Fácil preparación in situ y actividad antibacteriana in vitro de micelas de copolímero que contienen plata a base de PDMAEMA

Resumen

Las micelas poliméricas bien definidas con estructura de núcleo-capa son una buena plataforma de administración para estabilizar las nanopartículas de plata (AgNP) en el campo de los antimicrobianos dirigidos a enfermedades. La construcción racional de la estructura del polímero, un enfoque de preparación eficiente, fácil y ecológico, y una exploración integral de los AgNP derivados son necesarios, como el tamaño, la estabilidad de las partículas, la actividad antibacteriana y otras propiedades. En este documento, diseñamos y evaluamos la actividad antimicrobiana in vitro de micelas de copolímeros decoradas con AgNP con diferentes topologías de copolímeros. En primer lugar, se obtuvieron copolímeros tribloque lineales o en estrella de cuatro brazos con el peso molecular y el grado de polimerización similares, que consistían en DMAEMA para la reducción in situ de iones de plata para formar AgNP sin agente reductor externo. HEMA y PEGMA en cáscara micelar proporcionaron una estabilidad mejorada de los AgNP durante la circulación sanguínea. La combinación de modelos computacionales y resultados experimentales indicó que ambos tipos de micelas podrían fabricar AgNP con morfología monodispersa y esférica. Los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros en estrella tenían un tamaño promedio más pequeño, mejor estabilidad y mayor actividad antibacteriana que aquellos con estructura lineal, lo que puede deberse a una mayor estabilidad de las micelas de los copolímeros en estrella. Además, la prueba de evaluación de la citotoxicidad mostró que los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros lineales o en estrella logrados tenían una buena biocompatibilidad. Este trabajo proporciona un enfoque fácil y universal en el diseño racional de AgNP estabilizados con micelas con topología adecuada para luchar contra una amplia gama de infecciones bacterianas.

Introducción

En las últimas décadas, se ha utilizado ampliamente una lista de agentes antimicrobianos tradicionales para tratar enfermedades infecciosas. Según la Organización Mundial de la Salud, la rápida aparición de microorganismos resistentes a múltiples fármacos se ha convertido en un problema mundial cada vez más grave, que se ha clasificado entre los tres primeros en la lista de las principales amenazas para la salud humana [1, 2, 3, 4, 5]. Por tanto, es necesario desarrollar nuevos agentes antimicrobianos con buena seguridad, capacidad antibacteriana eficaz sin producir resistencia bacteriana. Las nanopartículas de plata (AgNP), como uno de los mejores agentes antimicrobianos desde la antigüedad, se utilizaron ampliamente en bienes de consumo debido a su rendimiento superior contra diversos patógenos bacterianos y fúngicos, toxicidad relativamente baja para las células de mamíferos y resistencia bacteriana limitada [6,7, 8,9,10]. Los AgNP son capaces de mejorar la permeabilidad de la membrana de las bacterias, penetrar en el citoplasma, desnaturalizar las proteínas bacterianas y alterar la replicación de las bacterias, lo que resulta en la muerte de las bacterias [11,12,13]. Se ha empleado una gran cantidad de formulaciones de plata para dilucidar la actividad antibacteriana de los AgNP [14,15,16,17], por ejemplo, un apósito para heridas a través de un hidrogel de policarboxibetaína de iones híbridos junto con AgNP antibacterianos como componente central propuesto por Zhang et al . [18], las superficies multifuncionales obtenidas mediante recubrimiento multicomponente para co-inmovilizar AgNPs propuesto por Moreno-Couranjou et al., Etc. [19] .

Sin embargo, la gran superficie específica y la alta energía superficial llevaron a la agregación de AgNP, que se ha convertido en un gran cuello de botella para su aplicación. Por tanto, se necesita una matriz polimérica o un estabilizador externo para estabilizar los AgNP. Como se sabe, la matriz de polímero es el método más común para resolver el problema de agregación. En la actualidad, se utilizaron varios métodos para estabilizar los AgNP con matriz polimérica, como el método de reducción química, el método electroquímico, el método fotoquímico y el método de microondas. Entre ellos, la reducción química es un método común y eficaz. El nitrato de plata se reduce a AgNP mediante la adición de reductores como el hidrato de hidracina (N ₂ H ₄ ), borohidruro de sodio (NaBH ₄ ), citrato de sodio y ácido ascórbico en solución [20,21,22,23]. Por ejemplo, Hoda et al. bloque de poliestireno fabricado con ácido poliacrílico (PS- b -PAA) micelas inversas cargadas con los AgNP de 20 nm bajo la influencia del agente reductor N ₂ H ₄ , y los bloques de PS jugaron la capa exterior en tolueno [24]. El grupo de Liu informó que los nanomoldes de micelas autoensamblados se prepararon a partir de poli (ε-caprolactona) -bloque-poli (ácido aspártico) (PCL- b -PAsp). Se prepararon AgNP bien dispersos con AgNO ₃ como precursor y NaBH ₄ como reductor [25]. Sin embargo, los métodos anteriores no eran favorables al medio ambiente, y la adición de reductores excesivos produce subproductos, lo que dificulta la purificación de los AgNP y restringe la aplicación de antimicrobianos dirigidos a enfermedades infecciosas.

