Óxido de Grafeno Funcionalizado con Taurina para Liberación de 5-Fluorouracilo: Fabricación, Caracterización y Eficacia Anticancerígena

Resumen

Recientemente, los sistemas nanoportadores para fármacos contra el cáncer, especialmente los sistemas de liberación de fármacos basados en GO, se han convertido en un beneficio para pacientes con cáncer. En este estudio, elegimos Taurina (Tau) para funcionalizar la superficie de GO y mejorar su biocompatibilidad. Primero, se sintetizó GO a nanoescala mediante el método modificado de Hummer y método de exfoliación ultrasónica. El portador de óxido de grafeno modificado con taurina (Tau-GO) se sintetizó por método químico para obtener Tau-GO que tiene buena dispersibilidad y estabilidad en agua, con un potencial zeta de -38,8 mV y tamaño de partícula de 242 nm. Basado en criterios de evaluación de eficiencia de encapsulación, se determinó la formulación óptima para combinar Tau-GO y 5-FU por enlace no covalente. El 5-FU-Tau-GO fue más estable en ambiente neutro que en ácido, con cierto efecto de respuesta a pH y liberación sostenida. In vivo, comparamos administraciones oral e intravenosa de 5-FU y 5-FU-Tau-GO, respectivamente, usando pruebas farmacocinéticas y parámetros relacionados y mostramos que la administración oral o intravenosa de 5-FU-Tau-GO prolonga el tiempo de acción de 5-FU en el cuerpo y mejora su biodisponibilidad. Además, la inhibición de células HepG2 medida por ensayo MTT mostró que el valor IC₅₀ de 5-FU fue 196 ± 8,73 μg/mL, y el valor IC₅₀ de 5-FU-Tau-GO fue 65,2 ± 0,7 μg/mL, indicando que 5-FU-Tau-GO es más potente contra células HepG2 y tiene un efecto inhibitorio más fuerte sobre células cancerosas. El efecto en la morfología celular medido usando tinción AO/EB también mostró que 5-FU-Tau-GO no solo disrumpió células, sino que también indujo apoptosis significativamente comparado con 5-FU. También verificamos por diseño asistido por computadora que Tau-GO puede unir mejor a 5-FU que GO sin modificar, y que el sistema 5-FU-Tau-GO formado es más estable y propicio para la transferencia y liberación de 5-FU in vivo.

Introducción

La quimioterapia sigue siendo un método común usado en el tratamiento de diversos cánceres. Un obstáculo significativo de la mayoría de agentes quimioterapéuticos es su incapacidad para penetrar tejidos tumorales a concentraciones efectivas, o sus efectos secundarios no deseados en tejidos normales. Por tanto, los científicos han concentrado sus esfuerzos en desarrollar un sistema de liberación de fármacos potente que pueda lograr una tasa controlada de liberación del fármaco en tejidos tumorales para asegurar una liberación y terapia efectiva.

Muchos materiales nanoestructurados incluyendo liposomas, polímeros, nanopartículas, dendrímeros, micelas y óxido de grafeno se han desarrollado para la liberación de diversos fármacos. Entre estos nanomateriales, el óxido de grafeno (GO) es un nanomaterial de carbono novedoso que se exfolia químicamente de grafito oxidado y exhibe varias propiedades físicas y químicas fascinantes, como abundantes grupos funcionales, gran área superficial específica, alta cantidad de carga de fármaco y excelente capacidad de dispersión en agua. Además, la mayoría de resultados experimentales in vitro mostraron que una baja concentración de GO podría usarse como sustrato para crecimiento celular y activar células inmunes. Por tanto, GO se ha usado ampliamente en diagnóstico de enfermedades, imagen y seguimiento de células cancerosas, terapia fototérmica contra el cáncer, ingeniería de tejidos, liberación de fármacos dirigida y, especialmente, como portador de fármacos anti-tumorales. Sin embargo, varios grupos de investigación han reportado que una alta concentración de GO tiene efectos citotóxicos obvios en estudios preclínicos y clínicos. El mecanismo por el cual GO produce efectos tóxicos in vivo es a través de estrés oxidativo y sobreproducción de especies reactivas de oxígeno intracelulares, induciendo apoptosis celular y causando inflamación severa, edema pulmonar y formación de granuloma. Por tanto, es de importancia crítica resolver el problema de toxicidad de GO.

