Reducción de citotoxicidad de recubrimientos de nanopartículas de plata con óxido de grafeno: Mejora del rendimiento antibacteriano y biocompatibilidad de nanocompuesto Ag-GO

Resumen

Las superficies recubiertas con nanopartículas de plata (AgNPs) son consideradas alternativas prometedoras a antibióticos convencionales. Sin embargo, su alta reactividad superficial plantea preocupaciones de seguridad en contextos biomédicos. Aquí se reporta que integrar óxido de grafeno (GO) en recubrimientos de AgNPs reduce sustancialmente la citotoxicidad hacia fibroblastos humanos, células endoteliales y membrana corioalantoidea de embrión de pollo, mientras simultáneamente mejora la actividad antibacteriana contra Salmonella enteritidis. El nanocompuesto Ag-GO demostró inhibición bacteriana superior y liberación marcadamente reducida de citocinas inflamatorias, indicando una nanoplataforma más segura adecuada para aplicaciones médicas.

Introducción

Las superficies antimicrobianas que incorporan nanomateriales —especialmente nanopartículas de plata— emergen como alternativas efectivas a antibióticos tradicionales y desinfectantes químicos. Sin embargo, las propiedades que confieren potencia antibacteriana también contribuyen a citotoxicidad e inmunogenicidad potencial, limitando traducción clínica. Una estrategia clave para mitigar toxicidad es inmovilizar firmemente nanopartículas sobre sustrato, restringiendo su liberación mientras se preserva función antimicrobiana. Técnicas de deposición ultrasónica han probado ser efectivas para recubrimiento y formación de nanocompuestos estables, como AgNPs sobre óxido de grafeno (GO). Los abundantes grupos funcionales oxigenados del GO promueven fuerte unión electrostática o covalente con iones metálicos, mejorando adhesión y reduciendo lixiviación de partículas. En este estudio, se hipotetizó que láminas de poliuretano recubiertas con nanocompuesto Ag-GO exhibirían menor toxicidad comparado a recubrimientos solo AgNPs, sin comprometer eficacia antibacteriana.

Resultados

AgNPs y GO forman nanocompuesto estable

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló AgNPs esféricas (~55 nm) fuertemente adheridas a láminas GO (Fig. 1a-e). Medidas de potencial zeta mostraron que hidrococoloide Ag-GO se estabilizó tras 24 h (−15,68 mV a −27,7 mV), mientras AgNPs solos permanecieron inestables (−31,11 mV). Dispersión dinámica de luz (DLS) indicó tamaño promedio Z de 1157 nm para nanocompuesto, intermedio entre AgNPs (93 nm) y GO (1485 nm), confirmando hibridación exitosa (Fig. 1b,d,f). Espectroscopía Raman confirmó bandas características D (1347 cm⁻¹) y G (1578 cm⁻¹) de GO, con ratio ID/IG 1,34, indicando estructura altamente desordenada pero funcionalizada (Fig. 2a). Espectros FT-IR verificaron presencia de grupos hidroxilo, carboxilo y epóxido (Fig. 2b).

Eficacia antibacteriana contra Salmonella enteritidis

Tras 24 h incubación a 37 °C, todas las nanoplataformas —AgNP, GO, Ag-GO— redujeron crecimiento bacteriano respecto a láminas sin recubrir. El nanocompuesto Ag-GO logró inhibición más pronunciada, con reducción >90 % en unidades formadoras de colonias cuantificadas por ensayo PrestoBlue (Fig. 3c). Microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló colonias bacterianas escasas y disrupciones de membrana en superficies Ag-GO, confirmando muerte mediada por contacto físico (Fig. 3b).

Reducción de citotoxicidad en células humanas

Fibroblastos humanos y HUVECs se cultivaron directamente sobre cada nanoplataforma por 24 h. Ensayos de viabilidad mostraron disminución 40–50 % en láminas solo AgNP, mientras superficies GO y Ag-GO mantuvieron viabilidad comparable a controles sin recubrir (Fig. 4e,f). Evaluación morfológica reveló que recubrimientos AgNP indujeron agregación celular pronunciada, mientras GO y Ag-GO promovieron extensión y morfología normal (Fig. 4a-d). Estos hallazgos subrayan efecto protector del GO en nanocompuesto.

Compatibilidad con membrana corioalantoidea

Contacto directo de nanoplataformas con membrana corioalantoidea de embrión de pollo por 48 h reveló que recubrimientos solo AgNP causaron pérdida capilar y rugosidad superficial, mientras GO y Ag-GO mantuvieron morfología vascularizada lisa similar a controles (Fig. 5b). Este modelo in vivo corrobora la reducida toxicidad endotelial observada in vitro.

Modulación de liberación de citocinas inflamatorias

Perfilado por array de anticuerpos de sobrenadantes de fibroblastos reveló que tanto recubrimientos AgNP como Ag-GO suprimieron marcadamente secreción IL-8, mientras GO solo no tuvo efecto (Fig. 6a). Todas las nanoplataformas redujeron liberación IL-6, y GO/Ag-GO aumentaron producción TNF-β, sugiriendo respuesta inflamatoria equilibrada. Otras citocinas permanecieron inalteradas, indicando baja inmunogenicidad del nanocompuesto.

