Síntesis fácil de nanopartículas de iridio sin ligando y su biocompatibilidad in vitro

Métodos

Síntesis de IrNP

Todas las reacciones de síntesis se realizaron a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas en agua purificada de 18 MΩ. Se preparó una solución madre de cloruro de iridio (III) 20 mM (Acros Organics) mediante sonicación en baño y se agitó durante al menos 20 min para generar una solución ópticamente transparente. También se preparó una solución de morfolina de borano 1,0 M (Alfa Aesar) mediante sonicación en baño. Para síntesis a mayor escala de 500 ml de volumen total, se usaron 25 ml de solución de cloruro de iridio (III) (diluida a 1,0 mM) y se añadieron 5,0 ml de morfolina de borano (concentración final de 10 mM) con agitación rápida. La solución cambió gradualmente de marrón oscuro a negro durante 30 minutos. Se dejó que las nanopartículas se estabilizaran durante al menos 60 min. Esta solución coloidal se agregó directamente a filtros de centrifugación (Amicon Ultra-4, celulosa regenerada con MWCO de 10k) y las nanopartículas se recolectaron a 4000 × g y se lava con agua purificada. Luego, las nanopartículas se suspendieron en agua, se pasaron a través de un filtro de jeringa (Millex-MP 0.22 μm EO) y se almacenaron para su cuantificación.

Caracterización de nanopartículas

Para el análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS), las nanopartículas se suspendieron en un volumen igual de ácido nítrico, se recogieron por centrifugación en un tubo de microcentrífuga (5 min, 17 rcf) y se suspendieron en agua antes del análisis. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se realizó en un FEI Tecnai F-20 TEM que funciona a 200 kV. Los IrNP purificados se vertieron gota a gota sobre rejillas TEM con soporte de Cu de carbono perforado (Ted Pella) y se secaron a temperatura ambiente durante la noche. El análisis de difracción de líneas se realizó utilizando el análisis del software ImageJ. Para el análisis de difracción de rayos X (XRD), los IrNP concentrados se vertieron gota a gota sobre un portaobjetos de vidrio y se secaron a temperatura ambiente. Los datos de XRD se recopilaron en geometría de haz enfocado (Bragg-Brentano) en un sistema de difracción de rayos X Rigaku Ultima IV utilizando radiación Cu Kα monocromatizada con grafito. Las exploraciones se realizaron en un rango angular de 20 a 80 ° 2θ a una velocidad de exploración de 0,1 ° / min a temperatura ambiente. La dispersión de luz dinámica (DLS) se realizó en un Malvern Nano ZSP en cubetas de poliestireno desechables. Las nanopartículas se suspendieron en agua y los datos se informan como distribuidos por número. Los espectros de absorbancia UV-Vis se recogieron en un Tecan M200 Pro en una placa negra de 96 pocillos y un volumen total de solución de 100 μL. Las concentraciones de iridio se ajustaron para ilustrar los picos de absorbancia relativos. El análisis XPS se llevó a cabo en un PHI Versaprobe II equipado con un analizador de electrones hemisférico y una fuente de rayos X de aluminio Kɑ (1486,7 eV). El análisis de espectro se realizó utilizando el paquete de software Multipak. La calibración de la energía de unión se realizó utilizando el pico C1s a 284,6 eV, y el ajuste de los picos se basó en picos asimétricos y un fondo de Shirley iterado, lo que dio como resultado un valor de chi-cuadrado de 1,13. Se evaluó la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) de IrNP y la solución de cloruro de iridio (III) antes de los ensayos de toxicidad biológica. Se digirieron cincuenta microlitros de cada solución de IrNP en 50 µl de agua regia (ácido nítrico concentrado a ácido clorhídrico 3:1 M) durante la noche a 70 ° C en un tubo de digestión. A continuación, las muestras se diluyeron en 5,0 ml de ácido nítrico al 1% para su análisis. La ICP-MS se realizó en un Agilent 7900 utilizando helio como gas de colisión. Las curvas de calibración se prepararon utilizando soluciones madre de iridio de 100 a 0,1 μg / ml (en HCl al 1%) y todas las muestras se diluyeron de tal manera que las concentraciones se midieron en el rango de decenas de ppb.

Análisis de citotoxicidad

Las líneas celulares HepG2 y J774A.1 se sembraron a 2 × 10 ⁵ células por pocillo (100 μL) en una placa de 96 pocillos (DMEM con FBS al 10%) y se dejó reposar durante 24 h. Se añadieron nanopartículas de iridio, sal de iridio, agua o DMSO al 10% del volumen (10 μl de volumen adicional). A continuación, las células se incubaron durante 24 o 48 h. Para el análisis de viabilidad, se eliminó el medio y las células se lavaron una vez en PBS. Se incubaron cien microlitros de medio de cultivo con azul Alamar al 10% (Thermo Scientific) con células durante 2 h . A continuación, el medio se volvió a sembrar en una placa negra de 96 pocillos y se leyó la fluorescencia (ex530 / em590) en un Tecan M200 Pro. Todos los datos se realizaron por cuadruplicado y los experimentos se repitieron en días independientes para confirmar las tendencias generales. Se realizó un ensayo hemolítico como se informó anteriormente [8].