Mientras tanto, se ha informado de que los polímeros que contienen grupos amina podrían usarse como reductores y estabilizadores para preparar AgNP in situ. Por ejemplo, Lang et al. polímeros en estrella de seis brazos sintetizados que constan de PCL, metacrilato de 2- (dimetilamino) etilo (DMAEMA) y metacrilato de poli (etilenglicol) metil éter (PEGMA). El sistema redujo directamente el nitrato de plata en AgNP sin añadir ningún otro reductor en fase acuosa [26]. Aunque los AgNP mencionados anteriormente presentan una fácil modificación de la superficie sin un reductor adicional, en relación con las nanopartículas de oro [27, 28], el efecto de las topologías de polímeros en la reducción y estabilidad de las nanopartículas de plata junto con su aplicación en la actividad antibacteriana basada en micelas es menor estudiado.

En este trabajo, se ha diseñado un enfoque suave, fácil y ecológico para luchar contra las infecciones bacterianas, aprovechando las micelas poliméricas autoensambladas a partir de copolímeros tribloque lineales o en estrella de cuatro brazos con el peso molecular y el grado de polimerización similares a la nanoplataforma. para decorar AgNPs (Esquema 1). En este enfoque, los copolímeros tribloque, compuestos de DMAEMA, metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) y PEGMA, podrían generar micelas autoensambladas en condición acuosa, que es una buena plantilla para la preparación y estabilización de AgNP. Los bloques de PDMAEMA con grupos de amina terciaria podrían absorber fácilmente el Ag ⁺ iones mediante interacción de coordinación y luego in situ generan AgNPs sin ningún agente reductor. Los bloques HEMA y PEGMA con alta hidrofilia podrían usarse como estabilizadores en fase acuosa para mejorar aún más la estabilidad de los AgNP. Por lo tanto, el nitrato de plata podría coordinarse y desoxidarse espontáneamente en el núcleo de las micelas de copolímero autoensambladas para formar AgNP. Estaban incrustados en un núcleo micelar y podrían resultar en la destrucción de la membrana bacteriana. Aquí, cómo las topologías de copolímeros en estrella lineales o de cuatro brazos afectan la longitud de onda de absorción máxima, la morfología, el tamaño de partícula, el potencial zeta, la estabilidad, así como la eficiencia antibacteriana de los AgNP, se investigaron a fondo. Por lo tanto, el estudio sobre la relación entre estructura y propiedades puede encontrar una explicación en profundidad de las nanopartículas híbridas de plata para el tratamiento de infecciones bacterianas. Además, proporcionaría ideas de diseño y base técnica para la preparación de AgNP con una estructura más estable y un tamaño de partícula controlable.

Ilustración esquemática de la formación de copolímeros lineales / en estrella micelas estabilizadas AgNP para una excelente actividad antibacteriana

Material y métodos

Materiales

Pentaeritritol ( J&K Scientific Ltd.) se secó a presión reducida durante 24 h antes de su uso. 2- (dimetilamino) etil metacrilato (DMAEMA,> 98%), 2-hidroxietil metacrilato (HEMA, 99%) y poli (etilenglicol) metil éter metacrilato (PEGMA, M _n =300 Da, 99%), todos de Aldrich, se purificaron pasándolos a través de una columna que contenía alúmina neutra para eliminar el inhibidor. Mediante la utilización de hidruro de calcio (CaH ₂ ), tetrahidrofurano (THF) y tolueno de Aldrich se secaron y luego se destilaron a presión reducida antes de su uso. 2-bromoisobutirato de etilo (EBiB, 98%, Alfa Aesar), bromuro de 2-bromoisobutirilo (BIBB, 98%, Alfa Aesar), 1,1,4,7,10,10-hexametiltrietiletramina (HMTETA, 99%), nitrato de plata (AgNO ₃ , 99,9%), bromuro cúprico (CuBr ₂ ), metanol, trietilamina (TEA), diclorometano (DCM), acetona, n -hexano, dimetilsulfóxido (DMSO), octoato estannoso (Sn (Oct) ₂ ), carbonato de sodio (Na ₂ CO ₃ ), bicarbonato de sodio (NaHCO ₃ ), cloruro de sodio (NaCl), sulfato de sodio (Na ₂ SO ₄ ) y todos los demás reactivos obtenidos de J&K Chemical Company se utilizaron tal como se recibieron.

