Terapia innovadora con nanopartículas de metotrexato-folato mejora tratamiento de cáncer de mama con enfoque fototérmico asistido por láser

Resumen

La terapia láser de bajo nivel (LLLT) se conoce como tipo seguro de fototerapia para dirigir tejido/células tumorales. Además, el uso de nanopartículas dirigidas aumenta el éxito de terapia contra cáncer. Este estudio fue diseñado para investigar efecto combinado de nanopartículas (NPs) de sílice recubiertas de oro (Au@SiO₂) cargadas con folato (FA)/Metotrexato (MTX) y LLLT en la lucha contra cáncer de mama.

NPs se sintetizaron y caracterizaron usando FTIR, TEM y DLS-Zeta. NPs tenían morfología esférica con diámetro medio ~25 nm y carga positiva (+13,3 mV) mientras que tras conjugación con FA y MTX su carga neta redujo a ~−19,7 mV.

Nuestros hallazgos en estudios de captación celular mostraron claramente captación celular mejorada de NPs tras carga con FA y MTX en ambas líneas celulares de cáncer de mama, especialmente en MDA-MB-231 debido a alta expresión de receptores de folato. Los resultados indicaron que LLLT tuvo efecto proliferativo en ambas líneas celulares de cáncer de mama pero en presencia de nanopartícula dirigida a cáncer de mama ingenierizada, la eficacia de terapia quimio-fototérmica combinada aumentó significativamente usando ensayo MTT (p<0,05), tinción DAPI y hallazgos de ciclo celular. El mayor efecto apoptótico en líneas celulares de cáncer de mama se observó en células expuestas a combinación de NP Au@SiO₂ cargada con MTX-FA y LLLT, probado por tinción DAPI y ciclo celular (al aumentar arresto celular en subG0/G1). En conjunto, combinación de quimioterapia y LLLT mejora potencial de terapia contra cáncer de mama con efectos secundarios mínimos.

Introducción

El cáncer de mama (CM), como el cáncer más frecuente en mujeres, afectando recientemente con 1,7 millones de nuevos casos mundiales. Debido a su etiología complicada y mala respuesta al tratamiento, a menudo conocido como causa central de muertes asociadas a cáncer en mujeres universalmente. Aproximadamente 40.000 mujeres en EE. UU. se predecía que morirían por CM en 2014. Con 522.000 muertes totales, es la quinta causa de muerte por cáncer con alrededor de 800.000 casos en regiones menos desarrolladas y frecuencia similar en regiones desarrolladas. En países asiáticos la mayor edad de inicio está entre adultos de 40 o 50 años en comparación con países occidentales donde es frecuente entre 60–70 años. Los principales factores de riesgo de CM son sexo femenino, historia familiar, edad, y tendencias generativas variables, como primer parto a edad mayor de 30 años, menarquía temprana y menopausia tardía, y nuliparidad.

El objetivo principal en lucha contra cáncer es desarrollar planes terapéuticos efectivos con bajas toxicidades y altas especificidades para eliminar tumores, principalmente sus metástasis, y prevenir su recurrencia. Pero enfoques de tratamiento de cáncer usados actualmente, como cirugía, quimioterapia y radioterapia mostraron varios efectos secundarios y todos fallan en lograr este objetivo.

Las últimas décadas han observado grandes esfuerzos en tratamiento de cáncer. Entre enfoques terapéuticos actuales populares, terapia térmica ha surgido como método de tratamiento prospectivo. Recientemente terapia fototérmica (PTT), como terapia contra cáncer potencialmente efectiva y no invasiva, ha atraído atención significativa. PTT basada en nanoestructuras fotoabsorbentes se ha convertido en forma diferente a métodos generales. En PTT típica, que usa agentes PTT para destruir tumor obteniendo hipertermia suficiente (42 °C) bajo irradiación láser (luz infrarroja cercana (NIR) en rango 700–1100 nm), se ha estudiado como método de tratamiento de cáncer altamente preciso y mínimamente invasivo.

Un número de nanopartículas han sido ampliamente estudiadas como agentes de contraste para imagen, transportadoras de fármacos y transformadoras de modalidades de energía como láser, ondas de radio y ultrasonido, a fenómenos térmicos responsables de efectos terapéuticos.