Resultados

Caracterización y síntesis de nanopartículas de iridio

En esta síntesis, formamos IrNP elementales a partir de la sal de cloruro de iridio (III) mediante reducción con un exceso molar de 10 veces de morfolina de borano en agua. La reacción es fácilmente escalable a varios litros y las partículas se forman a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas. Este método sintético produce IrNP uniformes pequeños (2-3 nm) (Fig. 1a) con un alto grado de cristalinidad como se observa en las imágenes TEM de alta resolución. Los patrones de difracción obtenidos de TEM confirman aún más la identidad de los nanocristales, con un espaciado de línea de 0,22 nm que es indicativo de la rejilla de difracción del iridio (Fig. 1b). El patrón de difracción de rayos X se asemeja mucho al del iridio elemental (número de tarjeta PDF:9008470, Fig. 1c). Tal como se sintetizan, los IrNP son coloidalmente estables en agua y permanecen suspendidos en solución durante varios meses a temperatura ambiente (Fig. 1d).

un Las nanopartículas de iridio miden entre 2 y 3 nm mediante imágenes TEM, con b con un parámetro reticular altamente cristalino. c El espectro XRD coincide con el iridio elemental y d las partículas tienen un tamaño hidrodinámico de 5 nm en agua por DLS

Los nanocristales se forman en el transcurso de 30 minutos como se observa por un cambio de color del precursor de iridio amarillo claro (III) a una solución de nanopartículas de color negro oscuro (Fig. 2). Cuando se exponen a un entorno básico, estos IrNP forman un óxido de iridio previsto, que parece azul. Las condiciones ácidas, como la incubación en ácido nítrico puro, no parecen afectar la cristalinidad de las partículas o la integridad del material; sin embargo, induce floculación y precipitación. Además, también se observó agregación en soluciones biológicamente relevantes (solución salina tamponada con fosfato y medios de cultivo de tejidos) en el transcurso de horas, lo que sugiere que será necesaria una mayor modificación de la superficie para futuras aplicaciones biomédicas. El análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X de los IrNP enjuagados en ácido nítrico y suspendidos en agua revela una superficie predominante de iridio (0), aunque el análisis de ajuste de pico de los datos indica un 20% de oxidación de la superficie (Fig. 3). No se observa ninguna orientación de cristalita preferida de las partículas, ni por XRD ni por XPS. Alternativamente, la introducción de un tensioactivo tiol a la solución de reacción durante el proceso de síntesis (antes de la nucleación) resultó en la inhibición de la formación de partículas.

El cloruro de iridio (III) aparece de color amarillo pálido con picos de absorbancia a 324 y 386 nm. Los IrNP son absorbentes de amplio espectro y aparecen de color negro. El óxido de iridio (predicho), producido a partir de IrNP oxidados tratados en una solución básica, aparece violeta azulado con un pico de absorbancia a 584 nm

Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) de IrNPs un estado de superficie predominantemente de iridio elemental, con aproximadamente un 20% de contaminación de la superficie de óxido

Citotoxicidad por iridio

Evaluamos la compatibilidad biológica in vitro de los IrNP sin tapar y lo comparamos con la sal de cloruro de iridio (III) en dos tipos de células de mamíferos. Se usó HepG2, una línea celular de carcinoma de hepatocitos, para evaluar la toxicidad potencial para el hígado. Se usaron células de macrófagos J774A.1 para evaluar la toxicidad para el sistema fagocítico mononuclear. Las células se incubaron con IrNP o cloruro de iridio (III) (normalizado para la concentración total de iridio) durante 24 o 48 horas y se lavaron para eliminar el iridio extracelular, y la actividad metabólica se evaluó mediante el ensayo Alamar Blue (Fig. 4). Las células HepG2 muestran un aumento de la actividad metabólica en presencia de iridio (III) a las 24 h (hasta un 115% de viabilidad), pero la respuesta se mitiga a las 48 h, con 500 μM de iridio (III) que reduce la viabilidad al 90%. Las células HepG2 tenían una viabilidad celular reducida, del 94 al 78% en presencia de IrNP 50 μM a las 24 y 48 h. Curiosamente, las células J774A.1 muestran un aumento de la actividad metabólica en respuesta a los IrNP a una concentración de 50 µM con una viabilidad del 122% a las 24 h; sin embargo, después de 48 h, se reanudó la función celular normal (98% de viabilidad), lo que sugiere una estimulación metabólica transitoria en respuesta a los nanomateriales. Las células J774A.1 incubadas con IrNP 500 μM durante 24 h muestran una respuesta metabólica aparentemente neutra, pero la disminución de la viabilidad a esta concentración después de 48 h sugiere que esto es un resultado de la toxicidad y la estimulación metabólica que aparece como una respuesta de viabilidad neutra. Además, evaluamos la biocompatibilidad in vitro de los IrNP con sangre a través de un ensayo hemolítico y encontramos que los IrNP no indujeron una hemólisis significativa cuando se incubaron con eritrocitos en PBS a 37 ° C durante 1 h (archivo adicional 1:Figura S1).

