determinó que la GFP pura era φ \ (_ {{\ mathrm {C}} _ ​​{\ mathrm {F}} {\ mathrm {S}} _ {1 \ mathrm {F}}} \) =0.62 y φ _pureGFP =0,38, respectivamente. Los resultados se confirmaron utilizando Atto488 como segunda referencia (SI, archivo adicional 7:Figura S7). El mayor rendimiento cuántico de nanopartículas dopadas con GFP en comparación con la GFP pura parecía deberse a la encapsulación de GFP en la matriz de sílice y podría estar vinculado a la inmovilización espacial de la proteína o al entorno químico alterado proporcionado por la matriz de sílice. .

Gráficos de intensidad de fluorescencia integrada de partículas dopadas con GFP y GFP pura frente a absorbancia a 488 nm. Se utilizó rodamina 6G como referencia. La correlación lineal fue ajustada por las líneas rectas . Las ecuaciones lineales correspondientes son las siguientes: y _pureGFP =1,00554 × 10 ¹⁰ × x , R ² =0,97712; y \ (_ {C_F {S} _ {1F}} \) =6.12332 × 10 ⁹ × x , R ² =0,99331; y _rhodamin6G =4.1772 × 10 ⁹ × x , R ² =0,99678

Estabilidad de partículas

Fuga de proteínas

Se realizaron experimentos de lixiviación para demostrar la estabilidad de unión de las nanopartículas dopadas con GFP. Después de la ultrafiltración a través de membranas con un MWCO que permite el paso de GFP (MW ~ 27 kDa) pero retiene las nanopartículas, no se pudo detectar fluorescencia en el filtrado, lo que indica un acoplamiento permanente de GFP a la matriz de sílice.

Ultracentrifugación analítica

Para respaldar los resultados obtenidos y determinar el tipo de unión de GFP a la matriz de partículas, se llevó a cabo una ultracentrifugación analítica. Para este propósito, etiquetado C _F S _1F S _2F partículas y C _U sin etiquetar S _1U S_2U particles mixed with GFP were measured at the same particle and GFP concentrations. The results (Additional file 8:Figure S8 in the SI) indicate that most of the GFP molecules are embedded into the silica matrix during the synthesis.

Thermal Stability

To determine their thermal stability, the fluorescence signals of C_F in comparison to pure GFP were measured after incubation at room temperature and 60 °C respectively (Fig. 5). After 24 h at room temperature, no decrease in the fluorescence of both samples was detectable, indicating no influence on the protein stability. However, after 24 h at elevated temperature of 60 °C, only 20% of the initial fluorescence intensity of C_F could be observed, whereas no fluorescence signal of pure GFP reverted. This strongly indicates a higher thermal stability of GFP-embedded silica compared to pure GFP. Since an elevated temperature leads to a significant increase in the thermal motions of the protein molecule, which can disrupt its structure, it is hypothesised that the surrounding silica matrix protected the GFP against external influences by spatial constraints.

Influence of temperature (r.t., 60 °C) on the fluorescence of GFP-doped particles (C_F , ʟ-arginine) and pure GFP. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm versus time [h] is shown

Photostability

Furthermore, the photostability of the samples was tested. For measurements, the nanoparticle stock suspension (C_F , ʟ-arginine) was diluted tenfold. Pure GFP was diluted in ʟ-arginine according to the calculated concentration of GFP in the nanoparticle suspension. After exposure of the samples to light of a green LED array over a period of time up to 20 min, the fluorescence intensity was measured (Fig. 6). Within 20 min, the fluorescence intensity of the nanoparticle suspension decreased only slightly. After 20 min, 89% of the initial fluorescence (100%) of the nanoparticles was preserved. In comparison, the pure GFP seemed to be more affected by light exposure. After 20 min, only 81% of the initial fluorescence of pure GFP remained. This result indicated, that GFP, when embedded into silica nanoparticles, was better protected from photochemical alterations induced by the LED light than the pure protein.

Photostability of GFP-doped nanoparticles (C_F ) and pure GFP in ʟ-arginine. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was measured after exposure to LED light for the given times. Data are mean values. Error bars indicate the standard deviation

Stability Against Protein Degradation

As a further characterisation step, the degradation of GFP in the presence of proteinase K was tested. Therefore, three different systems were used (pure GFP, unlabelled C_U S_1U S_2U mixed with GFP and labelled C_F S_1F S_2F ). For all systems, equal amounts of GFP and particles were used. After 90 min of incubation, the fluorescence intensity of pure GFP and unlabelled particles with added GFP decreased to 5 - 7% of the initial fluorescence intensity, whereas the one of the labelled particles decreased to 52% (Fig. 7). This result indicates that the GFP is protected by the silica matrix and is degraded slower than free GFP in presence of proteolytic enzymes.

