Óxido de grafeno recubierto con quitosano y reducido por microondas para administración dirigida de adriamicina y terapia mejorada del cáncer de mama

Resumen

Para lograr una mejor eficacia antitumoral, es urgente mejorar la eficiencia de administración de fármacos anticancerígenos dirigidos a células cancerosas. En este trabajo, se fabricaron nanosheets de óxido de grafeno funcionalizado con quitosano (ChrGO) mediante reducción asistida por microondas, que se emplearon en el nanosistema de administración intracelular para agente de fármaco anticancerígeno en células de cáncer de mama. La investigación de carga y liberación de fármaco indicó que la adriamicina puede cargarse eficientemente en y liberarse desde los nanosheets de ChrGO. Menor liberación de fármaco durante la administración y mejor biocompatibilidad de ChrGO/adriamicina mejoran significativamente su seguridad y eficacia terapéutica en células BT-474 sobreexpresoras de HER2. Además, ChrGO/adriamicina en combinación con trastuzumab exhibió actividad antitumoral sinérgica en células BT-474, demostrando una eficacia terapéutica superior comparada con cada fármaco por separado. Las células tratadas con trastuzumab (5 μg/mL) o ChrGO/adriamicina equivalente (5 μg/mL) provocaron cada una 54,5% y 59,5% de muerte celular, respectivamente, mientras que el tratamiento combinado con trastuzumab y ChrGO/adriamicina resultó en una dramática muerte celular del 88,5%. La terapia de doble objetivo mostró mayor apoptosis, indicando una eficacia terapéutica superior debido a la presencia de diferentes mecanismos de acción. El tratamiento combinado de ChrGO/adriamicina y trastuzumab en células BT-474 indujo arresto del ciclo celular y apoptosis, lo que finalmente llevó a la muerte de células cancerosas aumentadas. Este trabajo ha proporcionado una fabricación asistida por microondas facil de ChrGO como nanosistema de administración de fármacos intracelular controlado y dirigido, que se espera sea una terapia novedosa prometedora para tratar células de cáncer de mama sobreexpresoras de HER2.

Introducción

El receptor HER2 es un miembro de la familia del receptor EGFR que media el crecimiento y diferenciación de células cancerosas y está altamente sobreexpresado en el 20-30% de los cánceres de mama humanos, llevando a un fenotipo tumoral metastásico y pronóstico pobre [1]. HER2 también está sobreexpresado en aproximadamente el 20% de los cánceres gástricos humanos [2]. Trastuzumab, un anticuerpo monoclonal terapéutico humanizado, demuestra ventajas terapéuticas prometedoras como terapia de primera línea en pacientes con cáncer de mama sobreexpresor de HER2 [3]. Sin embargo, la tasa de respuesta global a trastuzumab permanece modesta: 15-30% cuando se trata como terapia única y 50-75% cuando se usa en tratamiento combinado con fármacos de quimioterapia [4]. Entre esos pacientes que responden a trastuzumab, la mayoría eventualmente progresa tras la respuesta inicial y adquiere resistencia con el tiempo tras tratamiento continuo [5]. Así, es esencial y necesario desarrollar terapias novedosas adicionales para pacientes sobreexpresores de HER2 para mejorar las tasas de supervivencia global.

Las antraciclinas aún sirven como base del tratamiento del cáncer. Para los agentes antraciclina, el inhibidor de topoisomerasa II adriamicina se ha usado ampliamente para tratar muchos cánceres, como cáncer de mama, pulmón y linfoides [6]. La adriamicina tiene eficacia efectiva en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama sobreexpresor de HER2, debido a la proximidad entre el gen HER2 y el gen topoisomerasa II [7]. A pesar del beneficio clínico observado con terapias basadas en antraciclinas en cáncer de mama, la disfunción cardíaca ha restringido aplicaciones terapéuticas más expansivas. En el ensayo clínico, trastuzumab en combinación con adriamicina demostró eficacia significativa, mientras que la cardiotoxicidad altamente dependiente de la dosis fue un problema que debe resolverse [8]. La liberación sostenida de agentes de quimioterapia en el tejido diana de cáncer se reconoce como una buena solución para reducir las dosis requeridas para eficacia terapéutica y mejorar los perfiles de seguridad [9]. Para lograr mejor eficacia antitumoral pero menos efectos secundarios, hay una necesidad urgente de mejorar la eficiencia de administración de fármacos anticancerígenos en el blanco de células cancerosas.

