Ingeniería de Microcápsulas Polielectrolíticas Fluorescentes con Codificación de Puntos Cuánticos para Aplicaciones Teranósticas Avanzadas

Resumen

Las microcápsulas polielectrolíticas están emergiendo como transportadores versátiles para fármacos, agentes de imagen y nanomateriales. Aquí reportamos una ruta de fabricación robusta que incorpora puntos cuánticos (QDs) CdSe/ZnS solubles en agua estabilizados con un ligando de polietilenglicol (PEG) tri-funcional en capas polielectrolíticas. Las microcápsulas codificadas con QDs resultantes fueron caracterizadas completamente por dispersión dinámica de luz, movilidad electroforética, microscopía electrónica de barrido y microscopía de fluorescencia/confocal. Cuantificamos distribución de tamaño, carga superficial, morfología, propiedades ópticas y dinámicas de vida de fluorescencia, e identificamos la carga óptima de QDs que maximiza el brillo mientras preserva la integridad estructural. Finalmente, demostramos internalización eficiente de las cápsulas por macrófagos murinos, confirmando su idoneidad para imagen de células vivas y aplicaciones teranósticas.

Introducción

La entrega dirigida e imagen de terapéuticos permanecen centrales para la medicina traslacional. Las microcápsulas polielectrolíticas, ensambladas por deposición capa-por-capa de polímeros de carga opuesta, pueden encapsular fármacos, nanopartículas metálicas o sondas fluorescentes, permitiendo liberación controlada y seguimiento en tiempo real de la carga. Al codificar estas capas con QDs semiconductores, obtenemos agentes que entregan simultáneamente cargas terapéuticas y proporcionan señales de imagen de alto contraste y fotostables.

El enfoque capa-por-capa (LbL) ofrece control fino sobre grosor de pared, porosidad y química de superficie, haciéndolo ideal para sistemas sensibles a estímulos. Los QDs, con su absorción amplia y bandas de emisión estrechas, permiten excitación multiplexada desde una sola fuente de luz, superando a colorantes convencionales en brillo y fotostabilidad.

Trabajos previos han codificado cápsulas polielectrolíticas con colorantes orgánicos o puntos de carbono, pero estas estrategias a menudo requieren tratamiento térmico severo o resultan en estructuras rígidas, menos responsivas. Nuestro estudio introduce un método de transferencia de QDs acuoso más suave que preserva la flexibilidad y responsividad de la cápsula mientras entrega rendimiento óptico superior.

Experimental

Solubilización y Caracterización de Puntos Cuánticos

QDs CdSe/ZnS núcleo/capa (λmax = 590 nm) fueron donados por Dr. Pavel Samokhvalov (MEPhI). Los QDs hidrofóbicos se volvieron solubles en agua por intercambio de ligando: TOPO fue desplazado con cisteína d,l-, luego reemplazado con HS–PEG12–COOH (Thermo Fisher). Tras lavados sucesivos, los QDs se dispersaron en 0,1 M NaOH, sonicaron, centrífugaron y filtraron a través de membrana de 0,22 µm. La concentración de QDs se determinó espectrofotométricamente en el primer pico de excitón, y las partículas se estabilizaron añadiendo HS–PEG12–COOH a ratio molar 1:4,6, seguido de incubación 24–48 h a 2–8 °C.

Síntesis de Micropartículas de Carbonato de Calcio

Microesferas de carbonato de calcio se prepararon mezclando soluciones equimolares de Na2CO3 y CaCl2 (0,33 M cada una) bajo agitación controlada (250, 500, 750 rpm). Tras 15–60 s, la mezcla se enfrió, lavó con agua MilliQ y secó a 60 °C por 90 min. Tamaño de partícula óptimo (4–6 µm) y morfología regular se lograron a 250 rpm y 30 s agitación, confirmado por SEM (Fig. 1).

Preparación de Microcápsulas Polielectrolíticas Codificadas con QDs

Núcleos de carbonato de calcio se recubrieron primero con cinco pares de capas PAH/PSS (poli(alilamina hidrocloruro) y poli(sodio 4-estirensulfonato)), terminando con una capa PAH. Los QDs se adsorbieron luego sobre la superficie cargada positivamente, seguidos por capas PAH/PSS adicionales y una capa PAH final. El núcleo se removió por tres incubaciones consecutivas de 15 min en 0,2 M EDTA (pH 6,5), produciendo microcápsulas huecas. Para estudios de interacción celular, se aplicó un recubrimiento final de BSA (1 %) para reducir unión no específica.