Caracterización general e instrumentación

Resonancia magnética nuclear de protones (¹ Se detectaron espectros de H NMR) de los copolímeros tribloque lineales o de cuatro brazos en CDCl ₃ y D ₂ O a 25 ° C a través de un espectrómetro Bruker ADVANCE 400 MHz (Madison, WI, EE. UU.). Las mediciones de espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) de copolímeros lineales, copolímeros en estrella y sus AgNP estabilizados con micelas se realizaron utilizando un espectrofotómetro FT IR (Nicolet Nexus para Euro, EE. UU.) Equipado con un modo de transmisión a 25 ° C. Se prepararon muestras granulares después de triturar con bromuro de potasio (KBr) y luego comprimir. Para obtener un espectro, las condiciones espectrales se establecieron previamente con una longitud de onda de 4000 a 400 cm ⁻¹ (32 escaneos) y una resolución de 8 cm ⁻¹ . Los potenciales zeta de los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros lineales y en estrella a diferentes relaciones molares se midieron mediante medición electroforética con el instrumento Malvern Zetasizer Nano S (Malvern, WR, Reino Unido) en el que cada muestra se probó tres veces a 25 ° C. Se realizó microscopía electrónica de transmisión (TEM, FEI Tecnai-G20) operando a 200 kV para observar morfologías de copolímeros lineales y en estrella micelas estabilizadas AgNPs a diferentes proporciones molares. El proceso de preparación del producto para TEM fue el siguiente:primero se vertieron 10 μL de solución de muestra en una rejilla de cobre recubierta con carbón y luego se secó al aire. Los espectros UV-Vis de los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros lineales y en estrella a diferentes relaciones molares se determinaron usando un espectrofotómetro UV-Vis (UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Japón). El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en un equipo NETZSCH (STA409PC, Alemania). Todas las muestras de polvo seco (copolímeros lineales, copolímeros en estrella y sus AgNP estabilizados con micelas) se calentaron de 25 a 600 ° C a una velocidad de 10 ° C / min en condiciones de nitrógeno.

Síntesis de PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA

Los activadores continuos regenerados por polimerización por radicales de transferencia de átomos de transferencia de electrones (AGERT ATRP) de DMAEMA, HEMA y PEGMA se realizaron siguiendo el procedimiento modificado de Zhang et al. [29, 30]. En resumen, después de la adición de CuBr ₂ (10 mg, 0,045 mmol), el matraz seco de tres bocas de 100 ml se evacuó y se enjuagó con argón tres veces. Con el auxiliar de jeringa desgasificada, se inyectaron ordenadamente en el recipiente tolueno anhidro (25 mL), EBiB (88 μL, 0.24 mmol), DMAEMA (5.15 mL, 30.5 mmol) y ligando HMTETA (62 μL, 0.24 mmol), siguiendo Agitación de 10 min. Después de inyectar Sn (Oct) ₂ (78 μL, 0.24 mmol) con tolueno (2 mL) como solución, la reacción se realizó a 70 ° C en un baño de aceite por 8 h. El bloque sucesivo HEMA (2,32 ml, 18,4 mmol) se inyectó durante las siguientes 8 h de reacción después de que la solución se hiciera mucho más espesa. Por último, con la participación del tercer monómero PEGMA (8,89 g, 55,6 mmol), presenciamos una reacción continua de 72 h antes de enfriar el matraz a casi temperatura ambiente. Se inyectó THF (30 ml) en el recipiente y luego se pasó la mezcla de reacción a través de una columna de alúmina neutra para eliminar el catalizador. El producto PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA se precipitó en un exceso diez veces mayor de n frío -hexano, se filtró y finalmente se secó al vacío durante 48 ha 35 ° C.