Las nanopartículas de oro han atraído gran atención durante la última década debido a su alta resonancia de plasmones de superficie localizada (LSPR) y fácil conjugación superficial con biomoléculas. Han revelado alta capacidad de conversión fototérmica en área NIR sin efectos secundarios dañinos en sistemas biológicos.

Aunque nanopartículas de oro han sido reconocidas como prometedoras fotosintetizadoras, pero debido a su pobre estabilidad fototérmica bajo irradiación NIR repetitiva, gradualmente pierden capacidad de conversión fototérmica limitando su uso en práctica clínica. Además, nanopartículas de oro no son buenas transportadoras de fármacos debido a su pobre capacidad de carga de fármaco y perfil de liberación controlada. Alternativamente, nanopartícula de sílice mesoporosa (MSN) se conoció como transportadora apropiada de fármaco, ADN y proteína debido a su mayor capacidad de carga de fármaco y falta de contenidos tóxicos producidos de sus degradaciones. También tienen gran área superficial, tamaño controlable, volumen de poro altamente disponible y características superficiales deseadas para modificación.

Nanopartículas tras conjugar a agente quimioterapéutico y ligando dirigidor de cáncer pueden inhibir desventajas de quimioterapia rutinaria, como entrega no específica, pobre solubilidad en agua y bajos índices terapéuticos.

Agentes mostrando propiedades quimioterapéuticas como doxorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, fluorouracilo y docetaxel se usan individualmente o en combinación como tratamientos principales, o ayudados con otros tratamientos como PTT. La mayoría de pacientes con cáncer experimentan efectos adversos de fármacos quimioterapéuticos debido a su distribución no precisa en cuerpo del paciente que afecta todos los órganos. Estos fármacos dañan algunas células normales de rápido crecimiento, por ejemplo células sanguíneas, células de membrana mucosa cubriendo órganos internos y folículos pilosos.

Metotrexato (MTX) ha sido fármaco más frecuentemente usado para artritis reumatoide y varios tipos de tumores como piel, pulmón, cabeza y cuello, y mama. Inhibe reductasa de dihidrofolato (DHFR), enzima contribuyendo a producción de tetrahidrofolato y sus subproductos necesarios para síntesis de timidilato y purina, ambos vitales para crecimiento y proliferación celular. Por tanto, al bloquear DHFR, metotrexato previene síntesis de 4 macromoléculas básicas ADN, ARN, timidilatos y proteínas.

Desafortunadamente, al igual que la mayoría de agentes PTT convencionales, el principal desafío es lograr acumulación selectiva de NPs de oro en tejido diana tras inyección sistémica. Terapia contra cáncer dirigida permite entrega de fármaco quimioterapéutico a células cancerosas específicas mientras disminuye exposición de células normales sanas. Esto nos llevó a entregar mayor dosis de fármaco a células cancerosas con menor toxicidad sistémica. Nanopartículas dirigidas por ligando son marcadores de células cancerosas identificados precisamente, que se sobreexpresan en superficie de células cancerosas.

Ácido fólico (folato o vitamina B9) es material clave para crecimiento y metabolismo celular. Debido a gran afinidad de folato por proteínas receptoras de folato, se utiliza como elemento para direccionamiento de cáncer. Receptor de folato, como biomarcador tumoral, se sobreexpresa en células malignas definidas como mama, ovario, pulmón, riñón, cerebro y colon. Sistemas de administración de fármacos conjugados con folato mejoran captación celular de fármaco vía endocitosis.

Materiales y Método

Reactivos y materiales

Usamos agua bidestilada (Compañía Ghazi, Tabriz, Irán) y reactivos químicos grado analítico para nuestros experimentos. Varios reactivos se compraron de Sigma-Aldrich incluyendo: ortosilicato de tetraetilo (TEOS, 98 %), (3-mercaptopropil) trimetoxisilano (MPTES, 95 % pureza), ácido fólico y rodamina B. Un grupo de materiales se compró de Merck Co: Ácido clorhídrico (HCl, 37 %), solución amoníaco (25 %), tolueno, hidróxido de sodio (NaOH, 98 %) y demás disolventes. MTX se compró de Zahravi Farma Company, Tabriz, Irán.