Según reportes, la funcionalización de enlaces covalentes o no covalentes puede reducir la fuerte interacción hidrofóbica entre GO y células. Esto fue demostrado por varios estudios que mostraron que la funcionalización de GO mejora su biocompatibilidad y casi elimina su toxicidad in vivo e in vitro. Yang et al. estudiaron, por primera vez, la biodistribución a largo plazo de PEG-GO conjugado covalentemente en ratones usando un método de radiomarcado, y los resultados mostraron que PEG-GO podía excretarse gradualmente de ratones, probablemente en orina y heces. Zhang et al. compararon GO funcionalizado con DEX con GO y encontraron que GO-DEX podía reducir notablemente la toxicidad celular y ser eliminado mayormente de ratones dentro de una semana. Además, la unión no covalente de GO a plurónico F127 resulta en solubilidad y estabilidad benignas en condiciones fisiológicas, y baja toxicidad. Aunque varios polímeros o moléculas se han usado para funcionalizar GO, se han logrado resultados significativos en este campo. Sin embargo, aún se necesitan esfuerzos para desarrollar métodos simples para construir un buen portador de fármacos basado en GO biocompatible.

La taurina (Tau) es un aminoácido semi-esencial con buena estabilidad y solubilidad en agua. Tau puede prevenir enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, mantener la función visual, proteger células y regular la inmunidad. Numerosos estudios han propuesto que Tau tiene propiedades antitumorales a través de su regulación hacia arriba o abajo de factores de expresión que juegan roles importantes en varios cánceres, incluyendo pulmón, estómago, colorrectal y mama. Así, GO funcionalizado con Tau puede ejercer un papel superior como portador de fármacos anti-tumorales. En este artículo, usamos por primera vez GO funcionalizado covalentemente con Tau como nanoportador y evaluamos su citotoxicidad in vitro. Además, 5-fluorouracilo (5-FU) se usó como fármaco anticancerígeno que se cargó no covalentemente en la superficie de Tau-GO para construir un sistema de liberación de fármacos. El 5-FU-Tau-GO no solo podría reducir efectos secundarios en tejidos normales sino también mejorar la biodisponibilidad del fármaco. Consecuentemente, Tau-GO se desarrolló exitosamente como un nuevo nanomaterial basado en GO que puede tener aplicaciones biomédicas significativas en el futuro.

Experimentos y Métodos

Materiales

Polvo de grafito, solución salina fosfato amortiguada (PBS) y dimetilsulfóxido (DMSO) se compraron de Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; Carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), ácido clorhídrico (HCl) y peróxido de hidrógeno (H₂O₂ 30%) se compraron de Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; Taurina (Tau), 5-fluorouracilo (5-FU), células de hepatoma humano (HepG2), solución de penicilina-estreptomicina y suero fetal bovino (FBS) se compraron de Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; ácido sulfúrico (H₂SO₄ 98%) y permanganato de potasio (KMnO₄) se compraron de Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; nitrato de sodio (NaNO₃) y dodecilsulfato de sodio (SDS-Na) se compraron de Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT se compró de Sigma-Aldrich, Inc; DMEM se compró de HyClone, Inc; Las ratas se compraron del Centro de Animales Experimentales Benxi Changsheng. Todos los demás reactivos y químicos fueron analíticamente puros y comercialmente disponibles.

Síntesis de GO

El GO se preparó a partir de polvo de grafito según un método modificado de Hummer. Primero, 168 mL de ácido sulfúrico 98% se agregó a lo largo de la pared del matraz de un matraz de tres cuellos colocado en un baño de hielo con termómetro, y se agregaron 5 g grafito y 4 g nitrato de sodio cuando la temperatura alcanzó 5 °C. Luego, 22,5 g de permanganato de potasio se agregó lentamente en lotes durante 1 h y la temperatura se mantuvo por debajo de 5 °C. Después, el matraz de tres cuellos se transfirió a un baño de aceite y la mezcla obtenida reaccionó a 35 °C durante 30 min, luego la temperatura se aumentó a 65 °C y la reacción se agitó durante 30 min. Siguiendo este paso, la temperatura se aumentó a 85 °C y la mezcla reaccionóさらに 1 h para obtener una pasta marrón-púrpura. Esta mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 semana, se transfirió a un vaso con 700 mL de agua caliente, y se agregó gota a gota peróxido de hidrógeno 30% hasta que se volvió amarillento-marrón. La mezcla se centrifugó a 10.000 rpm, se lavó con agua caliente, y este proceso se repitió varias veces hasta que el pH del sobrenadante fue 7,0. Finalmente, el producto se secó en un liofilizador al vacío y se obtuvo nano GO.