Síntesis de (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄

Iniciador terminado en bromo tipo estrella (Br) ₄ se sintetizó mediante la esterificación de los grupos hidroxilo terminales presentes en el pentaeritritol con bromuro de 2-bromoisobutirilo utilizando THF como disolvente y TEA como agente aglutinante de ácido. Por lo general, después de cargar con pentaeritritol (2,72 g, 2 mmol), el matraz de tres bocas de 100 ml se evacuó y se enjuagó con argón tres veces, luego de una inyección secuencial gota a gota de THF anhidro (120 ml) y TEA (12,51 ml, 90 mmol) . Bajo la circunstancia de hielo / agua, se inyectó gota a gota bromuro de 2-bromoisobutirilo (11,12 ml, 90 mmol) a la solución agitada vigorosamente, después de 4 horas de reacción a 0ºC y luego 20 horas a 25ºC. Para purificar el producto, la mezcla se pasó primero a través de una columna de alúmina neutra. El producto crudo se lavó sucesivamente con agua, Na ₂ al 10%. CO ₃ , NaHCO saturado ₃ y NaCl saturado, luego se seca sucesivamente a través de Na ₂ SO ₄ durante la noche, filtrado y concentrado antes de verter en un exceso diez veces mayor de frío n -hexano para precipitar el producto, y finalmente se seca al vacío durante 24 h para recibir el producto.

Las rutas sintéticas y las cantidades de alimentación de (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄ se llevó a cabo utilizando el mismo procedimiento que PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA.

Preparación de AgNP utilizando micelas de copolímero lineales o en forma de estrella

El PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA o (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄ En primer lugar se obtuvo una solución acuosa (pH 7,0), a la que el AgNO ₃ se agregó la solución mientras se desencadenaba la reacción de reducción de DMAEMA con Ag ⁺ para formar AgNP in situ en el núcleo micelar. Tomando la relación molar de DMAEMA y AgNO ₃ es igual a 9 como ejemplo, en primer lugar, PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA o (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄ con la misma cantidad de [DMAEMA] =4,8 mM agitado en acetona (5 ml) durante 4 h seguido de la adición de agua destilada (20 ml) con agitación durante la noche para formar micelas estables. Entonces AgNO ₃ La solución (220 μL, 48 mM) se inyectó gota a gota en la solución anterior y se agitó a 25 ° C en la oscuridad durante 48 h. Finalmente, los AgNP estabilizados con micelas poliméricas lineales o en estrella se prepararon recolectando y liofilizando antes de almacenarlos a -20 ° C para los siguientes experimentos.

Ensayo antibacteriano

Las investigaciones antibacterianas de los AgNP estabilizados con micelas de polímero se llevaron a cabo contra Escherichia coli DH5alpha ( E . coli DH5α) usando medio Luria-Bertani (LB) como portador para preparar diferentes concentraciones de las micelas poliméricas estabilizadas en soluciones de AgNPs por ultrasonidos. El E monoclonal . coli Se cultivaron DH5α durante la noche en medio LB (5 ml) a 37 ° C en un agitador a 200 rpm antes de que la suspensión bacteriana se diluyera a 1 x 10 ⁵ UFC / mL por medio LB. Después de mezclar un volumen igual de bacteriano diluido con diferentes concentraciones de micelas de copolímero o de AgNP estabilizados con micelas e incubación a 37 ° C durante 16 h, se caracterizó el cambio en la densidad óptica a la longitud de onda de 600 nm mediante un lector de microplacas (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, Vantaa, Finlandia). Cada ensayo se repitió seis veces.

Evaluación de viabilidad celular

Para evaluar la viabilidad celular, se realizó el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) con células de carcinoma hepatocelular de hígado (HepG2). Antes de la siembra celular, las células HepG2 se incubaron primero en una atmósfera humidificada de CO ₂ al 5%. a 37 ° C en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina (100 μL / ml) y estreptomicina (0,1 mg / ml). Luego, las células HepG2 se sembraron en un medio DMEM nuevo en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁴ por pocillo y cultivado durante 1 día. Después de sustituir el medio DMEM en micelas de copolímero preparadas previamente o soluciones de AgNPs estabilizadas con micelas (100 μl) a diversas concentraciones, las células se continuaron cultivando durante las siguientes 24 h. Después de lavar tres veces con tampón PBS, se agregaron 20 μL de reactivo MTT (5 mg / mL) y 180 μL de DMEM fresco y se incubaron durante otras 4 h. Finalmente, la solución se cambió a 200 μL de DMSO y la placa se agitó suavemente durante 10 min. La absorbancia a 570 nm se midió con el lector de microplacas mencionado anteriormente. Se promediaron los datos de seis experimentos paralelos.