Viabilidad celular de las células HepG2 y J774A.1 incubadas con nanopartículas de Ir (0) o sal de Ir (III) durante 24 o 48 h. * Valores estadísticamente significativos ( p <0.05) en relación con las células no tratadas

Discusión

Se han examinado varios procesos sintéticos para producir iridio a nanoescala para aplicaciones catalíticas, incluida la reducción de sales de iridio mediante hidruros y gas hidrógeno [9,10,11,12,13], radiación ultravioleta y gamma [14,15,16,17], y reducción de poliol o alcohol [18,19,20]. Sin embargo, muchos de estos métodos sintéticos están diseñados para la integración de iridio en un sustrato o soporte para reacciones químicas y no son compatibles con aplicaciones biológicas [21]. Recientemente, aerosolizado ¹⁹² El Ir se empleó como modelo de materiales a nanoescala para la toxicidad pulmonar y se eligió por su excepcional inercia [22, 23]. El propósito principal de estos estudios fue examinar el aclaramiento y la translocación de las partículas finas inhaladas de los pulmones; sin embargo, también destaca la biocompatibilidad de este elemento.

Evaluamos la compatibilidad biológica in vitro de los IrNP sin tapar y lo comparamos con la sal de cloruro de iridio (III) en dos tipos de células de mamíferos que se espera acumulen las concentraciones más altas de nanopartículas inyectadas. La toxicidad del iridio (III) en las células J774A.1 sigue una curva de dosis-respuesta de toxicidad normal; El iridio (III) 100 μM reduce la viabilidad celular al 93 y 66%, y 500 μM da como resultado una viabilidad celular del 40 y 10% a las 24 y 48 h, respectivamente. Estos datos reflejan una interesante respuesta específica de la célula al iridio (0) y al iridio (III), y anticipamos una mayor exploración de estos efectos in vivo. Se espera que los IrNP más pequeños y otros nanomateriales inorgánicos poco solubles se trasladen al riñón y al hígado, con una residencia temporal corta en los riñones y una residencia más prolongada en el hígado, lo que puede afectar aún más los perfiles de toxicidad específicos de las células. Se espera la excreción a través de las heces de partículas de iridio más grandes, aunque esperamos que el tamaño extremadamente pequeño de estos IrNP se pueda filtrar fácilmente a través del sistema renal si se puede mantener la estabilidad coloidal in vivo [23].

En preparación para aplicaciones in vivo, se evaluó la compatibilidad sanguínea de los IrNP mediante un ensayo hemolítico. Utilizando sangre de ratón completa, evaluamos el efecto de estos IrNP sobre la ruptura de eritrocitos y la posible liberación de hemoglobina. Aunque será necesario evaluar estudios en profundidad del IrNP modificado en la superficie final, los componentes básicos del IrNP actual no provocan una respuesta hemolítica detectable hasta concentraciones extremadamente altas (500 μM).

Conclusiones

Concluimos de estos estudios que los nanocristales de iridio (0) se pueden sintetizar fácilmente mediante una simple reducción acuosa de borohidruro de cloruro de iridio (III), que da como resultado nanopartículas altamente cristalinas de 2 a 3 nm que son coloidalmente estables en agua con una concentración hidrodinámica de aproximadamente 5 nm. Talla. Durante la exposición aguda, estas partículas no son tóxicas en concentraciones de hasta 50 μM de iridio (en comparación con 10 μM para el cloruro de iridio) en los hepatocitos, estimulan la actividad metabólica en las células de macrófagos y no provocan una respuesta hemolítica a concentraciones prácticas. Estas nanopartículas sin ligandos pueden servir como bloques de construcción o núcleos para los IrNP modificados en la superficie posteriores para su uso en aplicaciones biológicas y médicas. Una mayor investigación de las propiedades funcionales de estos nanomateriales de alta densidad en presencia de rayos X u otra radiación presenta la oportunidad de nuevos agentes terapéuticos y de diagnóstico.

Abreviaturas

AuNP:

Nanopartícula de oro

DLS:

Dispersión de luz dinámica

ICP-MS:

Espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente

IrNP:

Nanopartícula de iridio

PDF:

Archivo de difracción de polvo

UV:

Ultravioleta

XPS:

Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X

XRD:

Difracción de rayos X

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