Síntesis de Tau-GO

Un GO pesado con precisión de 50 mg se disolvió en 50 mL agua destilada, y se agregaron 150 mg EDC y 100 mg NHS para activar el GO por ultrasonicación en baño de agua con hielo durante 20 min. Luego, 10 mL de solución acuosa de Tau (0,1 g/mL) se agregó lentamente (gota a gota) en la solución acuosa de GO preparada, y el pH se ajustó a 6-7 con HCl y se agitó continuamente durante 24 h a temperatura ambiente en la oscuridad. El producto se recolectó por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min y se lavó 3 veces con agua destilada. El Tau-GO se recolectó después de liofilización.

Carga de 5-FU

Una cantidad de 20 mL solución Tau-GO se ultrasonificó durante 2 h. Una cantidad pesada con precisión de 5-FU se disolvió en una cantidad apropiada de agua destilada, y se agregó lentamente gota a gota a la solución Tau-GO preparada bajo agitación a temperatura ambiente, luego se sonificó a 30 °C en la oscuridad durante 1,5 h. Los productos se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min a 4 °C. El sedimento inferior se lavó con 20 mL agua destilada y se centrifugó (5000 rpm durante 10 min a 4 °C), y el proceso se repitió 3 veces. La capa inferior se liofilizó, el sobrenadante se colocó en un vaso, se pesó el volumen, la concentración de 5-FU se determinó por HPLC 1200 (Agilent, EE. UU.). Las condiciones de detección fueron: columna cromatográfica: C18 (4,6 × 250 nm, 5 μm); temperatura de columna: 25 °C; fase móvil: solución 0,1% KH₂PO₄ con pH 5,5; flujo: 1,0 mL/min; volumen de inyección: 20 μL; y longitud de onda de medición: 265 nm. La relación de encapsulación (EE) y eficiencia de carga de fármaco (LE) se obtuvieron por la siguiente fórmula:

$$\begin{aligned} {\text{EE}}(\%) = \frac{M_1 - C_1 \times L_1}{M_1} \times 100\% \\ {\text{LE}}(\%) = \frac{M_1 - C_1 \times L_1}{20C_0 + M_1 - C_1 \times L_1} \times 100\% \end{aligned}$$

La dosis total de 5-FU se registró como M₁, la concentración y volumen de 5-FU libre se registraron como C₁ y L₁, y la concentración del portador se registró como C₀.

Caracterización

Para caracterizar el nanocompuesto preparado, se escanearon espectros de transformada de Fourier infrarroja (FT-IR) de 4000 a 400 cm⁻¹ en el espectrómetro IRAffinity-1 (Shimadzu, Japón) para confirmar las interacciones. Los espectros de absorción UV-vis se registraron en un espectrofotómetro de barrido UV-3600 (Shimadzu, Japón). Las muestras se disolvieron en agua destilada y los tamaños de partícula, potenciales zeta y valores PDI se obtuvieron en un instrumento Nano-ZS 90 Nano (Malvern, Reino Unido). Las morfologías de las muestras se analizaron usando microscopía electrónica de transmisión JEM-2100 (TEM) (JEOL, Japón). Análisis termogravimétricos (TGA) se realizaron usando un analizador termogravimétrico (NETZSCH, Alemania) a una tasa de calentamiento de 10 °C/min de 0 a 800 °C bajo atmósfera de nitrógeno. La medición XRD de muestras se realizó por difractómetro de rayos X (Bruker, Alemania) con radiación CuKα de cobre (λ = 1,5406 Å) en ángulo amplio con ángulo 2θ. Medidas XPS se realizaron usando una sonda ESCA Omicron con radiación Al Ka monocromatizada (Thermo, América).

Liberación de Fármaco In Vitro

La liberación de fármaco in vitro se realizó a pH 1,2 (ambientes gástricos simulados), pH 6,5 (ambiente de células de cáncer hepático simulado) y pH 7,4 (simular ambiente fisiológico) a 37 °C (temperatura corporal simulada), respectivamente. En resumen, 15 mg de 5-FU-Tau-GO se colocaron en una membrana de diálisis, sumergidos en 50 mL de soluciones amortiguadoras conteniendo 0,1% SDS-Na con pH de 1,2, 6,5 y 7,4. Todas las muestras se colocaron en un baño de agua con agitación continua a velocidad de 100 rpm y temperatura de 37 °C. En puntos de tiempo predeterminados (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h y 72 h), se tomó 1 mL de cada muestra y se reemplazó con 1 mL de solución amortiguadora fresca conteniendo 0,1% SDS-Na para mantener el mismo volumen de medio de liberación. El medio liberado se centrifugó y analizó usando HPLC 1200.

