Fabricación, caracterización y actividad biológica de sistemas de nanoportación de avermectina con diferentes tamaños de partículas

Experimental

Materiales

PLA y Av fueron proporcionados por Nature Works y Qilu Pharmaceutical Co., Ltd. (Inner Mongolia, P. R. China), respectivamente. Alcohol polivinílico (PVA), 87–90% hidrolizado con un M _w promedio de 30.000 a 70.000, se compró a Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co., Ltd. (Shanghai, República Popular de China). La gelatina se compró a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, República Popular de China). Las membranas de diálisis se compraron a Beijing Tianan Technology Co., Ltd. (República Popular de China). Otros reactivos químicos eran de calidad analítica y se adquirieron en Beijing Chemical Works (Beijing, República Popular de China). El agua utilizada en todos los experimentos fue de grado Milli-Q (18,2 MΩ cm, TOC ≤ 4 ppb) y se obtuvo de un sistema Milli-Q Advantage A10 (Millipore, Milford, MA, EE. UU.).

Preparación del sistema de nano liberación de avermectina

El sistema de nanoportación de Av se preparó mediante un método de emulsión de aceite en agua (O / W) combinado con un proceso de emulsión física ultrasónica y de cizallamiento. Brevemente, se disolvieron PLA y Av en cloruro de metileno como fase oleosa. Para la fase acuosa, se disolvió gelatina en agua a 40 ° C, que luego se mezcló con una solución acuosa de PVA. Luego, la fase oleosa se goteó lentamente en un gran volumen de la fase acuosa bajo emulsificación de alto cizallamiento (FA25, FLUKO, Ruhr-gebiet, Alemania), para preparar una emulsión gruesa. A continuación, la emulsión gruesa se dispersó uniformemente mediante emulsificación ultrasónica (JY 92-IIN, SCIENTZ, Ningbo, República Popular de China). Después, la emulsión uniforme se solidificó con agitación magnética durante la noche (RW20, IKA, Staufen, Alemania). El sistema de nanoportación de Av endurecido se recogió mediante centrifugación y se lavó tres veces con agua desionizada. Los productos se recogieron por centrifugación y luego se liofilizaron (FD-81, EYELA, Tokio, Japón) para producir un polvo que fluye libremente. El polvo seco se almacenó a 4 ° C hasta su uso.

Caracterización de los sistemas de nanoentrega

La morfología de cada sistema de nanoportación de Av se investigó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, JSM-6700 F, JEOL Ltd., Akishima-shi, Japón) con un voltaje de aceleración de 5 kV. Las muestras de SEM se depositaron gota a gota sobre la superficie de una rodaja de silicio. La gota se dejó secar a temperatura ambiente y luego se revistió con una capa delgada de platino usando un revestidor por pulverización catódica (EM ACE600, Leica, Viena, Austria), para evitar la carga durante la observación SEM. Los tamaños de las partículas en los sistemas de nanoportación de Av se midieron a 25 ° C mediante dispersión láser utilizando un zetasizer (Zetasizer NanoZS90; Malvern, Worcestershire, Reino Unido).

Determinación de la carga de avermectina en los sistemas de nanoproducción

La cantidad de Av en el sistema de nanoportación se midió a una longitud de onda de 245 nm, utilizando un espectrofotómetro ultravioleta visible (UV-vis) (TU901, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón). En detalle, las muestras cargadas con Av se pesaron y se disolvieron en cloroformo durante la noche, después de lo cual la solución se secó mediante destilación a presión reducida. Luego se añadió metanol para disolver el Av del precipitado seco. Finalmente, la mezcla se filtró para producir una solución transparente que se analizó mediante espectrofotometría UV-vis.

Liberación controlada de avermectina a partir de los sistemas nanoportadores

Los perfiles de liberación de Av de los sistemas de nanoportación de diferentes tamaños se investigaron de la siguiente manera. Se suspendieron muestras av de nanoparto de cada tamaño en 10 ml de mezcla de etanol / agua (1:1, v / v ). Luego, la suspensión se transfirió a una bolsa de diálisis, que se selló en un matraz marrón con 90 ml de mezcla de etanol / agua (1:1, v / v ) como medio de liberación. El matraz se incubó en un agitador incubador a 300 rpm a temperatura ambiente. Después de intervalos de tiempo definidos, se retiraron 5,0 ml de solución y se sustituyeron por 5,0 ml de disolvente nuevo. La tasa de liberación de Av de la muestra de nanoparto se calculó midiendo las concentraciones de Av disuelto en el medio de liberación a diferentes intervalos y se usó para evaluar la propiedad de liberación sostenida. La concentración de Av se midió usando un espectrofotómetro UV-vis a una longitud de onda de 245 nm. Se utilizó abamectina técnica (TC, ingrediente activo de grado técnico) como controles.