Los nanomateriales basados en óxido de grafeno (GO) han mostrado gran promesa en la administración controlada de agentes de quimioterapia [10]. Numerosos estudios han demostrado que la toxicidad del GO está asociada con su funcionalización superficial [11]. Recientemente, agentes respetuosos con el medio ambiente, como quitosano y PEG, se han reportado para funcionalizar GO con grupos funcionales superficiales menos tóxicos [12, 13]. La estabilidad coloidal de nanopartículas en medios biológicos es crucial para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos efectivos y seguros para uso clínico [14]. Los nanosheets de GO funcionalizados han ganado gran atención en aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades como biocompatibilidad y estabilidad. Como excelente candidato para biomaterial basado en grafeno, la estabilidad coloidal de GO o rGO es importante para controlar el rendimiento de portadores de fármacos. El GO funcionalizado con poli(etilenglicol) exhibió una propiedad coloidal mejorada en medios de cultivo celular [15]. P. Khanra reportó un método novedoso para la reducción y bio-funcionalización simultánea de GO usando células de levadura como biocatalizador reductor [16, 17]. Avinav G presentó una biosíntesis one-pot de GO utilizando extracto de levadura durante un proceso de autoclave [18]. El tratamiento de sonicación de láminas de GO de tamaño micrométrico durante horas resultó en nanosheets de GO, que mostraron mayor estabilidad coloidal comparado con GO de tamaño micrométrico regular [19]. Aunque los estudios previos demostraron el alto potencial de GO para biomateriales, los nanosheets de GO bio-funcionalizados con quitosano por reducción asistida por microondas usando extracto de levadura libre de células no se habían estudiado hasta ahora. Para este propósito, se construyó una novedosa estructura de óxido de grafeno funcionalizado con quitosano (ChrGO) por un sistema de síntesis por microondas facil que utiliza extracto de levadura como reductor. Además, la funcionalización efectiva de GO con quitosano biocompatible proporciona una plataforma potencial para carga y administración eficiente de fármacos. Los estudios de carga y liberación de fármaco demostraron que la adriamicina se cargó eficientemente en y liberó desde los nanosheets de ChrGO. Los compuestos ChrGO/adriamicina mostraron actividad antitumoral significativa de manera dependiente de la concentración. Particularmente, el tratamiento combinacional con ChrGO/adriamicina y trastuzumab resultó en un efecto de inhibición de crecimiento mejorado en células BT-474 comparado con monoterapia. La eficacia antitumoral sinérgica de estos agentes se reveló mediada a través de arresto del ciclo celular y apoptosis, lo que finalmente llevó a la muerte de células cancerosas. Este trabajo reportó una ruta prometedora para la producción rápida y rentable de compuestos ChrGO, que administraron agentes de quimioterapia de manera controlada espaciotemporalmente para tratamiento eficiente del cáncer (Esquema 1).

Materiales y Métodos

Materiales

Polvo de grafito se obtuvo de Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China). Quitosano y adriamicina se compraron de Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China). Trastuzumab se compró de Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Suiza). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), medio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM) y suero fetal bovino (FBS) se compraron de Invitrogen Corporation (Camarillo, USA). Filtros centrífugos Amicon^® Ultra se compraron de Merck Millipore. Kit de ensayo de proliferación celular CellTiter 96^® aqueous one solution y sistema de ensayo Caspase-Glo^® 3/7 se obtuvieron de Promega Corporation (Madison, USA). Levadura de panadero seca se obtuvo de AB/Mauri Co., Ltd. Líneas celulares BT-474 y Cos-7 se obtuvieron del Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Medio Luria-Bertani se compró de Sangon Biotech Co., Ltd. Todos los químicos fueron grado analítico y comercialmente disponibles sin purificación adicional.