Estudios de Citotoxicidad In Vitro

Ensayo MTT

El ensayo MTT se usó para evaluar la citotoxicidad de 5-FU, Tau-GO y 5-FU-Tau-GO. Brevemente, las células de hepatoma humano HepG2 se cultivaron en medio DEME, suplementado con 10% FBS y 1% antibióticos (solución penicilina-estreptomicina) a 37 °C en atmósfera humidificada de 5% CO₂. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a densidad de 5 × 10³ células por pocillo conteniendo 100 μL de medio DEME suplementado con FBS y antibióticos. La placa se colocó durante 24 h en una cámara humidificada a 37 °C conteniendo 5% CO₂. Después, el medio de crecimiento se removió y se rellenó con 100 μL medio fresco que contenía varias concentraciones (5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 μg/ml) de 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO, respectivamente. Después de 24 h incubación, las células se trataron con 20 μL solución MTT e incubaronさらに 4 h. Luego, el medio se aspiró, y los cristales de formazán se disolvieron en 150 μL DMSO. Finalmente, las placas de pocillos se agitaron a 37 °C durante 15 min en un oscilador de temperatura constante. La densidad óptica (OD) de cada muestra se midió a 570 nm usando un lector de microplacas. Los experimentos se realizaron en triplicado. La tasa de inhibición celular se calculó a partir de los resultados usando la siguiente fórmula:

$${\text{Cell}}\;{\text{inhibition}}\;{\text{rate}} = \frac{{{\text{OD}}_{{{\text{control}}}} - {\text{OD}}_{{{\text{treated}}}} }}{{{\text{OD}}_{{{\text{control}}}} }} \times 100\%$$

donde OD_control es la absorbancia obtenida por células control no tratadas, OD_treated es la absorbancia obtenida por células tratadas.

Ensayo de Tinción AO/EB

La tinción doble AO/EB se usó para evaluar los cambios morfológicos de células tratadas con 5-FU, Tau-GO y 5-FU-Tau-GO. Brevemente, células HepG2 en fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placa de 6 pocillos a densidad de 10.000 células por pocillo y cultivaron en incubadora a 37 °C y bajo atmósfera 5% CO₂. Después de 24 h, las células se trataron con concentración fija de 5-FU, Tau-GO o 5-FU-Tau-GO, e incubaronさらに 24 h. El medio en cada pocillo se removió y las células se lavaron dos veces con PBS. Luego, 1 mL PBS suplementado con 40 μL colorantes fluorescentes (1 mg/mL AO y 1 mg/mL EB mezclados en proporción 1:1) se agregaron a cada pocillo e incubaron 10 min sin luz. Las células teñidas se observaron bajo microscopio de fluorescencia y se tomaron imágenes aleatoriamente.

Estudio Farmacocinético

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las políticas y principios formulados por el Comité de Protección y Ética Animal. Un total de 24 ratas SD macho, con pesos corporales de 230-270 g, ayunaron 12 h y se dividieron aleatoriamente en 4 grupos antes de la administración del fármaco. Grupos A y B fueron inyectados intravenosamente con soluciones de 5-FU y 5-FU-Tau-GO, y grupos C y D recibieron soluciones orales de 5-FU y 5-FU-Tau-GO, respectivamente. Todos los grupos recibieron una dosis de 20 mg/kg. Después de la administración del fármaco, se recolectaron muestras de sangre (~0,5 mL) en tubos anticoagulantes en puntos de tiempo dados (15 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h y 48 h). Las muestras de plasma se separaron por centrifugación a 7500 rpm y 4 °C durante 10 min. Luego, 200 μL plasma y 50 mg (NH₄)₂SO₄ se combinaron en un tubo (10 μL de solución de estándar interno 5-BrU 40 μg/mL, secado con nitrógeno en baño de agua a 40 °C, vortexado 5 min y centrifugado a 10800 rpm durante 3 min. Luego, el tubo se agregó con 900 μL solución acetato de etilo/isopropanol (85:15, v/v), vortexado 3 min y centrifugado a 10800 rpm durante 15 min. El sobrenadante se removió y secó con nitrógeno, se agregó 100 μL de fase móvil y el tubo se vortexó 1 min. Finalmente, la solución resultante recolectada del sobrenadante se midió por HPLC 1200.