Stability against protein degradation of pure GFP (grey ), unlabelled particles mixed with GFP (C_U S_1U S_2U , blue ), and GFP-doped silica nanoparticles (C_F S_1F S_2F , green ). The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was plotted against the incubation time [min] with proteinase K

To conclude, the encapsulation of GFP into silica matrix appeared to bring about significant advantages:The stability of the protein was increased not only against elevated temperatures and light-induced photobleaching but also against the degradation through enzymes. Therefore, the silica matrix seems to protect the embedded GFP as compared to the free GFP.

Cellular Uptake Experiments

In order to determine, if the GFP-doped nanoparticles are able to deliver their cargo into cells, uptake experiments were performed (Fig. 8). A549 cells were exposed to GFP-doped nanoparticles and for comparison to the pure protein. In order to optimise the GFP load of the particles for imaging, a higher amount of GFP as compared to the nanoparticles described before was embedded into the particles. More specifically, a 20-fold amount of GFP in ʟ-arginine was used to label the second shell of the C_F S_1F S_2F particles. These nanoparticles were diluted to a final concentration of 37 μg SiO₂ per millilitre in cell culture medium and incubated for 24 h with the cells. The amount of GFP in both samples (nanoparticles and pure GFP) was 5 μg mL ⁻¹ .

Confocal microscopy images of A549 cells after 24 h exposure to GFP dissolved in ʟ-arginine (A1 –A3 ) and GFP-doped nanoparticles C_F S_1F S_2F (B1 –B3 ), and control cells (C ). Top (1):merge-images; middle (2):Cell membrane (WGA):red; bottom (3):GFP, green . Arrows indicate internalised nanoparticles. Contrast and brightness were enhanced by using the ImageJ software

In order to visualise the cells, the cell membrane was labelled, using tetramethylrhodamine-coupled WGA (wheat germ agglutinin). Confocal imaging was used to localise the GFP-doped nanoparticles and the pure GFP in the cells. After exposure of cells to GFP, no signal related to GFP was observed inside the cell bodies (Fig. 8a). Compared to the control cells, no difference in signal intensity of both channels could be observed (Fig. 8c).

In contrast, after exposure of the cells to the GFP-loaded nanoparticles, bright fluorescence signals were detected in the perinuclear region, indicating internalisation of the loaded nanoparticles through endocytosis. The GFP-loaded nanoparticles appeared to be excluded from the nuclear compartment. A second fraction of agglomerated nanoparticles was detected on top of the cell membrane (Fig. 8b).

In conclusion, the GFP-doped nanoparticles are internalised by the cells and are able to transport their cargo into the cells. After exposure of the cells to GFP, fluorescence signals were not detected inside the cell body. This finding is in line with the results of Pesce et al. [31], who did not observe cell-associated fluorescence after incubation of A549 cells with GFP for 24 h. The lack of cell-associated GFP signals might be due to the fact that GFP is not internalised by the cells. Alternatively, GFP fluorescence might be quenched by the low pH value present in endocytic vesicles or lysosomes or degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the fluorescence signals of the nanoparticles might indicate a protective effect of the silica nanoparticle matrix against lysosomal degradation.

Conclusions

In this study, a novel approach is presented for synthesis of monodisperse GFP-doped silica nanoparticles with a mean particle-core size of 15 nm. By subsequent growth steps, the particle size and the amount of embedded GFP can be varied. At the end of this procedure, the fluorescence properties of GFP are kept. Incorporation of GFP into additional outer shells results in an increase in the nanoparticle fluorescence. Coverage of the nanoparticles by non-doped shells seems to slightly decrease their fluorescence. These properties indicate the potential to incorporate cargo molecules into specific particle shells. The GFP-doped nanoparticles exhibit a higher quantum yield as compared to the pure GFP. The incorporation into the silica matrix appeared to be durable, as no leaching of protein was detected by ultrafiltration. The silica matrix also seems to improve the thermal properties and photostability of the protein. Furthermore, it is possible to encapsulate different proteins in the different shells, in order to prepare multifunctional nano-carriers. Finally, the nanoparticles are applicable for intracellular delivery of their cargo. The incorporation of proteins into the particle matrix seems to increase delivery and reduce lysosomal degradation of the cargo. Therefore, the protein-doped silica nanoparticles constitute a promising novel tool for biomedical applications of nanoparticles, especially in the field of intracellular delivery of macromolecules.

Abreviaturas

AUC:

Analytical ultracentrifuge

DLS:

Dispersión de luz dinámica

FCS:

Foetal calf serum

GFP:

Green fluorescent protein

MW:

Peso molecular

MWCO:

Molecular weight cut off membrane

PBS:

Phosphate buffered saline

r.t.:

Room temperature

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TEOS:

Tetraethoxysilane

Electrodo de puerta plateado impreso con inyección de tinta y curado por UV con baja resistividad eléctrica Fabricación de pozos a nanoescala con alto rendimiento en película delgada de polímero utilizando litografía de arado dinámico basada en puntas AFM