Instrumentación

En este estudio, para analizar tamaño y morfología de partículas, se empleó microscopía electrónica de transmisión (TEM) (LEO 906, Alemania). Preparamos alrededor de 100 μL de nuestras nanopartículas suspendidas en solución acuosa a temperaturas ambiente. La solución se transfirió a película de carbono recubierta en rejilla de cobre de TEM con secado por congelación posterior y observó a 80 KV. Determinación de tamaño de partícula se realizó por medida DLS (dispersión dinámica de luz) a 25 °C usando Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido. Medidas de potencial Zeta para NPs preparadas se realizaron por espectroscopía de correlación de fotones (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, Reino Unido). Un espectrofotómetro UV-Vis de doble haz (UV-1601 PC modelo SHIMADZU, Kioto, Japón) se empleó para medir absorbancia por cubeta de cuarzo 700 μL con longitud de camino 10 mm. Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) de espectrómetro Bruker Tensor 27, Alemania se utilizó para método de pastilla KBr. Medidas de pH se hicieron con medidor pH Metrohm 713 (Herisau, Suiza). Agitador mecánico Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Alemania) se usó para agitaciones. Eficiencia de encapsulación de FA y MTX se calculó usando sistema HPLC consistente en módulo de separación Waters 2690 equipado con detector UV-vis Waters 2500 Bomba 1000 detectores (Waters, Milford, MA). Separación cromatográfica se implementó a temperatura ambiente usando columna cromatográfica C18 m Bondapak (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Irlanda).

Preparación de nanopartículas Au@SiO₂

NPs SiO₂ se sintetizaron basado en método sol-gel reportado previamente. En siguiente paso, nanopartículas recubiertas de sílice funcionalizadas con tiol (TFSNPs) se prepararon según método mencionado en nuestro estudio previo. NPs de oro se produjeron por método de reducción con citrato (método Turkevich). Finalmente, superficie de TFSNPs se cubrió con AuNPs. Primero TFSNPs se dispersaron en agua con ayuda de sonicador de baño por al menos una hora y se añadieron a solución AuNPs y sonicaron por 30 min adicionales. La reacción se realizó en condiciones oscuras por dos días en agitación dinámica a 25 °C. Las nanopartículas Au@SiO₂ con apariencia coloreada púrpura se recogieron por centrifugación (10.000 rpm, 10 min) y secaron en horno de vacío.

Carga de MTX y FA

MTX así como FA se cargaron en nanotransportador Au@SiO₂ como sigue: MTX (10 mg) se añadió a 10 mL suspensión bien dispersa de nanotransportador en PBS (5 mg/mL, pH 7,4) y agitó moderadamente a temperatura ambiente por un día en condiciones oscuras. El nanotransportador Au@SiO₂ cargado con MTX se recogió por centrifugación. El sobrenadante se recogió para medición de MTX no cargado. Luego nanotransportador Au@SiO₂ cargado con MTX se dispersó en PBS (5 mg/mL, pH 7,4) y FA (10 mg) se añadieron a la solución y agitó moderadamente a temperatura ambiente por otro día en condiciones oscuras. El nanotransportador Au@SiO₂ cargado con FA-MTX se recogió por centrifugación y sobrenadante se separó para cálculo de FA no unido en paso final. El nanotransportador Au@SiO₂ cargado con FA-MTX se liofilizó y almacenó para próximos experimentos. Las cantidades de MTX y FA no unidos se calcularon usando método HPLC por protocolo reportado previamente. Ácido fólico se disolvió en hidróxido de amonio (10 % p/p) y diluyó con fase móvil. Tiempo de retención para MTX y ácido fólico fueron 10,5 y 5,95 min, respectivamente. Se aplicaron muestras triplicadas. Eficiencia de carga de fármaco (DLE) se calculó por las siguientes fórmulas:

ee(%) = (fármacos totales iniciales − fármacos no absorbidos) / Fármacos totales iniciales × 100

Selección y cultivo de líneas celulares

Dos líneas celulares de cáncer de mama de interés con niveles reportados de expresión superficial de receptor de folato (FR) incluyendo MCF-7 y MDA-MB-231 fueron seleccionadas y compradas del Banco de Células Pasteur (Teherán, Irán) para investigaciones de citotoxicidad. Las líneas celulares seleccionadas se cultivaron en medio completo conteniendo RPMI1640 (Thermoscientific), 10 % suero fetal bovino (FBS) y 1 % Penstrep (Thermoscientific) en condiciones térmicas y atmosféricas de 37 °C, 5 % CO₂ y 95 % humedad.