Simulación de dinámica de partículas disipativas

Para analizar el proceso de crecimiento de AgNPs, la simulación de dinámica de partículas disipativas (DPD), que se basó en los modelos de grano grueso, se llevó a cabo utilizando el módulo mesocita de Materials Studio 8.0 (Accelrys Inc., San Diego, CA, EE.UU). Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S1, seis tipos de perlas constituían los copolímeros PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA o (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄ :soporte naranja para el centro, verde claro para MAA1 (metacrilato junto a la cadena lateral de etilamina), verde para DMA (cadena lateral de amino etilo), rosa para HEMA, azul claro para MAA2 (metacrilato junto a la cadena lateral de PEG) y azul para CLAVIJA. Un pequeño grupo con cristal de celda unitaria (longitud de la red:3,87 Å) constaba de cuatro átomos de plata, marcados como una cuenta plateada (color dorado). Al mismo tiempo, cada gota de agua (W) en color negro contenía cinco moléculas de agua. De acuerdo con nuestro trabajo anterior, Archivo adicional 1:Tabla S1 mostró el resultado de los parámetros de interacción computacional [31, 32]. Una r de 30 × 30 × 30 _c ³ Se utilizó una caja de simulación cúbica con condiciones de contorno periódicas en todas las direcciones con 100.000 pasos de simulación en total y un paso de tiempo de integración de 0,05 ns.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando una t de Student de dos muestras prueba con varianza desigual. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de copolímeros lineales / en estrella

Copolímeros lineales PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA y copolímeros estrella (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄ fueron sintetizados por polimerización ARGET ATRP de DMAEMA, HEMA y PEGMA con CuBr ₂ / HMTETA como catalizador, Sn (Oct) ₂ como agente reductor, y EBiB o pentaeritritol previamente acilado con BIBB como iniciador en tolueno (Esquema 2). La estructura y composición de los polímeros objetivo fueron verificadas por ¹ H NMR. Las micelas poliméricas se autoensamblaron a partir de PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA o (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄ con DMAEMA como bloque funcional, donde Ag ⁺ Los iones fueron atraídos y reducidos a AgNP sin la participación de un agente reductor adicional. Los efectos de las estructuras topológicas de los copolímeros en los AgNP se analizaron y evaluaron a partir de las propiedades fisicoquímicas y las actividades antibacterianas y anticancerígenas.

Rutas sintéticas de a PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA y b (PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA) ₄

Las estructuras químicas de los copolímeros lineales / en estrella fueron confirmadas por ¹ H NMR. Primero, los grupos hidroxilo terminales del pentaeritritol se transfirieron por completo al grupo bromo terminal (Br) ₄ , como se muestra en ¹ Espectro de RMN H (archivo adicional 1:Figura S2). El pico de 4,33 ppm se atribuyó a la -C H ₂ O- en pentaeritritol, mientras que el nuevo - (C H ₃ ) ₂ - apareció la señal a 1,94 ppm. Y los valores de la relación de integración de los picos de 1,94 ppm a 4,33 ppm fueron alrededor de 3. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S3 y S4, el pico de -C (C H ₃ ) ₂ - apareció a 1,94 ppm. Las señales a 1,83 ppm, 1,00 ppm se asignaron a -C H ₂ - y -CC H ₃ - en las principales cadenas de metacrilato de metilo, respectivamente. Los picos de 2,58 ppm y 4,08 ppm pertenecían a las resonancias características de los dos protones de metileno colindantes -C H ₂ C H ₂ - en el bloque DMAEMA, y el pico de 2,29 ppm se asignó a los protones de metilo -C H ₃ -, que estaba unido a un grupo de amina terciaria. La presencia de -C H ₂ C H ₂ - Los protones de metileno conectados al grupo hidroxilo terminal en la unidad HEMA aparecieron en 4.08 ppm y 3.57 ppm, respectivamente. Los picos de PEG característicos de -OC H ₂ C H ₂ - y terminal -C H ₃ los protones aparecieron a 3,67 y 3,39 ppm, respectivamente. Los picos de doble enlace de 5,5 a 6,1 ppm desaparecieron en el ¹ Espectros de H RMN. Calculado a partir de los valores de la relación de integración de la señal (f) a (a) ( I _f / Yo _a ), señal (g) a (a) ( I _g / Yo _a ), y señal (h) a (a) ( I _h / Yo _a ), respectivamente, PDMAEMA _19.3 - b -PHEMA _12.5 - b -PPEGMA _24.6 y (PDMAEMA _5.0 - b -PHEMA _5.6 - b -PPEGMA _5.0 ) ₄ fueron obtenidos.