Técnicas de Caracterización

Diámetro hidrodinámico y potencial ζ se midieron por DLS y movilidad electroforética (Malvern Zetasizer NanoZS). Vidas de fluorescencia se registraron usando láser pulsado YAG:Nd3+ (350 ps, 50 Hz) y detector fotomultiplicador. La carga de QDs se cuantificó midiendo QDs no unidos en el sobrenadante. SEM (JEOL JSM-7001F) visualizó morfología de partículas, mientras microscopía de fluorescencia y confocal (Zeiss Axio Scope, Leica TCS SP5) evaluaron propiedades ópticas y captación celular.

Estudios de Captación Celular

Macrófagos alveolares murinos (MH-S) se incubaron con ~1,2 × 10⁶ cápsulas codificadas con QDs recubiertas de BSA por 4 h (corto plazo) o 24 h (largo plazo). Tras contra-tinción de núcleos con DRAQ5, imágenes confocales revelaron internalización de cápsulas individuales y agregados, con mayor captación observada tras exposición prolongada (Fig. 9).

Análisis Estadístico

Los datos representan medias ± DE de al menos tres experimentos independientes, analizados con Excel y Origin Pro.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización de Micropartículas de Carbonato de Calcio

Condiciones óptimas de agitación (250 rpm, 30 s) produjeron partículas casi esféricas (4–6 µm) con agregación mínima (Fig. 1). Imágenes SEM confirmaron superficie porosa compuesta de granos sub-micrónicos, adecuada para ensamblaje LbL subsiguiente.

Preparación y Caracterización de Microcápsulas Codificadas con QDs

Los QDs exhibieron pico de emisión estrecho a 590 nm y diámetro hidrodinámico de ~25 nm (Fig. 2). La deposición secuencial PAH/PSS invirtió la carga superficial como se esperaba (Tabla 1). Imágenes SEM (Fig. 4) muestran engrosamiento progresivo de la capa, mientras microscopía de fluorescencia confirma la presencia de QDs dentro de la capa (Fig. 5). Imagen confocal (Fig. 6) revela un núcleo hueco claro, indicando disolución exitosa del núcleo.

Eficiencia de Codificación

Los QDs se adsorbieron sobre la superficie cargada positivamente con aumento lineal hasta ~2,24 mg carga; concentraciones mayores llevaron a saturación y adsorción reducida (Fig. 7a). La intensidad de fluorescencia se estabilizó a lo largo del rango cargado, proporcionando contraste suficiente para imagen (Fig. 7b).

Vida de Fluorescencia

QDs puros mostraron la vida más larga, que disminuyó al incorporarse en micropartículas y aún más tras remoción del núcleo (Tabla 2). Las vidas se estabilizaron tras 48 h, sugiriendo efecto de fotoblanqueo a largo plazo insignificante.

Interacción Celular

Imágenes confocales demuestran fagocitosis eficiente de cápsulas individuales y agregados por células MH-S tras incubación de 4 h y 24 h (Fig. 9). Las cápsulas eran claramente distinguibles de núcleos y a menudo aparecían adheridas a o dentro de células, confirmando su potencial como agentes de imagen de células vivas.

Conclusiones

Hemos establecido un método escalable y acuoso para incorporar QDs solubles en agua estabilizados con PEG en microcápsulas polielectrolíticas. Las cápsulas resultantes exhiben tamaño uniforme, fluorescencia robusta y captación celular eficiente, posicionándolas como plataformas teranósticas prometedoras para entrega dirigida de fármacos e imagen en tiempo real.

Abreviaturas

EDTA

Disodio etilendiaminotetraacetato

PAA

Ácido poliacrílico

PAH

Policatión poli(alilamina hidrocloruro)

PEG

Polietilenglicol

PSS

Polianión poli(sodio 4-estirensulfonato)

QD

Punto cuántico

RPMI medium

Medio Roswell Park Memorial Institute

SEM

Microscopía electrónica de barrido

TOPO

Óxido de trifenilfosfina