Síntesis Verde de Nanopartículas de Plata con Extracto de Levadura: Morfología Controlada y Actividad Antibacteriana Mejorada

Resumen

La biosíntesis para preparación de nanopartículas de plata antimicrobianas (Ag NPs) es un método verde sin uso de agentes reductores y surfactantes citotóxicos. Aquí, Ag NPs con forma controlada y bien dispersas se biosintetizaron usando extracto de levadura como agentes reductores y estabilizadores. Las Ag NPs sintetizadas exhibieron forma esférica uniforme y tamaño fino, con tamaño promedio de 13,8 nm. Las biomoléculas de aminoácidos reductores, ácido alfa-linolénico e hidratos de carbono en extracto de levadura tienen papel significativo en formación de Ag NPs, probado por análisis de espectroscopía infrarroja transformada de Fourier. Además, aminoácidos en superficie de Ag NPs portan cargas netas negativas que maximizan interacciones de repulsión electrostática en solución alcalina, proporcionando estabilidad favorable por más de un año sin precipitación. Las Ag NPs en tratamiento combinado con ampicilina revirtieron la resistencia en células E. coli resistentes a ampicilina. Estas Ag NPs monodispersas podrían ser alternativa prometedora para desinfección de cepas bacterianas multirresistentes, y mostraron citotoxicidad despreciable y buena biocompatibilidad hacia células Cos-7.

Introducción

Las infecciones resistentes a fármacos son causa importante de muerte y han resultado en serio riesgo para salud pública. Además, la creciente resistencia a fármacos antimicrobianos emerge como problema urgente en medicina [1]. Varias cepas de Staphylococcus aureus son resistentes a meticilina y son causa principal de infecciones adquiridas en hospitales. Otras bacterias resistentes a antibióticos incluyen Neisseria gonorrhoeae resistente a penicilina y Escherichia coli (E. coli) multirresistente [2, 3]. Los principales mecanismos de resistencia son aumento de eflujo y reducción de absorción de antibióticos [4]. Otro mecanismo es expresión de enzimas que modifican estructura molecular de antibióticos [5]. Aunque mucho esfuerzo se ha centrado en desarrollar próxima generación de agentes antimicrobianos, hay necesidad aumentada de métodos de desinfección superiores.

Las nanopartículas de plata (Ag NPs) se han usado en muchas aplicaciones, como portadores de proteínas, radiosensibilizadores, mejora de eficiencia de celdas solares y agentes antibacterianos [6-8]. Entre nanopartículas, incluyendo nanopartículas que contienen metal, las Ag NPs son las más usadas como agentes antimicrobianos [9]. En realidad, las nanopartículas de plata han mostrado actividad antimicrobiana significativa contra cepas bacterianas pero citotoxicidad despreciable a células animales [10, 11]. Además, Ag NPs han exhibido actividad antimicrobiana contra hongos, ciertos virus y cepas bacterianas resistentes a antibióticos. Respecto a su mecanismo de acción, supresión de replicación de ADN, bloqueo de diferencia de potencial eléctrico necesaria en membranas citoplásmicas y supresión de cadena respiratoria son mecanismos principales de acción de Ag NPs. Así, el tamaño, estructura superficial y formas controladas de Ag NPs juegan roles cruciales en su actividad antimicrobiana y otras aplicaciones. El método general para preparación de Ag NPs involucra reducción de iones plata en presencia de surfactante apropiado para lograr crecimiento controlado [12]. La mayoría de agentes reductores y surfactantes muestran citotoxicidad a células de tejido humano y potencialmente causan contaminación ambiental. Por tanto, más esfuerzo en desarrollar métodos verdes para preparación de Ag NPs con forma controlada es esencial.