Reducción Asistida por Microondas de GO Funcionalizado con Quitosano

El óxido de grafito (GO) se preparó a partir de láminas de grafito nativo usando un método de Hummer modificado [14]. Para obtener una capa única de GO nano-dimensionado, el GO se exfolió con una sonda ultrasónica (Scientz, China) operando a 800 W durante 8 h. Finalmente, el GO exfoliado se dispersó en agua desionizada para uso posterior. Los nanosheets de quitosano-GO parcialmente reducidos (ChrGO) se sintetizaron mediante reducción asistida por microondas de GO con solución acuosa de quitosano usando un sistema de síntesis por microondas. El extracto de levadura libre de células se usó para la biosíntesis de ChrGO mediante reducción asistida por microondas. Primero, las células de levadura almacenadas se activaron por inoculación en medio Luria-Bertani y agitación a 135 rpm durante 18 h a 25 °C. Las células de levadura activadas se transfirieron a solución de sacarosa al 2% agitando a 135 rpm durante otras 6 h a 25 °C. Luego, se obtuvieron 6 mL de extracto de levadura libre de células por separación centrífuga a 2000 rpm durante 5 min. Luego, 50 mg de quitosano se disolvieron en 25 mL de solución de ácido acético al 2% (v/v) y se mezclaron con extracto de levadura [20]. Se añadió una solución de GO de 5 mg bajo agitación magnética vigorosa. Finalmente, la solución preparada se transfirió al equipo de síntesis por microondas NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, China) para la reacción por microondas. El esquema de calentamiento para el sistema de microondas involucró calentar a 80 °C durante 5 min y mantener la temperatura durante otros 5 min. El ChrGO obtenido se purificó con un filtro MWCO de 100 kDa (Millipore, USA) y se liofilizó para uso posterior.

Caracterizaciones

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de GO nano-dimensionado se obtuvieron en un microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 con voltaje de aceleración de 200 kV (JEOL, Japón). Los espectros ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtuvieron usando un espectrofotómetro UV/Vis/NIR Lambda 950 (Perkin-Elmer, USA). Los espectros de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) se recogieron usando un espectrómetro FTIR Vertex 70 barrido de 4000 a 400 cm⁻¹ con muestras preparadas como pastillas de KBr (Bruker, Alemania). Los espectros Raman se registraron usando un microscopio Raman Senterra R200-L con longitud de onda de excitación de 532 nm (Bruker Optics, Alemania). Los patrones de difracción de rayos X (XRD) se examinaron por un difractómetro Bruker D8 Advance (Bruker, Alemania). Los elementos superficiales se registraron usando espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD con radiación Al Ka monocromática (1486,6 eV) (Shimadzu, Japón). El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en un PerkinElmer Pyris 1 TGA a una tasa de calentamiento de 5 °C/min de 30 a 800 °C en atmósfera de nitrógeno (PerkinElmer, USA). La carga superficial de los compuestos se midió con un instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, UK).

Carga y Liberación de Fármaco

Cuatro miligramos de nanopartículas ChrGO se suspendieron en 20 mL de solución acuosa de adriamicina (0,4 mg/mL). Tras sonicación durante 0,5 h, se agitó en oscuridad durante 24 h, evitando la luz. La adriamicina no cargada se eliminó por centrifugación-filtrado a través de filtros Amicon de 50 kDa MWCO (Millipore, USA) y se lavó con solución salina fosfato amortiguada (PBS, pH 8,0) hasta que el sobrenadante se volvió incoloro. La concentración de adriamicina se determinó usando una curva de concentración estándar de adriamicina por espectrometría UV-Vis a 490 nm con un lector de microplacas SpectraMax^® M5 (Molecular Devices, USA). La cantidad de carga de adriamicina en ChrGO se determinó con absorbancia UV-Vis midiendo la concentración de pérdida de adriamicina en el sobrenadante del filtro centrífugo Amicon^® Ultra-15 mL.