Ensayo de citotoxicidad celular

Ensayo de viabilidad celular se realizó para medir proliferación celular tras diferentes tratamientos con NPs sin irradiación láser. Brevemente: células MCF-7 o MDA-MB-231 se sembraron en microplacas de 96 pozos con densidad celular 1,5×10⁴ por 24 h, luego células se trataron con MTX, Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados con FA-MTX. Células sin tratamiento se consideraron como control. En siguiente paso, tinte tetrazolio MTT (Sigma) a concentraciones finales de 5 μg/ml se añadió a células e incubó a 37 °C por 4 h. Luego, solución MTT se retiró y cristales de Formazán asentados se disolvieron en Dimetil Sulfoxido (DMSO) (BioIdea, Irán) bajo agitación suave por 10 min. Finalmente, absorbancia se midió a 570 nm por lector ELISA. Viabilidad de células se normalizó a células control y fondo se eliminó por sustracción de mediciones en blanco.

Terapia láser in vitro

Para Terapia Láser de Bajo Nivel (LLLT), láser NIR 810 nm (láser diodo Mustang 2000, Rusia) con potencia de salida 185 mW se usó para destrucción de células cancerosas. Primero células MCF-7 y MDA-MB 231 con densidad celular 1,5×10⁴ tratadas con Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados con FA-MTX luego fueron expuestas a irradiación láser con diferentes dosis láser (30, 60, 75, 90 y 105 J/cm²) y tiempo de exposición fijo (139 seg). Células expuestas a solo irradiación láser (sin NPs) y células sin NPs ni tratamientos láser consideradas como control positivo y negativo, respectivamente. Tras 24 h de irradiación láser viabilidad celular se midió por método ensayo MTT.

Ensayo de captación celular de nanopartículas

Una verificación detallada de internalización celular de NPs es esencial para confirmar efecto específico de nanotransportador modificado en superficie para cada línea celular. En presente trabajo, empleamos tanto citometría de flujo como cuantitativa y microscopía de fluorescencia para verificación cualitativa de captación de NPs por líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231.

Para suspensión de NPs, solución de rodamina B (RhoD) en PBS se añadió junto con agitación por 24 h a temperatura ambiente y cuarto oscuro (previniendo blanqueo). Luego, NPs cargadas con RhoD se separaron por Filtro Amicon con límite de peso molecular nominal (NMWL) de 30 kDa y centrifugaron por 15 min a 5000 rpm y lavaron con tampón PBS para eliminar RhoD no unido. Las células se sembraron en placas a densidad de 5×10⁵ por pozo y dejaron alcanzar confluencia. Las células se trataron con NPs marcados con Rodamina B por 30, 90 y 180 minutos, células no tratadas usadas como control. Después, células se tripsinizaron y lavaron con PBS, y luego fluorescencia se cuantificó con análisis citométrico de flujo (BD Biosciences FCASCalibur citómetro de flujo; BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). La captación intracelular de NP o NPD marcados con rodamina B se confirmó además por microscopía de fluorescencia. Células MCF-7 y MDA-MB-231 se cultivaron en cubreobjetos y tras 24 h células se trataron con NPs Au@SiO₂ libres y NPs Au@SiO₂ cargados con MTX-FA. Tras incubación por 30, 90 y 180 minutos, células se lavaron con PBS y captaciones de nanotransportador marcados con rodamina B se observaron usando microscopio de fluorescencia (microscopio Olympus Bh2-FCA, Japón).