Simulación de Dinámica Molecular

La simulación de dinámica molecular se usa principalmente para analizar la fuerza de interacción entre el fármaco y el portador y el comportamiento de difusión del fármaco. La estructura química del 5-FU se construyó usando Chemdraw de chem office 2014, y las estructuras de Tau-GO y GO se realizaron en el módulo Polymer and Molecule Builders usando el software de simulación molecular Materials Studio (versión 7.0, Accelrys Inc., EE. UU.). Todos los compuestos construidos se optimizaron geométricamente bajo el campo de fuerza COMPASS II, y la conformación con la energía más baja se seleccionó como la conformación estable. Se realizó una equilibración NVT de 10 ps para cada sistema. La simulación se realizó con 100 ps MD para obtener una estructura equilibrada a 298 K y 101,325 kPa con tamaño de paso de 1 fs. Finalmente, el desplazamiento cuadrático medio (MSD) y densidad de energía cohesiva (CED) se obtuvieron para cada sistema, y el coeficiente de difusión (D) se dio por la siguiente fórmula:

$$D = \frac{1}{2d}\lim_{\tau \to \infty} \frac{d}{d\tau}\left[ \left. {r\overrightarrow{(t)} - r\overrightarrow{(0)}} \right] \right.^2$$

donde d es la dimensión del sistema, \(r\overrightarrow{(t)}\) y \(r\overrightarrow{(0)}\) son el vector de posición de la molécula de fármaco en tiempo t y 0, respectivamente, \(\left[ \left. {r\overrightarrow{(t)} - r\overrightarrow{(0)}} \right] \right.^2\) representa MSD.

Resultados y Discusión

Caracterización

El conjugado Tau-GO se fabricó mediante un enlace amida de GO y Tau. La síntesis exitosa del nanocompuesto se validó por espectros FT-IR (Fig. 1). La presencia de funcionalidades de oxígeno en GO se confirmó por los picos de absorbancia en -OH (~3405 cm⁻¹), C=O (1723 cm⁻¹), C=C (1628 cm⁻¹) y C-OH (1391 cm⁻¹). Estos resultados probaron la preparación exitosa de GO (Fig. 1a). Además de algunos picos característicos de GO, los nuevos picos a 1638 cm⁻¹ y 3427 cm⁻¹ correspondieron al grupo amida, y 1164 cm⁻¹ y 1085 cm⁻¹ correspondieron a -SO. El espectro Tau-GO indicó claramente que Tau se ha funcionalizado en la superficie de GO (Fig. 1b). En Fig. 2b, el pico característico de -SO₃ a 1164 cm⁻¹ fue inundado por la acción de enlace de hidrógeno y no fue visible en los espectros FT-IR. Por tanto, 5-FU se cargó exitosamente sobre Tau-GO.

Los espectros de absorción UV-Vis de GO se muestran en Fig. 3. El pico de absorción obvio a 234 nm se atribuyó a la transición π-π* de enlaces C=C de grafeno. Además, el pico de hombro a 300 nm se atribuyó a la transición n-π* de enlaces C=O de óxido de grafeno en grupo carboxilo o carbonilo. Los dos picos de absorción característicos probaron la preparación exitosa de GO.

El tamaño de GO, Tau-GO y 5-FU-Tau-GO se muestran en Fig. 4. Los potenciales zeta de GO, Tau-GO y 5-FU-Tau-GO se muestran en Fig. 5. El tamaño de las láminas GO fue aproximadamente 221 nm y el valor PDI aproximadamente 0,188, indicando que el GO preparado tiene distribución uniforme y buena estabilidad. El potencial zeta fue aproximadamente -33,3 mV, indicando que la carga negativa se debe principalmente a la presencia de muchos grupos que contienen oxígeno en la superficie. Cuando GO se modificó con Tau mediante enlace amida, los grupos amino reemplazaron algunos grupos carboxilo y -SO₃ tuvo mayor capacidad de ionización en solución, el potencial zeta disminuyó y se volvió -38,8 mV. El tamaño y valores PDI de Tau-GO fueron aproximadamente 242 nm y 0,190. Luego, 5-FU se cargó en Tau-GO por enlace no covalente. El potencial zeta fue aproximadamente -26,7 mV y el valor absoluto fue mayor que 20 mV. Además, el tamaño y valores PDI de 5-FU-Tau-GO fueron aproximadamente 264 nm y 0,182, esto indica que la repulsión electrostática entre partículas es grande, lo que no causa fácilmente agregación o precipitación, y que Tau tiene buena solubilidad en agua, GO también tiene buena solubilidad en agua porque su superficie está modificada por grupos funcionales que contienen oxígeno. El uso de portador Tau-GO para cargar 5-FU mejora significativamente la solubilidad en agua de 5-FU, de modo que 5-FU-Tau-GO puede dispersarse establemente en solución acuosa.