En este trabajo, presentamos una ruta novedosa para biosíntesis de Ag NPs utilizando extracto de levadura. Durante el proceso, el extracto de levadura provee agentes reductores y estabilizadores, incluyendo aminoácidos, vitaminas e hidratos de carbono, mientras iones plata sirven como aceptor de electrones. Como resultado, la estabilidad favorable provista por agentes orgánicos estabilizadores en la superficie, las Ag NPs monodispersas, pueden preservarse por más de un año sin precipitación. Se encontró que Ag NPs mostraron actividad antibacteriana superior comparada a ampicilina contra células E. coli resistentes a ampicilina. Comparado a métodos sintéticos convencionales, el enfoque de biosíntesis presentado es biocompatible, rentable y ambientalmente benigno. Además, las Ag NPs con forma controlada y bien dispersas mostraron buenos efectos antibacterianos hacia E. coli.

Métodos

Materiales

Nitrato de plata (AgNO₃), sacarosa (C₁₂H₂₂O₁₁), cloruro de sodio (NaCl) e hidróxido de sodio (NaOH) se adquirieron de Sinopharm Co., Ltd. Levadura de panadero seca se obtuvo de AB/MAURI Co., Ltd. E. coli se adquirió de TransGen Biotech Co., Ltd. Kit CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) de Promega Biotech Co., Ltd. Plasmido pcDNA3.4, tampón de muestra 1×NuPAGE® LDS, medio Dulbecco's modified Eagle (DMEM) y suero fetal bovino (FBS) de Thermo Fisher Scientific Inc. Ampicilina y medio Luria-Bertani (LB) de Sangon Biotech Co., Ltd. Todos los reactivos fueron grado analítico y usados sin purificación adicional. Agua ultrapura desionizada (18,2 MΩ·cm) se usó en todos los experimentos.

Síntesis de Ag NPs

Las células de levadura almacenadas se inocularon en medio Luria-Bertani (LB) y agitaron ~150 rpm durante noche a 25 °C para activación. Luego, células activadas se lavaron con solución salina 0,9 % y dispersaron en solución 2 % sacarosa con agitación ~150 rpm durante 6 h a 25 °C. Finalmente, el extracto de levadura libre de células se colectó para biosíntesis de Ag NPs por centrifugación a 2000 rpm durante 5 min. Durante el proceso biosintético, el pH del extracto de levadura se ajustó a 10 con solución NaOH, y luego solución AgNO₃ se añadió gradualmente a la solución anterior bajo agitación magnética vigorosa. Al final, las Ag NPs obtenidas se dializaron con membranas de diálisis 1 kDa durante 5 días y liofilizaron para caracterización posterior.

Caracterizaciones

Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de Ag NPs se observaron en microscopio JEM-2100 con voltaje acelerador 200 kV (JEOL, Japón). Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) se obtuvieron en microscopio Carl Zeiss ULTRA plus (Carl Zeiss, Alemania) equipado con espectrómetro de dispersión de energía (EDS) operado a 20 kV. Espectros de absorción ultravioleta-visible (UV-Vis) se registraron en espectrofotómetro Lambda 950 UV/Vis/NIR (Perkin-Elmer, USA). Patrones de difracción de rayos X en polvo (XRD) se obtuvieron usando instrumento D8 Advance (Bruker, Alemania). Espectroscopía infrarroja transformada de Fourier (FTIR) se registró 4000-500 cm⁻¹ con muestras preparadas como pastillas KBr en espectrómetro Vertex 70 FTIR (Bruker, Alemania). El potencial zeta de Ag NPs se midió con Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Reino Unido) a 25 °C. Los elementos superficiales en Ag NPs se identificaron por espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) usando instrumento Kratos AXIS Ultra DLD con fuente Al Kα monocromática (1486,6 eV) (Shimadzu, Japón). Los componentes de aminoácidos se analizaron con analizador de aminoácidos de alta velocidad L-8900 (Hitachi, Japón).

Ensayo de Citotoxicidad Celular

Para explorar biocompatibilidad de Ag NPs preparadas, se empleó ensayo MTS para evaluar citotoxicidad [13]. Células Cos-7 se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % FBS medio completo en incubadora con atmósfera humidificada 5 % CO₂ a 37 °C. Las células se sembraron en placas de 96 pozos fondo plano a densidad 10 000 células/pozo y cultivaron 24 h. Luego, medio de crecimiento se reemplazó con DMEM fresco conteniendo diferentes concentraciones de Ag NPs. Tras incubación 24 h más, células relativamente viables se determinaron por MTS. La absorbancia se midió a 490 nm usando lector de microplacas SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA). Células no tratadas en medio DMEM se usaron como control.