Estudio de apoptosis por microscopía de fluorescencia

Un método para estudio nuclear cualitativo de apoptosis es tinte fluorescente DAPI que se une a ADN y es detectable por microscopio apropiado. Usamos protocolo reportado previamente para tinción DAPI, brevemente: células MCF-7 o MDA-MB-231 se sembraron en formato 6 pozos a densidad 5×10⁵ y dejaron adherir y crecer por 24 horas. Tras tratamiento con MTX, NPs Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados con MTX-FA con y sin tratamiento láser, células se lavaron con PBS (Sigma) y luego sometidas a fijación por formaldehído 10 % (Merck), luego: células se permeabilizaron con Triton X-100 (Sigma) por 15 minutos. Tras lavados apropiados, células se tiñeron con DAPI (sigma) por 5 min. Finalmente, núcleos apoptóticos (fragmentados o arrugados) se visualizaron por microscopio de fluorescencia (Olympus). Células sin ningún tratamiento consideradas como control negativo y células que recibieron solo irradiación láser como control positivo.

Investigaciones de perturbaciones de ciclo celular

Distribuciones de ciclo celular de MCF-7 y MDA-MB-231 se determinaron por análisis citometría de flujo. De esta manera, células se sembraron con poblaciones iniciales de 5×10⁵ y permitieron alcanzar 80 % confluencia. Posteriormente, células tratadas con MTX, NPs Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados con MTX-FA con y sin irradiación láser se realizó. Células sin ningún tratamiento consideradas como control negativo y células que recibieron solo irradiación láser como control positivo. Luego, células se cosecharon por tripsinización seguida de lavados PBS apropiados. Luego, células se fijaron por etanol (Merck) por 48 horas. En siguiente paso, células fijadas se lavaron, luego trataron con Ribonucleasa A (Cinaclone), con adición subsiguiente de yoduro de propidio (PI) (Sigma) en oscuridad. Señales de fluorescencia se detectaron por FACS de Beckton Dicinson Company.

Estadísticas del estudio

Los experimentos para cada paso se realizaron en tres repeticiones y resultados se reportaron como media ±DE. ANOVA se usó para comparación de significancia entre grupos. Las diferencias se reflejaron significancias donde valor de probabilidad calculado <0,05 por software SPSS.

Resultados y discusión

Caracterización de NPs sintetizadas

NPs Au@SiO₂ se produjeron en cuatro pasos: 1-síntesis de nanopartículas SiO₂, 2-adición de enlazador conteniendo tiol a NPs SiO₂, 3-síntesis de nanopartículas de oro, y 4-union de nanopartículas de oro a superficie de complejos SiO₂-enlazador (Fig. 1). La síntesis exitosa de Au@SiO₂ se confirmó por FTIR (Fig. 2a). Pico Si-O-Si apareció alrededor de 1088 cm⁻¹. Pico ancho en 3000–3700 y 803 cm⁻¹ se atribuye a estiramiento y flexión fuera de plano de grupos silanol O-H libres, respectivamente. Vibración de estiramiento alifático C-H se mostró como pico fuerte en 2950 cm⁻¹. C-O de tres grupos metoxisilano se mostró por pico en 1191 cm⁻¹.

Medidas de dispersión dinámica de luz (DLS) indicaron que tamaño de NPs Au@SiO₂ conjugados FA-MTX estaba en rango nanométrico (105±2,3 nm) con distribución de tamaño estrecha (Fig. 2b).

Potencial zeta es parámetro fisicoquímico importante que influye estabilidad de nanosuspensiones. Valores extremadamente positivos o negativos de potencial zeta causan fuerzas repulsivas mayores. Por otro lado, alta carga de partículas, ya sea positiva o negativa, causa que NPs sean absorbidas por fagocitos del hígado y eliminadas del cuerpo. En caso de estabilización electrostérica y estérica combinada, potencial zeta mínimo de ±20 mV es deseable. Datos de potencial zeta de NPs se compararon antes y después de carga con MTX-FA a pH=7,4 y T=25 °C (Fig. 2c). Los potenciales zeta obtenidos de NPs Au@SiO₂ fueron +13,3 mV que tras carga dual de fármacos disminuyeron a −19,7 mV que estaban en rango deseable. MTX y FA tenían carga neta negativa a pH (7,4) por encima de su pka (3,8 y 4,8, 3,5 y 4,3), debido a desprotonación de dos grupos ácido carboxílico en su estructura. Por tanto, tras carga simultánea de MTX y FA en NPs Au@SiO₂, la carga neta se volvió negativa.