Las morfologías de GO, Tau-GO y 5-FU-Tau-GO se caracterizaron por TEM (Fig. 6). GO es una estructura plana con arrugas en la superficie, ilustrando que es una estructura bidimensional planar (Fig. 6a). Comparado con GO, el tamaño de Tau-GO aumentó ligeramente, pero aún mostró estructura laminar (Fig. 6b). La imagen 5-FU-Tau-GO mostró que los materiales no se agregaron ni cambiaron con la estructura laminar inicial de GO permaneciendo intacta (Fig. 6c). Consecuentemente, Tau-GO y 5-FU-Tau-GO tuvieron buena estabilidad.

El análisis termogravimétrico se usó para cuantificar las composiciones de los compuestos. Las curvas TGA de GO y Tau-GO se muestran en Fig. 7. GO y Tau-GO tienen masas remanentes de 39,73% y 34,22% en atmósfera de nitrógeno a 800 °C. Por tanto, al comparar los valores de cambio de peso, el contenido de Tau en Tau-GO se determinó en aproximadamente 13%.

Los patrones XRD de Tau, GO y Tau-GO se muestran en Fig. 8. El pico característico de GO puede observarse a 10,7° del valor 2θ, que confirma la formación de GO con oxidación completa para proceso fuerte de oxidación química y exfoliación. Después de funcionalizado con Tau en superficie de GO, el patrón de difracción de pico disminuyó ligeramente en valor 2θ 8,2. Esto significa que GO se ha funcionalizado exitosamente por Tau.

Los espectros XPS C1s de GO y Tau-GO se muestran en Fig. 9. Los espectros XPS C1s de GO indican que hay un grado considerable de oxidación, con la presencia de cuatro átomos de carbono correspondientes a diferentes grupos funcionales. Los espectros XPS C1s de Tau-GO también exhiben estos mismos átomos de carbono. Además, la aparición de picos de componentes relacionados con enlace C-N se atribuyeron a grupos amino, grupos amida. Estos resultados también indican que GO se funcionaliza exitosamente por Tau.

Comportamientos de Carga y Liberación de Fármaco

5-FU se adsorbió en nanoportador Tau-GO a través de interacciones no covalentes. La curva de calibración de 5-FU fue y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), y el rango fue de 6,5 ~ 250 µg/mL. La relación de encapsulación (EE) y eficiencia de carga de fármaco (LE) se determinaron por concentraciones de fármaco no unido para evaluar el rendimiento de carga de fármaco. Los resultados mostraron que EE aumentó con el aumento de concentración de fármaco, y el valor más alto de EE fue 83,2%. Según la fórmula, LE fue 33,7%, es decir, 508,52 μg de 5-FU pueden adsorberse en 1 mg de Tau-GO. Por tanto, Tau-GO es un portador de fármacos prometedor que puede lograr una gran carga de fármacos. Los posibles mecanismos de la alta capacidad de carga de 5-FU sobre Tau-GO se pueden resumir en las siguientes explicaciones: primero, Tau se usa para funcionalizar GO e introducir grupos funcionales activos (-SO₃). -SO₃ tiene fuerte capacidad de ionización en solución, lo que reduce la aglomeración entre GO y facilita la carga de 5-FU en Tau-GO. Segundo, el potencial zeta de 5-FU-Tau-GO es 12,1 mV diferente al de Tau-GO, lo que indica que 5-FU se carga en la superficie de Tau-GO, y la interacción electrostática juega un papel importante en la carga de 5-FU. Por último, hay muchas formas de enlaces de hidrógeno entre 5-FU y portador Tau-GO, incluyendo -COOH en Tau-GO y -NH- en 5-FU, -COOH en Tau-GO y -C=O en 5-FU, -OH en Tau-GO y -NH- en 5-FU, -OH en Tau-GO y -C=O en 5-FU, -COOH y 5-FU en Tau-GO -F en Tau-GO, -COOH en Tau-GO y -F en 5-FU, estos enlaces de hidrógeno hacen 5-FU-Tau-GO estable en solución.