Preparación y caracterización de los AgNP estabilizados con micelas de copolímero lineal / estrella

El proceso de formación de AgNP se muestra en el Esquema 1. Un solo par de electrones en el átomo de N que pertenecen al grupo de amina terciaria en la cadena molecular PDMAEMA, posee una capacidad de coordinación y reducción, por lo que podría usarse como agente de captura y un agente reductor. Primero, los iones de plata fueron atrapados por PDMAEMA debido a la complejación entre Ag ⁺ y átomo de N, formando (Ag ⁺ ) -Complejo PDMAEMA. Posteriormente, Ag ⁺ se redujeron in situ para formar átomos de plata en la etapa de nucleación. Posteriormente, la nucleación de Ag continuó con el crecimiento del cristal de Ag, lo que resultó en la formación de AgNP [26]. El bloque hidrófilo PPEGMA actuó como capa micelar, que proporcionó una capa protectora estable y mejoró aún más la estabilidad de los AgNP. El efecto de estabilización estérica de las micelas autoensambladas dentro del sistema se determinó mediante el equilibrio termodinámico de las micelas sobre la estabilización de los AgNP y la aglomeración entre los AgNP. En el caso de una pequeña cantidad de AgNP, la estabilización estérica del copolímero podría evitar una mayor agregación de los AgNP. Con el aumento del número de Ag, la estabilidad de las micelas a los AgNP se debilitaría y luego aumentaría la posibilidad de colisión entre las partículas, lo que resultaría en el crecimiento de tamaño de los AgNP. Aprovechando la estabilización espacial de las micelas, los AgNP que preparamos tienen un tamaño de partícula controlado, que tiene un gran potencial para aplicaciones antibacterianas.

La simulación de DPD se realizó para investigar el proceso de crecimiento y distribución de AgNP, con las mismas concentraciones del experimento real (PDMAEMA / AgNO ₃ relación molar =1/1, siendo las fracciones en volumen de copolímeros lineales, perlas de Ag y de agua del 10%, 0,23% y 89,77%, respectivamente). La Figura 1 reveló que las perlas de PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA y AgNPs mostraron inicialmente un estado distribuido irregularmente en solución acuosa. Con el paso del tiempo, finalmente se formaron ocho micelas de copolímero autoensambladas y se dispersaron uniformemente, mientras que todas las perlas de Ag se cargaron en las micelas. Se pudo ver que los AgNP en equilibrio podrían estabilizarse en las micelas del copolímero sin agregación adicional, lo que indica que las micelas autoensambladas pudieron prevenir la agregación adicional de AgNP y luego lograron el propósito de controlar su tamaño y distribución de partículas.

Simulación DPD del proceso de crecimiento y distribución de AgNPs con PDMAEMA- b -PHEMA- b -PPEGMA en PDMAEMA / AgNO ₃ relación molar =1/1 en diferentes tiempos de simulación. un Las moléculas de agua estaban ocultas para mayor claridad. b Solo se mostraron los AgNP

La caracterización FT IR de copolímeros lineales / en estrella y sus AgNP estabilizados con micelas se muestran en el archivo adicional 1:Figura S5. Obviamente, en comparación con los copolímeros lineales / en estrella simples, la vibración de estiramiento -COOR a 1730 cm ⁻¹ y la vibración de flexión del enlace C-N en PDMAEMA a 1457 cm ⁻¹ disminuyó después de la formación de AgNP, lo que indica que los AgNP se han cargado con éxito en las micelas de copolímero. La naturaleza cristalina de los copolímeros lineales / en estrella micelas estabilizadas AgNPs fue confirmada por espectro de difracción de rayos X (archivo adicional 1:Figura S6). Los valores de los picos de difracción de 38,5 °, 44,8 °, 64,2 ° y 78,0 ° correspondieron a las caras cristalinas (111), (200), (220) y (311) de la estructura cristalina cúbica centrada en las caras (fcc). de nanopartículas que contienen Ag [33, 34]. Se midieron los potenciales zeta de los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros lineales / en estrella. Como se muestra en la Fig. 2, los potenciales zeta de estos AgNP estabilizados con micelas de copolímero estaban alrededor de 15.0-23.2 mV. Además, con la creciente cantidad de AgNO ₃ , el potencial zeta de los AgNP estabilizados con micelas aumentó notablemente debido a la decoración de más AgNP. Para investigar más a fondo la dispersión de los AgNP y el efecto estabilizador de las micelas en los AgNP, las simulaciones DPD de las micelas de copolímeros lineales / en estrella estabilizaron los AgNP en diferentes PDMAEMA / AgNO ₃ Se llevaron a cabo relaciones molares. Como se muestra en la Fig. 2, los resultados también demostraron que los tamaños de los AgNP eran proporcionales a las proporciones en las que el número de pequeños AgNP agregados aumentaba y la distancia entre ellos disminuía, lo que aumentaba la probabilidad de colisión y aglomeración.