Análisis TEM provee tamaño de partícula individual definitivo. Nanopartícula de oro se vio como esferas oscuras dispersas en NPs SiO₂ como capa base gris. Imágenes TEM confirmaron que NPs Au@SiO₂ se sintetizaron con forma esférica homogénea en la que tamaño promedio de partícula fue alrededor de 25 nm (Fig. 3).

Carga de fármaco

Aquí, folato media captación aumentada de NPs de oro en ciertos tipos de células cancerosas que sobreexpresan receptor de folato mediante endocitosis mediada por receptor para superar baja eficacia de internalización de NPs de oro, por tanto receptor de folato conocido como marcador tumoral y folato usado cada vez más para direccionamiento tumoral.

Tras conjugación de moléculas MTX y FA en NPs Au@SiO₂, potencial zeta cambió de +13,3 a −19,7 mV. Los valores estimados de pKa de dos grupos ácido carboxílico de MTX son 3,8, 4,8 y FA 3,5 y 4,3. Por tanto, debido a desprotonación de dos grupos ácido carboxílico de MTX y FA a pH 7,4 que está por encima de su pka, la carga neta se volvió negativa indicando conjugación exitosa de MTX y FA en NPs Au@SiO₂. De Ying Tian et al muestra que carga MTX en nanopartículas de oro por 18 y 30 mm diámetro son 15 ± 0,4 % y 10 ±1,0 % respectivamente. En este estudio FA y MTX se cargaron en NPs Au@SiO₂ con eficiencia de encapsulación de 22,6 y 77,5 %, respectivamente. Cromatograma de evaluación simultánea pico MTX y FA mostrado en Fig. 2d.

Captación celular

Dado que agentes fototérmicos intracelulares pueden mejorar eficiencia de terapia fototérmica contra cáncer, se ha creído que internalización celular de materiales fototérmicos es necesaria. Ensayo de captación celular in vitro se realizó usando células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231, conocidas por sobreexpresar altamente receptor de folato. Para estudiar papel de FA como agente dirigidor y eficiencia de recubrimiento superficial en captación de NPs Au@SiO₂ por células diana, células MCF-7 y MDA-MB-231 se trataron con NPs Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados con MTX-FA. Los resultados de intensidad fluorescente media de captación celular se mostraron en Fig. 4. Resultados mostraron que captación de NPs Au@SiO₂ en tanto MCF-7 como MDA-MB-231 aumentó sobre tiempo de cultivo celular para todas las muestras (Figs. 4 y 5). Además, tras decoración superficial de NPs Au@SiO₂ con MTX y FA, la captación celular aumentó significativamente en tanto MCF-7 como MDA-MB-231 como células expresando receptor de folato. Captación de NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA en células MDA-MB-231 fue mayor que MCF-7. Porque células MDA-MB-231 expresan niveles más altos de receptores de folato superficiales, porción alta de NPs dirigidas a receptor de folato entraron vía mecanismo de endocitosis mediada por receptor resultando en mayor captación celular. En otro estudio, captación celular aumentada de NPs conjugados con folato ocurre solo en células cancerosas que sobreexpresan aHFR y no en células sanas que tienen menor expresión superficial de aHFRs. Conjugación de NPs Au@SiO₂ con FA puede facilitar captación celular de NPs y metotrexato, llevando a toxicidad aumentada hacia células MDA-MB-231.