Comportamiento de fotólisis de avermectina en el sistema de nano-administración

El comportamiento fotolítico de Av en el sistema de nanoportación se evaluó con el Av WDG comercial como control. Las muestras se disolvieron en metanol / agua (1:1, v / v ) y se dividieron igualmente en placas de cultivo, y las muestras resultantes se irradiaron durante un tiempo deseado a 25 ° C bajo una lámpara UV (500 W), que tenía una intensidad máxima a una longitud de onda de 365 nm. A intervalos de tiempo especificados (12, 24, 36, 48, 60 y 72 h), se sacó la placa de cultivo del reactor y se analizó la concentración de Av de las muestras.

Pruebas de estabilidad

La estabilidad del sistema de nanoportación Av se probó de acuerdo con CIPAC MT 46 y GB / T 19136-2003. Las muestras se empaquetaron en tubos de vidrio y se almacenaron a 0 ± 2 ° C durante 7 días y 54 ± 2 ° C durante 14 días. Luego, se estudiaron los cambios en la cantidad de Av en el sistema de nano-administración.

Bioensayos

Se realizaron bioensayos del sistema de nanoportación de Av de diferentes tamaños utilizando el método de inmersión de hojas. Las muestras se diluyeron con solución acuosa de Triton X-100 a diferentes concentraciones de Av. Repollo ( Brassica oleracea L.) se sumergieron en la suspensión de Av diluida, luego se secaron a temperatura ambiente y se unieron a una placa de Petri. Se introdujeron larvas de pulgón en cada placa y los pulgones tratados se cultivaron en una incubadora a 25 ° C y 75% de humedad relativa. Se realizaron cuatro repeticiones para comparar con la prueba de control. La mortalidad se evaluó a las 48 h del tratamiento. Los datos de concentración-mortalidad se analizaron mediante el software estadístico DPS v12.01. Las concentraciones letales medias (LC ₅₀ ) y se calcularon sus límites de confianza del 95%. Se utilizó WDG comercial como control.

Resultados y discusión

Construcción y caracterización del sistema de nanoportación de avermectina

Los sistemas de nanoportación de Av se construyeron de acuerdo con el procedimiento que se muestra en la Fig. 1. Durante el proceso, las fases de agua y aceite se prepararon de acuerdo con el método mencionado anteriormente. La fase oleosa se emulsionó en una fase acuosa (emulsión de aceite en agua) mediante emulsificación de alto cizallamiento, para preparar una emulsión gruesa. A continuación, la emulsión de curso se dispersó uniformemente mediante emulsificación ultrasónica. A esto le siguió la agitación, evaporación y centrifugación de las nanopartículas resultantes. El tamaño de partícula de un sistema de administración es uno de los factores más importantes que afectan las propiedades de liberación y la actividad biológica del pesticida. Como se muestra en la Fig. 2, se construyeron sistemas de nanoportación de Av con tamaños de partículas que oscilan entre 344 y 827 nm controlando los parámetros de síntesis. El tamaño de las partículas es un parámetro importante para las propiedades de liberación controlada de los plaguicidas. El tamaño de partícula de los sistemas de nanoportación de Av podría controlarse cambiando la relación de concentración de PVA / gelatina. Se prepararon varios sistemas de nanoportación de Av con tamaños que van desde 344 a 827 nm y contenidos de Av que van desde 33,4 a 57,5% (33,4, 44,9, 45,2 y 57,5%), como se muestra en la Fig. 3. Todos los productos Av tenían superficies y morfologías de partículas esféricas.

Esquema que muestra la preparación del sistema de nanoimpresión Av

Imágenes SEM ( a - d ) y distribuciones de tamaño ( e ) de sistemas de nanoportación Av con diferentes tamaños de partículas

Cantidades de Av en sistemas de nano-administración de Av con diferentes tamaños de partículas

Liberación de avermectina del sistema de nano-administración in vitro

En los últimos años, el desarrollo de sistemas de liberación de plaguicidas ha evolucionado hacia una liberación precisa y cuantitativa, en contraste con los anteriores sistemas de liberación lenta y cualitativa. Para lograr una liberación controlable, se investigaron sistemáticamente los perfiles de liberación de los sistemas de nanoportación de Av con varios tamaños de partículas. La Figura 4 muestra el porcentaje de liberación de Av de los sistemas de nano-entrega con diferentes tamaños de partículas después del mismo intervalo de tiempo. El Av técnico tuvo una tasa de liberación rápida y fue liberado casi por completo después de 25 h. El período de validez duradera de los plaguicidas necesita la liberación sostenida de plaguicidas para mantener la eficacia durante mucho tiempo. En comparación con la liberación en ráfaga de la abamectina técnica, todos los sistemas de nanoportación preparados liberaron Av a velocidades relativamente lentas y mantuvieron la liberación sostenida durante períodos más largos. Los perfiles de liberación av de los sistemas de nanoportación consistieron en una liberación en ráfaga seguida de una liberación gradual durante el período de tiempo de 240 h del experimento. A medida que el tamaño del sistema de administración disminuyó de 827 a 344 nm, la liberación acumulada aumentó de 53,2 a 79,4% después de 240 h. Los resultados indicaron que la tasa de liberación de Av del sistema de nanoportación aumentó gradualmente con la disminución del tamaño de partícula. Esto se debió a una mayor superficie expuesta a los alrededores, lo que ayudó a la permeabilidad y la efusión del pesticida ubicado en las carcasas del sistema de nano distribución. Los resultados mostraron que la tasa de liberación de Av del sistema de nano-entrega podría controlarse de manera efectiva modificando el tamaño de las partículas.