Los potenciales zeta y las vistas en sección transversal de a lineal y b copolímeros estrella micelas estabilizadas AgNPs. Los datos se recopilaron con diferentes PDMAEMA / AgNO ₃ relaciones molares de (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Los espectros para cuatro copolímeros lineales micelas estabilizadas AgNPs poseían una diferencia menor en el pico de absorción máximo ubicado alrededor de 437 nm, que era el pico de absorción de resonancia de plasmón superficial (SPR) característico de los AgNP esféricos / casi esféricos, relacionado tanto con la excitación de resonancia como con la transición entre bandas de ellos (Fig. 3a). El resultado demostró que el grupo amina terciaria en los copolímeros lineales podía reaccionar con nitrato de plata y la formación de AgNP apenas dependía del impedimento estérico de las micelas de copolímeros lineales. Posteriormente, los copolímeros en estrella con el bloque similar y el grado de polimerización en las mismas condiciones, el tamaño de partícula de los AgNP disminuyó cuando el PDMAEMA / AgNO ₃ aumento de la relación molar. Se reflejó a través del cambio hipsocrómico en los espectros UV-Vis donde los picos máximos de absorción fueron a 429 nm, 426 nm, 421 nm y 414 nm, respectivamente, debido a la diferente cantidad de AgNP formados por reducción de coordinación en la amina terciaria. de micelas de copolímero en estrella (Fig. 3b). En otras palabras, la estabilización estérica de los copolímeros en estrella podría estabilizar mejor los AgNP y prevenir su agregación adicional en pequeñas cantidades de AgNP. Por el contrario, el aumento en la cantidad de AgNP debilitó el efecto estabilizador, lo que proporcionó más oportunidades para la colisión de AgNP, y finalmente resultó en AgNP más grandes. Comparando la Fig. 3a con la Fig. 3b, los picos de absorción a 437 nm de AgNP dentro de las micelas de copolímero lineal poseían una distribución de longitud de onda más amplia, mientras que los AgNP dentro de las micelas de copolímero en estrella estaban alrededor de 422 nm. En este documento, no se mostró un desplazamiento azul en los espectros de los copolímeros lineales, lo que podría explicarse por el hecho de que los bloques de las micelas de los copolímeros lineales tienen un efecto más débil sobre el impedimento estérico para los AgNP, lo que resultó en un aumento de la probabilidad de aglomeración por colisión entre AgNPs.

Espectros UV-Vis de a lineal y b copolímeros estrella micelas estabilizadas AgNP en diferentes PDMAEMA / AgNO ₃ relaciones molares de (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Luego se llevaron a cabo mediciones de TEM para determinar el tamaño, la distribución del tamaño y la morfología de los AgNP. Las imágenes TEM de AgNP dependían de AgNO ₃ las proporciones de alimentación se muestran en la Fig. 4. Cuando el PDMAEMA / AgNO ₃ Las relaciones molares fueron 6 y 1, calculadas utilizando el software ImageJ, el tamaño de partícula de los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros lineales fue de 11,1 nm y 25,7 nm, mientras que el diámetro de los AgNP estabilizados con micelas de copolímeros en estrella fue de 3,7 nm y 6,4 nm, respectivamente. El aumento de AgNO ₃ El contenido condujo a más átomos de plata en las micelas, mayor energía superficial y el número de AgNP agregados aumenta en consecuencia con un tamaño de AgNP más grande. Estaba claro que los AgNP estabilizados con micelas eran monodispersos y esféricos con AgNP estabilizados con micelas de copolímeros lineales algo desiguales. Los tamaños de los AgNP estabilizados con micelas complementaron aún más los resultados de UV-Vis.

Imagen TEM de a , b copolímeros lineales y c , d copolímeros estrella micelas estabilizadas AgNP en diferentes PDMAEMA / AgNO ₃ proporciones molares: a , c 1/6, b , d 1/1

Stability of the Linear/Star Copolymers Micelles Stabilized AgNPs

The stability of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs is of great influence for the development of biomedical field. Obviously, the SPR peak in UV-Vis spectra (Fig. 5) of star copolymer micelles stabilized AgNPs did not display any significant changes for at least 1 month even after further diluted by one time, three times, and six times, indicating that the prepared AgNPs appeared well long-term colloidal stability within the experimental concentration range. However, the results of linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed that the UV absorption wavelength decreased slightly as the increase of dilution ratios. And the micelles concentration of linear copolymer decreased after 1 month of placement may lead to insufficient provision of steric hindrances to stabilize AgNPs.