Ensayo de citotoxicidad

Estudios de citotoxicidad celular in vitro de MTX libre, NPs Au@SiO₂ en blanco y NPs Au@SiO₂ conjugados MTX-FA, se evaluaron por ensayo MTT por 24, 48 y 72 h (Fig. 6). Resultados MTT mostraron que NPs Au@SiO₂ no tuvieron efecto citotóxico en líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231. Además, para comparar efectos citotóxicos de MTX libre y NPs Au@SiO₂ conjugados MTX-FA, misma concentración de MTX (25, 50, 100 y 200 μg/mL) se usó para todos los tiempos de tratamiento. Resultados citotoxicidad indican que MTX libre o NPs Au@SiO₂ conjugados MTX-FA mostraron alrededor 10-25 % tasa mortalidad en ambas líneas celulares tras 24h tratamiento. Estudios previos reportaron efecto proliferativo de nanopartículas de oro en diferentes líneas celulares como osteoblastos murinos MC3T3-E1 y células madre de ligamento periodontal humano bajo condiciones in vitro. Nuestros resultados concuerdan con estos estudios y Figura 6a y b muestran efecto proliferativo de NPs Au@SiO₂ libres. Por tanto, efecto citotóxico igual de MTX y NPs Au@SiO₂ cargados FA-MTX (NPD) puede ser debido a este fenómeno.

Irradiación láser

En este estudio, viabilidad celular de MCF-7 y MDA-MB 231 tratadas con NPs Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA tras irradiación láser con dosis en rango 30-105 J/cm² se investigó por ensayo MTT. Tasa mortalidad de MCF-7 y MDA-MB-231 tratadas con NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA (concentración MTX 100 μg/mL) tras LLLT a dosis 75 J/cm² fueron aproximadamente 39 y 45,5 %, respectivamente. Mientras en misma condición células tratadas con NPs Au@SiO₂ tras irradiación láser o láser solo no mostraron muerte celular obvia. También al aumentar dosis láser a 105 J/cm² tasa mortalidad de ambas líneas celulares aumentó a 60-75 %, mientras ambas líneas tratadas con NPs Au@SiO₂ +láser o láser solo a misma dosis irradiación no mostraron efecto citotóxico. Valor IC50 para MCF-7 y MDA-MB-231 tras terapia combinada con NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA (dosis MTX 100 μg/mL) y LLLT se obtuvieron a dosis 90 y 75 J/cm², respectivamente. Por otro lado tasa mortalidad de MTX y NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA sin irradiación láser a dosis MTX 100 μg/mL (dosis seleccionada para estudio terapia láser) fue entre 15-25 % en ambas líneas. Estos resultados indicaron que combinación de NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA y terapia láser mostró efecto sinérgico en ambas líneas y disminuyó significativamente viabilidad celular (p<0,001) comparado con células que recibieron solo irradiación láser. Estos resultados indicaron que tratamiento NPs, especialmente con estrategia de direccionamiento, puede mejorar eficacia de terapia láser en destrucción de células cáncer mama (Fig. 7).

Estudio de apoptosis por DAPI

Apoptosis se estudió en MCF-7 y MDA-MB-231 tras tratamiento con NPs Au@SiO₂; NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA con o sin láser para saber si tratamiento láser podía mejorar eficacia de quimioterapia. Nuestros resultados resumidos en Fig. 8 indicaron que células MCF-7 y MDA-MB-231 normales sin ningún tratamiento establecidas como control así como células tratadas con láser solo o NPs Au@SiO₂ libres sin irradiación láser tuvieron núcleos típicos, sin apoptosis. Sin embargo, células MCF-7 y MDA-MB-231 tratadas con MTX libre, NPs Au@SiO₂ con irradiación láser y NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA sin irradiación láser mostraron núcleos apoptóticos parciales (Fig. 8). Las células tratadas con NPs Au@SiO₂ cargados MTX-FA en combinación con irradiación láser (810 nm, 75 J/cm², 139 seg) mostraron caída mayor en población celular MCF-7 y MDA-MB-231. Por tanto, eficacia de irradiación láser se mejoró tras captación de NPs Au@SiO₂ cargados MTX/FA en células MCF-7 y MDA-MB-231. Por tanto, NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA novel desarrollados tienen capacidad de aumentar efectos fototérmicos por núcleos celulares altamente fragmentados, aumento radical en pérdida celular y daño completo de células.