Ensayo SDS-PAGE

SDS-PAGE estándar se realizó con gel separador 10 % (p/v) y gel de apilamiento 4 %. Las muestras se hirvieron 5 min con tampón 1×NuPAGE® LDS y centrifugaron 12 000 rpm 5 min antes de aplicar a geles. Marcador proteico estándar se usó como control de referencia. Los geles se tiñeron con 0,5 % Azul Coomassie. Imágenes de geles se registraron con sistemas de imagen GelDoc XR⁺ (Bio-Rad, USA).

Estudios de Actividad Antimicrobiana

Para determinar actividad antimicrobiana, las Ag NPs sintetizadas se probaron para actividad bactericida contra E. coli [14]. Una colonia única de E. coli creció overnight a 37 °C en medio LB en agitador orbital 150 rpm. Colonias se ajustaron a OD 0,01-0,02 a 600 nm con medio LB fresco. Luego, 100 μl de diluciones seriadas de Ag NPs se llenaron en microplacas de 96 pozos. Las microplacas se inocularon con 100 μl de solución E. coli diluida e incubaron 16 h a 37 °C. La viabilidad de E. coli se determinó midiendo absorbancia a 600 nm con lector SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA). Se realizó análisis de curso temporal para evaluar sensibilidad antibacteriana contra E. coli en el tiempo. Finalmente, 100 μl de solución E. coli se añadieron a tubos estériles conteniendo 10 y 20 μg/ml Ag NPs, respectivamente. La absorbancia a 600 nm se midió con lector SpectraMax® M5 tras 1, 2, 4 y 6 h.

Ensayo de unidades formadoras de colonias se introdujo para investigar Ag NPs contra células bacterianas resistentes a antibióticos. E. coli expresa establemente plásmido pcDNA3.4 conteniendo gen β-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina como modelo. Cuando células E. coli resistentes a ampicilina (E. coli-Amp⁺) alcanzaron fase log de crecimiento, se cultivaron en placa agar LB en tratamiento con ampicilina sola o en tratamiento combinado con Ag NPs e incubaron 37 °C 18 h. El número de colonias E. coli-Amp⁺ formadas en placas LB se calculó. Todos los ensayos se realizaron al menos tres veces.

Resultados y Discusión

Síntesis de Ag NPs

Como se ilustra esquemáticamente en Esquema 1, la preparación de Ag NPs comenzó con autoensamblaje de biomoléculas en extracto de levadura para formar micelas de levadura. Luego, Ag⁺ fue reducido in situ por agentes reductores en extracto de levadura, incluyendo aminoácidos, vitaminas e hidratos de carbono. Las nanopartículas Ag formadas se estabilizaron por biomoléculas. El recubrimiento superficial en Ag NPs mejoró afinidad hacia membrana bacteriana, aumentando permeabilidad de pared celular. La interacción entre Ag NPs y peptidoglicano cambió configuración de peptidoglicano, llevando finalmente a proceso de apoptosis para dañar bacterias.