Se estudiaron las características de liberación de adriamicina de ChrGO. La ChrGO cargada con adriamicina se sumergió en 10 mL de solución amortiguadora PBS. En intervalos especificados, 2 mL de solución de adriamicina liberada desprendida de ChrGO se recogió por centrifugación-filtrado a través de filtros Amicon de 50 kDa MWCO (Millipore, USA). El volumen de solución ChrGO/adriamicina se mantuvo constante añadiendo 2 mL de solución PBS fresca tras cada muestreo. La cantidad de adriamicina liberada de ChrGO se midió por absorbancia UV-Vis a 490 nm por un lector de microplacas SpectraMax^® M5 (Molecular Devices, USA). Los estudios de liberación se investigaron en soluciones de diferentes pH (valores de pH 5 y 7,4).

Análisis de Biocompatibilidad y Ensayo de Eficacia Terapéutica

Las células BT-474 y Cos-7 se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS o DMEM suplementado con 10% FBS, respectivamente, y se cultivaron en atmósfera humidificada de 5% CO₂ a 37 °C. El ensayo de biocompatibilidad de GO y ChrGO se realizó en células BT-474 o Cos-7 mediante ensayo de citotoxicidad celular. Las células se sembraron en placas planas de 96 pocillos a una densidad de 3 × 10⁴ células por pocillo y preincubaron durante 18 h antes del tratamiento con GO y ChrGO. Luego, las diluciones de los agentes probados se añadieron a las células e incubaron durante otras 24 h. La viabilidad de las células se determinó por CellTiter 96^® aqueous one solution. La absorbancia se midió a 490 nm por un lector de microplacas SpectraMax^® M5 (Molecular Devices, USA).

La eficacia de los complejos ChrGO/adriamicina solos o en tratamiento combinado con trastuzumab sobre la proliferación en células BT-474 se investigó mediante ensayo de inhibición de proliferación [16]. Las células BT-474 se sembraron en placas planas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10⁴ células por pocillo e incubaron durante 24 h. Luego, los complejos ChrGO/adriamicina solos o en tratamiento combinado con trastuzumab se introdujeron a las células BT-474 en el medio de cultivo. Tras incubación de 96 h, las células viables se determinaron por CellTiter 96^® aqueous one solution. La absorbancia se midió con un lector SpectraMax^® M5 a 490 nm (Molecular Devices, USA). Los datos se analizaron con ANOVA unidireccional. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Análisis de Ciclo Celular y Ensayo de Apoptosis

Para análisis de ciclo celular, las células BT-474 se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 5 × 10⁵ células por pocillo y se dejaron adherir durante 16 h. Las células se trataron con complejos ChrGO/adriamicina solos o en combinación con trastuzumab durante 24 h. Las células BT-474 se recogieron y fijaron con 70% (v/v) etanol a 4 °C durante 24 h. Las células BT-474 fijadas se tiñeron con solución de yoduro de propidio (15 μg/mL) conteniendo ribonucleasa A (10 μg/mL) a 25 °C durante una hora. Luego, las células se analizaron con un citómetro de flujo (BD Biosciences, USA). Para el ensayo de apoptosis, las células BT-474 se sembraron en placas de 96 pocillos con paredes blancas a una densidad de 2 × 10⁴ células por pocillo y se dejaron adherir durante 18 h. Las células se trataron con complejos ChrGO/adriamicina, trastuzumab solo o en tratamiento combinado durante 24 h. Luego, el medio de cultivo se desechó, y se añadieron 100 µL de reactivo Caspase-Glo^® 3/7 a cada pocillo e incubaron a RT durante 2 h. La luminiscencia se midió por un lector de microplacas SpectraMax^® M5 (Molecular Devices, USA). Los resultados se analizaron por ANOVA unidireccional. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con directrices y regulaciones relevantes.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización

La morfología de las láminas GO sintetizadas se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La Figura 1a revela la distribución uniforme de tamaño de nanosheets de GO por debajo de 100 nm, con un tamaño medio de aproximadamente 45 nm. La alta densidad electrónica de GO exhibió mejor contraste comparado con quitosano, que es apenas visible debido a su baja densidad electrónica e naturaleza hidratada [21]. Debido a la mayor área superficial, las láminas de GO o rGO a nanoescala se han usado ampliamente como portadores de fármacos [22]. El patrón de difracción electrónica de área seleccionada (SAED) en la Fig. 1c muestra anillos concéntricos, que demuestran la presencia de naturaleza policristalina correspondiente a óxido de grafeno [23].