Discusión

Nuestros datos confirman que integrar GO en recubrimientos AgNP no solo mejora erradicación bacteriana sino que también mitiga respuestas citotóxicas e inflamatorias en células humanas y modelo vertebrado. La estabilidad mejorada de AgNPs dentro de matriz GO probablemente limita liberación iónica y desprendimiento de partículas, reduciendo captación celular y estrés oxidativo. Además, mayor tamaño del nanocompuesto (~1150 nm) disminuye tasas de endocitosis, como observado para otras nanoestructuras, reduciendo aún más toxicidad. Importante, el nanocompuesto no provoca tormentas de citocinas significativas, manteniendo perfil inmunológico neutro esencial para traducción clínica.

Estos hallazgos coinciden con reportes previos de capacidad de GO para estabilizar nanopartículas metálicas y reducir lixiviación, preservando o incluso mejorando potencia antimicrobiana. El presente trabajo extiende este concepto a sustrato polimérico realista (láminas poliuretano) y valida biocompatibilidad en múltiples tipos celulares y modelo in vivo.

Conclusiones

El nanocompuesto Ag-GO superó a recubrimientos solo AgNP y solo GO en eficacia antibacteriana contra Salmonella enteritidis y en reducción de citotoxicidad hacia fibroblastos, HUVECs y membrana corioalantoidea. El perfil equilibrado de citocinas del nanocompuesto respalda su idoneidad para dispositivos biomédicos, como apósitos para heridas y recubrimientos de implantes. Trabajos futuros explorarán estabilidad a largo plazo, cinética de liberación y modelos de infección in vivo para avanzar despliegue clínico.

Materiales y Métodos

Preparación y caracterización de nanoplataformas

Láminas de poliuretano (15 × 15 mm, 0,05 mm) se recubrieron por inmersión en suspensiones acuosas de AgNPs (100 mg L⁻¹), GO (200 mg L⁻¹) o Ag-GO (200 mg L⁻¹) preparadas via ultrasonicación (20 kHz, 60 % eficiencia, 30 °C). Muestras recubiertas se enjuagaron en agua desionizada y secaron en condiciones estériles. TEM, Raman, FT-IR, potencial zeta y DLS confirmaron morfología y estabilidad de cada formulación (detalles en Material Suplementario).

Cultivo bacteriano y ensayo viabilidad

Salmonella enteritidis (ATCC 13076) creció en agar soya tripsínico, se cosechó y cuantificó por OD₆₀₀ para lograr 5 × 10³ CFU mL⁻¹ en caldo MH. Láminas se incubaron con bacterias 24 h a 37 °C. Post-incubación, viabilidad bacteriana se midió usando PrestoBlue, y recuentos CFU por dilución serial y siembra.

Microscopía electrónica de barrido

Muestras bacterianas y celulares se fijaron en glutaraldehído 2,5 %, contrastaron con tetróxido de osmio, deshidrataron, secado por punto crítico, y recubrieron con oro antes de imágenes SEM a 15 kV.

Cultivo celular humano

HUVECs y fibroblastos se cultivaron en medios bajo suero con suplementos (detalles arriba). Células se sembraron directamente sobre láminas (1 × 10⁴ células mL⁻¹) e incubaron 24 h. Viabilidad se evaluó por fluorescencia PrestoBlue (λ_ex = 560 nm, λ_em = 590 nm). Morfología se examinó por microscopía de contraste de fase.

Ensayo membrana corioalantoidea

Embriones (Día 8) expuestos a láminas colocadas sobre membrana corioalantoidea por 48 h. Membranas se cosecharon, imágenes estereoscópicas, y evaluaron integridad vascular.

Análisis array anticuerpos

Sobrenadantes de fibroblastos (80 µL por muestra) se agruparon, diluyeron, y sondearon en array anticuerpos (Abcam, catálogo ab134003) para cuantificar 40 citocinas inflamatorias. Señales detectadas con estreptavidina conjugada HRP e imagenadas en sistema ChemiDoc.

Análisis estadístico

Datos analizados con ANOVA unidireccional y prueba post-hoc Tukey HSD (GraphPad Prism 8). Significancia p < 0,05.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Los conjuntos de datos generados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente bajo solicitud razonable.

Abreviaturas

Ag-GO

Compuesto de nanopartículas de plata y óxido de grafeno

AgNPs

Nanopartículas de plata

CFU

Unidades formadoras de colonias

DLS

Dispersión dinámica de luz

FT-IR

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

GM-CSF

Factor estimulante de colonias granulocito-macrófago

GO

Óxido de grafeno

HUVECs

Células endoteliales de vena umbilical humana

IL-6

Interleucina 6

IL-8

Interleucina 8

SEM

Microscopio electrónico de barrido

TEM

Microscopio electrónico de transmisión

TNF-α

Factor de necrosis tumoral alfa

TNF-β

Factor de necrosis tumoral beta