Caracterización Estructural de Ag NPs

Como en Fig. 1a, la imagen SEM típica mostró que Ag NPs sintetizadas tienen forma esférica y tamaño fino. EDX confirmó formación de Ag NPs (Fig. 1b). Un pico fuerte de absorción óptica se observó ~3 keV, pico típico de nanocristalitos de plata para resonancia de plasma superficial. Cantidades menores de oxígeno y carbono atribuibles a capa delgada de recubrimiento orgánico en Ag NPs sintetizadas. La reacción de solución AgNO₃ con NaOH lleva a formación de pequeña cantidad de Ag₂O. Por tanto, pequeña cantidad de O también atribuible a presencia de Ag₂O. La morfología y tamaño de Ag NPs se caracterizaron además por TEM de alta resolución (HRTEM). Ag NPs variaron en diámetro 10,3-18,9 nm (Fig. 1c), con tamaño promedio 13,8 nm (Fig. 1d). El tamaño, forma y química superficial de Ag NPs mostraron efecto importante en actividad antimicrobiana. Tamaño menor y mayor área superficial permitieron a Ag NPs interactuar mejor con membrana bacteriana para actividad antimicrobiana mejorada [15-17]. Las franjas de red claras en imagen HRTEM mostraron espaciado 0,15 nm (Fig. 2a), correspondiente a planos (220) de plata. Como en Fig. 2b, la naturaleza cristalina de Ag NPs se demostró por patrones típicos de difracción de área seleccionada (SAED), donde anillos brillantes circulares corresponden a planos (311), (220), (200) y (111) [18, 19].

El espectro UV-Vis de Ag NPs exhibió pico fuerte a 418 nm, debido a resonancia de plasma superficial (Fig. 3a). Una solución amarilla de Ag NPs sintetizadas se muestra en Fig. 3b, indicando formación de Ag NPs. El análisis de patrón XRD de Ag NPs sintetizadas mostró cuatro picos intensos a 77,36°, 64,30°, 43,52° y 38,16°, correspondientes a planos (311), (220), (200) y (111) para plata, respectivamente (Fig. 3c). Datos confirmados por datos estándar de plata de tarjeta JCPDS n.º 04-0783 [20]. El patrón XRD demostró naturaleza cristalina de Ag NPs sintetizadas, de acuerdo con reporte previo [21]. Análisis FTIR se empleó para caracterizar e identificar biomoléculas potenciales en Ag NPs sintetizadas (Fig. 3d). Banda ancha a 3405 cm⁻¹ corresponde a estiramiento −OH [22]. Pico más débil a 2915 cm⁻¹ asignado a vibración de estiramiento −CH₂. Banda a 1655 cm⁻¹ en extracto de levadura debida a vibración de estiramiento C=O de grupos carboxilo, y esta banda se desplaza a 1573 cm⁻¹ en Ag NPs, por interacción entre grupos carboxilo y Ag NPs [23]. Pico agudo a 1375 cm⁻¹ atribuido a vibración de estiramiento C-N. Bandas a 1048 y 1083 cm⁻¹ asignadas a vibraciones de estiramiento C-O-C y C-OH, respectivamente [24, 25]. Estos resultados demostraron que biomoléculas del extracto de levadura fueron responsables de biosíntesis de Ag NPs. El recubrimiento superficial en Ag NPs afectó afinidad hacia membrana bacteriana [26, 27]. Los estados de Ag NPs se caracterizaron además por XPS. Como en Fig. 4a, barrido completo de espectro XPS con picos claros atribuidos a C 1s, Ag 3d, Ag 3p, Ag 3s y O 1s. Los picos Ag 3d (5/2) y Ag 3d (3/2) se observaron en energías de enlace ~368,5 y 374,5 eV, respectivamente (Fig. 4b). Este valor de separación de energía 6,0 eV demostró formación de Ag NPs [28, 29].

La carga superficial de Ag NPs se determinó por instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90, parámetro importante de estabilidad y dispersión de soluciones coloidales. El potencial zeta es el potencial electrostático superficial en frontera entre capa difusa y compacta de nanopartículas, indicador para aplicaciones de polímeros biomédicos [30]. Como en Archivo Adicional 1: Fig. S1, a pH 3, potencial zeta de Ag NPs reveló carga ligeramente negativa (−3,2 mV). El potencial zeta disminuyó monótonamente de −12,1 mV a pH 7,0 a −24,4 mV a pH 11,0, confirmando grupos cargados negativamente en superficie de Ag NPs. Gao et al. reportaron que dispersión y estabilidad de Ag NPs atribuyen principalmente a carga superficial [31]. La presencia de grupos cargados negativamente mejora estabilidad y dispersión de Ag NPs en soluciones acuosas [32].