Comportamientos de liberación de los sistemas de nanoportación de Av con diferentes tamaños de partículas en etanol / agua (50:50, v / v ) más de 200 h

Actividad biológica

La actividad biológica de Av liberada de sistemas de nanoportación de diferentes tamaños de partículas contra pulgones se muestra en la Fig. 5. El LC ₅₀ del sistema de nanoportación Av disminuyó gradualmente con la disminución del tamaño de partícula. Según se informa, la biodisponibilidad de las nanoemulsiones es más alta que la de las emulsiones convencionales debido a su tamaño de partícula más pequeño y a una relación superficie-volumen más alta. Por lo tanto, las actividades biológicas más altas de los sistemas de nanoprocesamiento de Av con tamaños de partículas más pequeños se atribuyeron al aumento de la dispersabilidad, la humectabilidad y la retención causadas por los efectos a pequeña escala. Todos los sistemas de nanoimpresión de Av tenían una LC ₅₀ más baja valores y actividades superiores a las comerciales Av WDG. La alta eficacia se debió a las nanopartículas que mejoran la adhesión y la penetración del pesticida Av en la superficie de los cultivos, lo que reduce la pérdida de pesticida debido a fugas durante la fumigación.

Resultados de bioensayos de sistemas de nanoportación de Av con diferentes tamaños de partículas

Propiedades de protección contra los rayos UV de la avermectina en el sistema de nanopartición

Para verificar las propiedades de protección contra los rayos UV de Av en el sistema de nanoportación, se estimó la tasa fotolítica de Av mediante irradiación artificial. El análisis de la tasa de fotólisis de Av con tiempo de irradiación se muestra en la Fig. 6. El porcentaje fotolítico de abamectina fue del 18,7% para el sistema de nanoportación y del 46,7% para el Av WDG comercial después de 48 h. Después de 72 h, el porcentaje fotolítico de abamectina fue del 25,6% para el sistema de nanoportación y del 51,5% para el Av WDG comercial. Estos resultados mostraron que el sistema de nanoportación exhibía fotólisis inhibida de Av debido al efecto protector del portador de la pared.

Comparación del porcentaje de fotólisis de Av con el WDG comercial y el sistema de nanoprocesamiento bajo irradiación UV

Estabilidad de almacenamiento

Las estabilidades de los sistemas de nanoportación de Av con diferentes tamaños de partículas se evaluaron midiendo su contenido de carga a temperaturas de 0, 25 y 54 ° C. La Figura 7 muestra que el sistema de nano-entrega se mantuvo estable sin cambios importantes en la carga de Av durante el almacenamiento a temperatura ambiente y baja temperatura. Se observó una pequeña pérdida de Av después de 14 días a 54 ° C, debido a la degradación de Av a alta temperatura. Estos resultados mostraron que el sistema de nanoprocesamiento Av tenía una buena estabilidad de almacenamiento.

Estabilidad del sistema de nanoprocesamiento de Av a diferentes temperaturas de almacenamiento

Conclusiones

Para mejorar la liberación controlada, la estabilidad química y la bioactividad de Av, se sintetizó un sistema de nanoportación de Av con diferentes tamaños de partículas promedio utilizando el método de polimerización en emulsión. El sistema de nanoportación Av mostró un comportamiento de liberación constante. La tasa de liberación de Av del sistema de nanoportación aumentó gradualmente con la disminución del tamaño de partícula, debido a una mayor área de superficie. La actividad biológica del sistema de nanoportación de Av aumentó gradualmente con la disminución del tamaño de partícula, debido a una mayor adhesión y penetración. El sistema de nanoportación Av mostró buenas propiedades anti-fotólisis y estabilidad. El sistema de administración supera las deficiencias de los bioplaguicidas actuales, como su sensibilidad ambiental, la adsorción indeseable del suelo y la corta duración de la actividad. Esto mejorará la eficacia de los plaguicidas y reducirá la frecuencia de aplicación requerida.

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