Ciclo celular

Distribuciones de ciclo celular tras tratamiento con MTX, NPs Au@SiO₂ y NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA ya sea en combinación con LLLT (75 J/cm²) o sin irradiación láser se estudiaron en tanto MCF-7 como MDA-MB-231 usando citometría de flujo y tinción PI de ADN. Nuestro estudio indicó que en células MDA-MB-231 o MCF-7, porcentaje de células no tratadas (grupo control) estaban activamente en fase S (Fig. 9a, b). Usar tratamientos láser 75 J/cm² redujo porcentaje de células en fase S de manera no significativa. Por otro lado, células irradiadas con LLLT sin tratamiento NP y fármaco mostraron aumento significativo en población Go/G1 indicando seguridad de LLLT solo. También tratamiento NPs no perturbó ciclo celular en ambas líneas. Tratamiento de células con MTX libre en ausencia o presencia de irradiación láser mostró algunas perturbaciones en ciclos celulares, incluyendo reducción de células en fase S. Usar NPD solo redujo células en fase S. E interesantemente usar NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA (NPD) aumentó porcentaje celular en sub Go/G1 como signo de apoptosis. También porcentaje de células MDA-MB-231 presentes en sub Go/G1 (alrededor 18 %) fueron significativamente mayores que células MCF-7 (12 %) en grupo tratamiento NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA (NPD) debido a mayor captación NPs en células MDA-MB-231.

Ramos et al, mostraron que en células tumorales, LLLT aumenta porcentaje de células en fases S y G2/M, también detectaron reducción en proliferación y aumento en senescencia. Estudio de ciclo celular tras LLLT (15 J/cm²) mostró arresto G1, en línea con parada de crecimiento en células TK6 irradiadas. Otro grupo reportó que PTT perturba principalmente células en fase S y aumenta población celular y arresto en fase G2/M. Como resultado, PTT puede inducir radiosensibilización de células vía perturbación ciclo celular. Sus resultados concuerdan con nuestro estudio, que mostró perturbación ciclo celular y reducción células en fase S. Nuestro estudio también mostró aumento población células apoptóticas (sub Go/G1) tras terapia quimio-fototérmica combinada. Por tanto, aplicar combinación de LLLT y NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA (NPD) como nanopartículas dirigidas a cáncer de mama podría mejorar eficacia terapia cáncer mama.

Conclusiones

En este estudio NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA se diseñaron para terapia cáncer mama dirigida en combinación con LLLT como terapia láser no invasiva, aprobada FDA. NPs Au@SiO₂ cargados MTX y FA con morfología esférica y diámetro medio 25 nm y carga superficial −19,7 se obtuvieron. Este tamaño y carga superficial están en rango adecuado para aumentar biodistribución de NPs. La estrategia de direccionamiento exitosa de estos NPs novel desarrollados se aprobó con mayor porcentaje captación celular de MDA-MB-231 comparado a MCF-7 como dos líneas celulares cáncer mama con diferente expresión receptor folato. Resultados ensayo MTT, tinción DAPI y estudio ciclo celular indicaron que combinación terapia quimio-fototérmica mostró efecto sinérgico y efecto citotóxico y apoptótico en ambas líneas celulares cáncer mama especialmente en células MDA-MB-231 aumentó significativamente (p<0,001). Dado que NPs Au@SiO₂ o LLLT mostraron efectos citotóxicos, puede concluirse que nuestro diseño terapéutico tiene efectos sinérgicos en sitio dirigido. Los hallazgos de este estudio podrían ser útiles para diseñar futuros programas terapia cáncer usando bio-quimioterapia combinada con láseres de bajo nivel.

Disponibilidad de Datos y Materiales

No aplicable

Abreviaturas

Au@SiO₂:

Oro recubierto de sílice

BC:

Cáncer de mama

DHFR:

Reductasa dihidrofolato

DMSO:

Dimetil sulfóxido

FA:

Folato

LLLT:

Terapia láser de bajo nivel

LSPR:

Resonancia de plasmones de superficie localizada

MSN:

Nanopartícula de sílice mesoporosa

MTX:

Metotrexato

NIR:

Infrarrojo cercano

NPs:

Nanopartículas

PTT:

Terapia fototérmica

RhoD:

Rodamina B

TFSNPs:

Nanopartículas recubiertas de sílice funcionalizadas con tiol