UV-Vis spectra of a linear copolymers and b star copolymers micelles stabilized AgNPs solution at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1 after 1 month at the diluted times of 1 (a), 3 (b), and 6 (c), respectively

From the thermogravimetric analysis curves in Fig. 6, it was shown that the initial decomposition temperature (T _onset ) of linear copolymers micelles was 217 °C, which shifted to 172 °C after silver loading, suggesting that the linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed lower thermal stability than the pure linear copolymers micelles. It may be due to the fact that the chemical structure of PDMAEMA in the molecular chain changes and the catalytic effect of AgNPs in the thermal degradation process cannot be ignored [35]. As for star copolymers and their stabilized AgNPs, T _onset were around 213 °C. The two T_onset of star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs showed very few gaps, which could be speculated that the more stable star-shaped copolymers have better effect on stabilizing AgNPs than the linear copolymers. Combined the results of UV-Vis, TEM, and TGA measurements, it could be inferred that compared to the linear copolymers, the star copolymers have superior advantages in topology for stabilizing AgNPs, such as better stability, more uniform dispersion, slower nucleation rate during reduction, and the better product with a smaller and more uniform size of AgNPs.

TGA curves of a linear copolymers and b star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1

Antibacterial Activity and Cell Viability

To evaluate the antibacterial activities of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs by optical density (OD₆₀₀ ) measurements, E . coli DH5α was selected as the Gram-negative bacterial model. The absorbance at 600 nm after incubation was tested by incubating the bacteria with the eight different concentrations of micelles and micelles stabilized AgNPs at 37 °C. Results shown in Fig. 7a illustrated that the bacterial growth curves were highly correlated with the AgNPs concentration in the LB medium. The inhibition of linear/star copolymers micelles on the growth of bacteria was weak, which was not fatal to bacteria. However, as the concentration of linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs increased, the survival rate of E . coli DH5α was significantly inhibited, indicating a strong antibacterial efficacy of AgNPs against E . coli DH5α. The concentrations of linear copolymers micelles stabilized AgNPs preventing the bacterial growth in the experiments were relatively higher than those of star copolymers micelles stabilized AgNPs, which might due to the fact that bigger size of AgNPs could lead to a lower antibacterial performance because of the inefficient exposure of bacteria to AgNPs and relatively slow release behavior of AgNPs.

un Antibacterial activity and b cell viability of linear copolymers and star copolymers micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1. *p <0.05, two-tailed Student t prueba

Cancer is an uncontrollable disease of cell growth that can occur in any part of the body. The most common cancers are liver cancer, breast cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Among them, the liver cancer has the much higher prevalence in both developed and developing countries. Therefore, the toxicity experiments of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs on HepG2 cells were carried out, in which HepG2 cells were incubated with linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs at different concentrations (10, 50, 100, 200, 400 mg/L, respectively) for 48 h and the cell viability with MTT assay was the most intuitive data to evaluate the biocompatibility of the composite material. As shown in Fig. 7b, the percentage of viable cells for the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited negligible cytotoxicity, and was about 90% viability even at the highest concentration applied (400 μg/mL) after 48-h incubation, indicating the advantageous cytocompatibility of the micelles stabilized AgNPs within a relatively wide range of concentration.

Conclusion

In conclusion, PDMAEMA-based linear and star copolymer micelles as effective delivery carriers for silver-bearing antimicrobials were developed, and their in vitro antimicrobial efficacy and cell viability were investigated. Being a reducing agent and a stabilizer simultaneously, the micellar PDMAEMA core acted as loading platform for AgNPs in situ translated from the precursor silver nitrate. In silico simulation and experimental results indicated that both types of the copolymer micelles could generate monodisperse and spherical AgNPs. Compared with linear copolymers sliver-bearing micelles, the fabricated star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited smaller average size, better stability against dilution and pyrogenic decomposition, and enhanced antibacterial activities against E . coli DH5α due to the serious damage of bacterial membrane caused by loaded AgNPs. Moreover, both types of copolymer micelles stabilized AgNPs possessed great cytocompatibility toward HepG2 cells. Therefore, these studies may provide some guidance for the construction of more effective AgNPs weapon with well-defined and feasible polymer topology for combating the multiple bacteria-induced infections.