Óxido de grafeno funcionalizado con quitosano asistido por microondas como nanosistema de administración intracelular controlada de fármacos para una actividad antitumoral sinérgica

Resumen

Para lograr una mejor eficacia antitumoral, es urgente mejorar la eficacia de la administración de fármacos antineoplásicos dirigidos a las células cancerosas. En este trabajo, se fabricaron nanohojas de óxido de grafeno funcionalizado con quitosano (ChrGO) mediante reducción asistida por microondas, que se emplearon en el nanosistema de administración intracelular de fármacos antineoplásicos en células de cáncer de mama. La investigación de carga y liberación de fármacos indicó que la adriamicina se puede cargar y liberar de manera eficiente desde las nanohojas ChrGO. Una menor liberación de fármaco durante la administración y una mejor biocompatibilidad de ChrGO / adriamicina mejoran significativamente su seguridad y eficacia terapéutica en las células BT-474 que sobreexpresan HER2. Además, ChrGO / adriamicina en combinación con trastuzumab exhibió una actividad antitumoral sinérgica en las células BT-474, lo que demostró una eficacia terapéutica superior en comparación con cada fármaco solo. Cada una de las células tratadas con trastuzumab (5 μg / ml) o ChrGO / adriamicina equivalente (5 μg / ml) provocó una muerte celular del 54,5% y 59,5%, respectivamente, mientras que el tratamiento combinado con trastuzumab y ChrGO / adriamicina produjo un espectacular 88,5% de células muerte. La terapia de doble objetivo mostró una mayor apoptosis, lo que indica una eficacia terapéutica superior debido a la presencia de diferentes mecanismos de acción. El tratamiento combinado de ChrGO / adriamicina y trastuzumab en células BT-474 indujo la detención del ciclo celular y la apoptosis, lo que finalmente condujo a la muerte de las células cancerosas aumentadas. Este trabajo ha proporcionado una fácil fabricación asistida por microondas de ChrGO como un nanosistema de administración de fármacos intracelulares controlado y dirigido, que se espera que sea una nueva y prometedora terapia para tratar las células de cáncer de mama que sobreexpresan HER2.

Introducción

El receptor HER2 es un miembro de la familia de receptores EGFR que media el crecimiento y la diferenciación de las células cancerosas y está altamente sobreexpresado en el 20-30% de los cánceres de mama humanos, lo que da lugar a un fenotipo tumoral metastásico y un pronóstico precario [1]. HER2 también se sobreexpresa en aproximadamente el 20% de los cánceres gástricos humanos [2]. Trastuzumab, un anticuerpo terapéutico monoclonal humanizado, demuestra ventajas terapéuticas prometedoras como terapia de primera línea en pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan HER2 [3]. Sin embargo, la tasa de respuesta global al trastuzumab sigue siendo modesta:15-30% cuando se trata como una sola terapia y 50-75% cuando se usa en tratamiento combinado con fármacos de quimioterapia [4]. Entre los pacientes que responden al trastuzumab, la mayoría de ellos finalmente progresa después de la respuesta inicial y adquiere resistencia con el tiempo después del tratamiento continuo [5]. Por lo tanto, es esencial y necesario desarrollar nuevas terapias adicionales para pacientes que sobreexpresan HER2 para mejorar las tasas de supervivencia general.

Las antraciclinas todavía sirven como la columna vertebral del tratamiento del cáncer. Para los agentes de antraciclina, el inhibidor de la topoisomerasa II adriamicina se ha utilizado ampliamente para tratar muchos cánceres, como los cánceres de mama, pulmón y linfoides [6]. La adriamicina tiene una eficacia eficaz en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan HER2, debido a la proximidad entre el gen HER2 y el gen de la topoisomerasa II [7]. A pesar del beneficio clínico observado con las terapias basadas en antraciclinas en el cáncer de mama, la disfunción cardíaca ha restringido aplicaciones terapéuticas más amplias. En el ensayo clínico, trastuzumab en combinación con adriamicina demostró una eficacia significativa, mientras que la cardiotoxicidad altamente dependiente de la dosis fue un problema que debe resolverse [8]. Se reconoce que la liberación sostenida de agentes quimioterápicos en el tejido diana del cáncer es una buena solución para reducir las dosis necesarias para la eficacia terapéutica y mejorar los perfiles de seguridad [9]. Para lograr una mejor eficacia antitumoral pero menos efectos secundarios, existe una necesidad urgente de mejorar la eficiencia de la administración de fármacos anticancerosos para atacar las células cancerosas.