La liberación acumulativa in vitro de 5-FU desde 5-FU-Tau-GO, a temperatura de 37 °C en solución PBS pH 1,2, 6,5 y 7,4 (simular ambiente gástrico, ambiente de células de cáncer hepático y ambiente fisiológico, respectivamente) se muestra en Fig. 10. Se encontró que el comportamiento de liberación de 5-FU fue afectado por el valor de pH del ambiente. En tampón pH 7,4, la liberación del fármaco fue lenta y continua, y la cantidad total de fármaco liberado fue aproximadamente 70,84% después de 72 h. En contraste, la cantidad de fármaco liberado a pH 7,4 fue significativamente menor que a pH 1,2 y pH 6,5 en el mismo punto de tiempo. La carga total de fármaco liberada desde 5-FU-Tau-GO se logró aproximadamente 90,29% y 85,75% a pH 1,2 y pH 6,5, respectivamente. Puede atribuirse a las interacciones π-π y enlaces de hidrógeno entre 5-FU y Tau-GO. Cuanto menor el valor de pH, mayor el grado de protonación del enlace de hidrógeno. Por tanto, la fuerza del enlace de hidrógeno fue controlada por valor de pH, lo que llevó a la liberación de 5-FU. Este sistema de liberación de fármacos sensible a pH juega un papel importante en fármacos anti-tumorales y puede lograr la liberación del fármaco en la célula tumoral.

Estudios de Citotoxicidad In Vitro

Para evaluar la toxicidad potencial y la eficacia de terapia tumoral del nanoportador, la viabilidad celular in vitro se realizó en células HepG2 usando ensayos MTT (Fig. 11). Tau-GO no mostró citotoxicidad significativa a diferentes concentraciones. Después de carga de 5-FU, 5-FU-Tau-GO mostró un efecto de inhibición obvio, y de manera dependiente de la dosis, por tanto, el nanoportador tuvo la capacidad de liberar fármacos antitumorales. El valor IC₅₀ de 5-FU-Tau-GO fue 65,2 ± 0,7 μg/mL, que fue más tóxico que 5-FU libre (196 ± 8,73 μg/mL). Esto puede deberse a la capacidad de taurina para inducir apoptosis en células tumorales, mejorando indirectamente el efecto inhibitorio de 5-FU en células. Además, se pudo ver del experimento de liberación in vitro que 5-FU cargado en Tau-GO podía liberarse gradualmente en las células. Por tanto, el tiempo efectivo de 5-FU-Tau-GO en células fue más largo que el de 5-FU libre, y así produjo mejor inhibición.

El agente fluorescente AO podía emitir fluorescencia verde cuando atravesaba membranas celulares intactas y teñía núcleos, mientras EB solo marcaba el núcleo de células dañadas que emitían fluorescencia roja/naranja. Las células con apoptosis temprana y tardía presentaron núcleos verdoso-amarillos o naranjas con tinción AO/EB, respectivamente. Por tanto, se realizó tinción AO/EB para investigar si la muerte celular se asociaba con apoptosis usando características de cambios morfológicos celulares. Los resultados obtenidos de la tinción AO/EB se presentan en Fig. 12. Las células control tenían forma de huso y núcleos verdes. En el grupo celular cultivado solo con Tau-GO, pequeñas partes de los núcleos estaban invaginados y con tinción verde oscuro o rojo-naranja. Se observaron células apoptóticas naranjas o rojas significativas con fragmentos de cromatina y cuerpos apoptóticos en el grupo solo 5-FU. Comparado con 5-FU, 5-FU-Tau-GO causó más daño a la morfología de células HepG2, que no solo rompió las células, sino que también causó gran cantidad de apoptosis en células cancerosas. Como se ve en las imágenes, casi todas las células tratadas con 5-FU-Tau-GO tuvieron cambios morfológicos, gran cantidad de desechos celulares y cuerpos apoptóticos, indicando que el sistema nano de liberación de fármacos 5-FU-Tau-GO tuvo buen efecto de eliminación en células HepG2.

Estudios Farmacocinéticos

Los estudios farmacocinéticos de 5-FU y 5-FU-Tau-GO se realizaron en ratas SD. Los perfiles de concentración de 5-FU en plasma vs. tiempo, tras administración oral, se presentan en Fig. 13a. Encontramos que la tendencia de las dos curvas era similar, pero la concentración plasmática de 5-FU del nanoportador 5-FU-Tau-GO fue mayor que la de 5-FU solo y esto se observó en cada punto de tiempo medido. La Figura 13b muestra los perfiles de liberación in vivo de 5-FU vía vena cola. 5-FU-Tau-GO pudo lograr liberación sostenida del fármaco por más de 24 h, y la concentración del fármaco disminuyó gradualmente en las primeras horas, indicando que 5-FU se liberó lentamente.