Para estabilizar nanosheets de GO en solución fisiológica, se prepararon nanosheets de GO funcionalizados con quitosano mediante reducción asistida por microondas usando un sistema de microondas [24]. El GO-quitosano reducido resultante (ChrGO) se analizó por espectrometría UV-Vis. La Figura 2a muestra los espectros UV-Vis de GO y ChrGO. GO exhibió un pico de absorción agudo a 230 nm y un hombro a 300 nm, atribuido a la transición π–π* de enlaces aromáticos C=C y transición n–π* de enlaces C=O, respectivamente [25, 26]. Tras injertar quitosano a GO, el pico a 230 nm se desplazó hacia el rojo a 270 nm para ChrGO, y el hombro a 300 nm desapareció obviamente, atribuido a la restauración parcial de la conjugación electrónica entre los átomos de carbono aromáticos [27]. Una solución negra de ChrGO sintetizado se muestra en la Fig. 2b, indicando la formación de óxido de grafeno parcialmente reducido (p-rGO). Tanto los nanosheets de GO como ChrGO se dispersaron bien en H₂O desionizada. La estabilidad coloidal de GO o derivados de GO en solución acuosa es muy importante para su aplicación biomédica. Los resultados sugirieron que el quitosano se conjugó con GO tras la reducción.

La espectroscopía FTIR se realizó para caracterizar la estructura de GO, quitosano y ChrGO (Fig. 3a). Los picos característicos de GO se situaron en 3440 cm⁻¹ y 1376 cm⁻¹, correspondientes a enlaces O–H y C–OH, respectivamente. El pico a 1072 cm⁻¹ se asignó a la vibración de estiramiento de C–N–C. Notablemente, los picos de moléculas de quitosano a 2912 cm⁻¹ y 2848 cm⁻¹ se atribuyeron a las vibraciones de estiramiento de CH₃– y –CH₂– [28, 29]. El p-rGO funcionalizado con quitosano resultó en nuevos enlaces, lo que condujo a nuevos picos en los espectros de ChrGO. Hay una disminución significativa en las intensidades de la banda C=O a 1636 cm⁻¹ en ChrGO comparado con GO, lo que sugiere que el proceso de reducción eliminó los grupos que contienen oxígeno de GO [30]. El espectro FTIR de ChrGO confirmó la conjugación exitosa de quitosano en GO. Además, la espectroscopía Raman se usó para caracterizar las propiedades electrónicas y estructura del grafeno. La banda G se atribuye a los fonones E_2g de dominios de carbono sp², mientras que la banda D se asigna a la vibración de dominios de átomos de carbono sp³ y átomos de carbono desordenados. La intensidad de la banda D indica las características de desorden y defectos en láminas de carbono [31]. La reducción de nanosheets de GO también se analizó en la relación de señal de banda D versus G [32]. El espectro Raman representativo de GO muestra dos picos característicos de la banda D (1341 cm⁻¹) y la banda G (1591 cm⁻¹) en la Fig. 3b. El cambio en la intensidad relativa del valor I_D/I_G ilustra el cambio en el estado de conjugación electrónica del GO en el proceso de reducción [33]. El desplazamiento de la banda D muestra la funcionalización exitosa de GO reducido. El valor de I_D/I_G aumenta de 0,99 (GO) a 1,12 (ChrGO), atribuido a la introducción de defectos sp3 tras la funcionalización y recuperación incompleta de la estructura característica del grafeno [34]. Esta observación concuerda bien con el reporte previo y sugiere la formación de grafeno funcionalizado con quitosano [16].