Citotoxicidad de Ag NPs y Análisis de Biomoléculas

La biocompatibilidad de Ag NPs sintetizadas es importante para futuras aplicaciones biomédicas. Para investigar citotoxicidad, viabilidad de células Cos-7 se detectó por ensayo MTS. Células Cos-7 se incubaron con Ag NPs a diferentes concentraciones 24 h. Como en Fig. 5a, no se reveló citotoxicidad significativa cuando células tratadas con Ag NPs a concentraciones hasta 200 μg/ml. Se concluye que Ag NPs mostraron citotoxicidad despreciable y buena biocompatibilidad hacia células Cos-7.

Para explorar mecanismos sintéticos de Ag NPs sintetizadas, analizamos biomoléculas en superficie de Ag NPs y extracto de levadura. Como en Fig. 5b, análisis SDS-PAGE no mostró proteína detectable o marginal en superficie de Ag NPs sintetizadas ni en extracto de levadura. Determinamos biomoléculas en extracto de levadura con analizador de aminoácidos de alta velocidad. Como resume Archivo Adicional 1: Tabla S1, hay ~22 tipos de aminoácidos en extracto de levadura ricos en ácido glutámico, ácido γ-aminobutírico, ornitina y ácido alfa-linolénico. El punto isoeléctrico de estos aminoácidos es ~6, excepto lisina y arginina ~10-11. Además, variedad de componentes conteniendo −NH₂, como urea, amoníaco, asparagina y glutamina, pudieron encontrarse. Las biomoléculas de aminoácidos reductores, ácido alfa-linolénico e hidratos de carbono en extracto de levadura tienen papel significativo en formación de Ag NPs. Se reportó que reductasa dependiente NADH [33, 34] o enzima nitrato reductasa está involucrada en proceso de reducción [35-37] en biosíntesis de Ag NPs vía extracto de microorganismo.

Las biomoléculas del extracto de levadura juegan parte decisiva en formación de Ag NPs protegiéndolas de agregación. Estabilizadores de biomoléculas ayudan a prevenir reacciones redundantes entre Ag NPs [38]. Las moléculas anfóteras de aminoácidos contienen grupos básicos y ácidos. La carga neta de estos compuestos puede ser negativa o positiva dependiendo de cambios de pH de solución de extracto de levadura, afectando capacidad de unión durante síntesis de Ag NPs [39]. En solución alcalina, aminoácidos en superficie de Ag NPs portan cargas netas negativas que maximizan interacciones de repulsión electrostática [40-42]. Las biomoléculas del extracto actúan como agente estabilizador y juegan papel clave controlando distribución de tamaño, forma y morfología en formación de Ag NPs. El valor de pH es factor importante con efecto en síntesis controlada de Ag NPs en el estudio. Cuando pH < 7, nucleación ocurre a baja tasa. Ag NPs pueden formarse en pocos minutos a pH más altos, y tamaño de partícula disminuye con pH creciente. Se demostró equilibrio óptimo entre procesos de crecimiento y nucleación [43]. Ag NPs inestables y aglomeradas siempre presentes en proceso de reducción de soluciones con pH extremos (> 11) [44].

Actividad Antibacteriana

E. coli ha sido extensamente evaluada para actividad antimicrobiana de Ag NPs. El crecimiento de E. coli en presencia o ausencia de Ag NPs prueba capacidad antimicrobiana. Como en Fig. 6a, Ag NPs sintetizadas exhibieron actividad antibacteriana significativa de manera dependiente de concentración contra E. coli. El ensayo de inhibición de crecimiento demostró reducción completa de E. coli a concentraciones Ag NPs > 20,0 μg/ml comparado con control negativo. La concentración inhibitoria media (EC₅₀) de Ag NPs fue 13,4 μg/ml. La dosis 20,0 μg/ml exhibió efecto antibacteriano significativo contra E. coli durante todo el tiempo probado, mientras 10,0 μg/ml mostró efecto inhibitorio parcial (Fig. 6b).