El modelo de dos compartimentos se usó para analizar los parámetros farmacocinéticos de administración oral o intravenosa en ratas. Los parámetros farmacocinéticos se presentan en Tabla 1. Comparado con 5-FU, 5-FU-Tau-GO mostró T_1/2β más altos que fueron 2,3 veces por administración oral, y 3,0 veces por inyección intravenosa, respectivamente. Además, el área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC_0-t) de nanocomplejos 5-FU-Tau-GO fue aproximadamente 2,1 veces mayor por administración oral, y 2,8 veces mayor por inyección intravenosa comparado con la de solución 5-FU, respectivamente. Por tanto, concluimos que 5-FU-Tau-GO podría extender significativamente el tiempo de retención de 5-FU in vivo y mejorar la biodisponibilidad. Además, el T_1/2β de nanocomplejos 5-FU-Tau-GO administrados oralmente (1,67 ± 1,15 h), fue más largo que el de inyección intravenosa (1,33 ± 0,64 h); sin embargo, el AUC_0-t de administración oral (36,02 ± 1,83 mg/L*h) fue menor que el de inyección intravenosa (96,50 ± 8,70 mg/L*h). Estos resultados pueden deberse a dos aspectos: por un lado, cuando se administra por inyección intravenosa, el fármaco entra directamente al sistema sanguíneo para circulación sin pasar por la barrera gastrointestinal para redistribución; por otro lado, porque 5-FU causa fácilmente cierto daño al sistema gastrointestinal, también puede afectar el uso efectivo de fármacos en el cuerpo.

Simulaciones MD

El acoplamiento molecular y dinámica molecular de GO sin modificar, Tau-GO y 5-FU se simularon por acoplamiento molecular y simulación de dinámica molecular. Los resultados de acoplamiento molecular de GO, Tau-GO y 5-FU se muestran en Fig. 14, donde se ve que las longitudes de enlace de 5-FU con GO y Tau-GO son 3,66 Å y 2,602 Å, respectivamente. Además, de los resultados de cálculo, las energías de unión de 5-FU a GO y Tau-GO fueron 47,69 kcal/mol y 25,04 kcal/mol, respectivamente. Estos indicaron que la fuerza de unión de Tau-GO y 5-FU fue más fuerte que la de GO y 5-FU. Esto se debe a que átomos polares de Tau, como S y N, forman un enlace no covalente más fuerte con 5-FU, que hace la fuerza entre Tau-GO y 5-FU más fuerte.

Los diagramas de simulación de dinámica molecular de GO, Tau-GO y 5-FU se mostraron en Fig. 15. Según resultados de cálculo, CED de 5-FU-GO y 5-FU-Tau-GO fueron 2,67×10⁸ y 2,83×10⁸, respectivamente. Estos resultados mostraron una interacción más fuerte entre el fármaco y Tau-GO. Los gráficos entre MSD y tiempo se graficaron (Fig. 16) para obtener el coeficiente de difusión vía MSD. Los coeficientes de difusión del fármaco se obtuvieron por la pendiente dividida por 6 como sigue: 0,094 m²/s y 0,058 m²/s. Estos muestran que la fuerza entre Tau-GO y 5-FU es más fuerte, lo que es consistente con resultados de acoplamiento molecular. Por tanto, GO funcionalizado hace el portador completo más abundante en átomos y grupos; por tanto, haciendo el enlace no covalente con 5-FU más fuerte, y el sistema completo más estable.

Conclusiones

En resumen, preparamos exitosamente un nanocompuesto Tau-GO mediante un método químico simple. La funcionalización de GO con Tau tiene buena estabilidad y mejora su biocompatibilidad. La estructura única y brillantes propiedades de nanoportadores Tau-GO ofrecen grandes oportunidades para la carga y liberación de 5-FU. 5-FU-Tau-GO tiene potencial habilidad anti-tumoral y excelente tiempo de circulación de fármacos. Por tanto, creemos que la modificación de GO por el portador Tau para carga de 5-FU, es una herramienta efectiva y aplicable para construir un sistema nano de liberación de fármacos 5-FU-Tau-GO para la liberación de fármacos anticancerígenos y terapia anti-tumoral.