Los nanomateriales basados en óxido de grafeno (GO) se han mostrado muy prometedores en la administración controlada de agentes de quimioterapia [10]. Numerosos estudios han demostrado que la toxicidad de GO está asociada con su funcionalización superficial [11]. Recientemente, se ha informado que agentes respetuosos con el medio ambiente, como el quitosano y el PEG, funcionalizan el GO con un grupo funcional de superficie menos venenoso [12, 13]. La estabilidad coloidal de las nanopartículas en medios biológicos es crucial para el desarrollo de un sistema de administración de fármacos eficaz y seguro para uso clínico [14]. Las nanohojas GO funcionalizadas han ganado una gran atención en aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades como la biocompatibilidad y la estabilidad. Como excelente candidato para biomaterial basado en grafeno, la estabilidad coloidal de GO o rGO es importante para controlar el rendimiento de los portadores de fármacos. El GO funcionalizado con poli (etilenglicol) exhibió una propiedad coloidal mejorada en los medios de cultivo celular [15]. P. Khanra informó de un método novedoso para la reducción simultánea y biofuncionalización de GO mediante el uso de células de levadura como biocatalizador reductor [16, 17]. Avinav G presentó una biosíntesis de GO en un solo recipiente mediante la utilización de extracto de levadura durante un proceso de autoclave [18]. El tratamiento de sonicación de hojas de GO de tamaño micrométrico durante horas dio como resultado nanohojas de GO, que mostraron una mayor estabilidad coloidal en comparación con GO de tamaño micrométrico regular [19]. Aunque los estudios anteriores demostraron el alto potencial de GO para biomateriales, las nanohojas de GO biofuncionalizadas con quitosano por reducción asistida por microondas utilizando extracto de levadura libre de células no se han estudiado hasta ahora. Para este propósito, se construyó una nueva estructura de óxido de grafeno funcionalizado con quitosano (ChrGO) mediante un sencillo sistema de síntesis de microondas que utiliza extracto de levadura como reductor. Además, la funcionalización eficaz de GO con quitosano biocompatible proporciona una plataforma potencial para la carga y administración de fármacos eficientes. Los estudios de carga y liberación de fármacos demostraron que la adriamicina se cargó y se liberó de manera eficiente desde las nanohojas ChrGO. Los compuestos ChrGO / adriamicina mostraron una actividad antitumoral significativa de una manera dependiente de la concentración. En particular, el tratamiento combinado con ChrGO / adriamicina y trastuzumab dio como resultado un efecto de inhibición del crecimiento mejorado en las células BT-474 en comparación con la monoterapia. Se reveló que la eficacia antitumoral sinérgica de estos agentes está mediada por la detención del ciclo celular y la apoptosis, que finalmente conducen a la muerte de las células cancerosas. Este trabajo informó una ruta prometedora para la producción rápida y rentable de compuestos ChrGO, que administraron agentes de quimioterapia de una manera controlada espacio-temporal para un tratamiento eficaz del cáncer (Esquema 1).

Biofuncionalización asistida por microondas y reducción de óxido de grafito como nanosistema de administración controlada de fármacos para terapia de doble objetivo en células BT-474 que sobreexpresan HER2

Materiales y métodos

Materiales

El polvo de grafito se obtuvo de Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China). El quitosano y la adriamicina se adquirieron en Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China). El trastuzumab se adquirió de Hoffmann-La Roche Ltd (Basilea, Suiza). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Invitrogen Corporation (Camarillo, EE. UU.). Amicon ^® Los filtros ultracentrífugos se adquirieron de Merck Millipore. CellTiter 96 ^® kit de ensayo de proliferación celular en solución acuosa y Caspase-Glo ^® El kit del sistema de ensayo 3/7 se obtuvo de Promega Corporation (Madison, EE. UU.). La levadura seca de panadería se obtuvo de AB / Mauri Co., Ltd. Las líneas celulares BT-474 y Cos-7 se obtuvieron del Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). El medio Luria-Bertani se compró a Sangon Biotech Co., Ltd. Todos los productos químicos eran de grado analítico y estaban disponibles comercialmente sin purificación adicional.

Reducción asistida por microondas de GO funcionalizado con quitosano

El óxido de grafito (GO) se preparó a partir de escamas de grafito nativo utilizando un método de Hummer modificado [14]. Para obtener una sola capa de GO de tamaño nanométrico, se exfolió el GO con una sonda ultrasónica (Scientz, China) que funciona a 800 W durante 8 h. Finalmente, el GO exfoliado se dispersó en agua desionizada para su uso posterior. Las nanohojas de quitosano-GO (ChrGO) parcialmente reducidas se sintetizaron mediante la reducción asistida por microondas de GO con una solución acuosa de quitosano utilizando un sistema de síntesis de microondas. El extracto de levadura libre de células se utilizó para la biosíntesis de ChrGO mediante reducción asistida por microondas. Primero, las células de levadura almacenadas se activaron por inoculación en medio Luria-Bertani y agitando a 135 rpm durante 18 ha 25 ° C. Las células de levadura activadas se transfirieron a una solución de sacarosa al 2% agitando a 135 rpm durante otras 6 ha 25ºC. A continuación, se obtuvieron 6 mL de extracto de levadura exento de células mediante separación centrífuga a 2000 rpm durante 5 min. Luego, se disolvieron 50 mg de quitosano en 25 mL de una solución de ácido acético al 2% (v / v) y se mezclaron con extracto de levadura [20]. Se añadió una solución de 5 mg de GO con agitación magnética vigorosa. Finalmente, la solución preparada se transfirió a un equipo de síntesis de microondas NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, China) para la reacción de microondas. El esquema de calentamiento para el sistema de microondas implicó calentar a 80 ° C durante 5 min y mantener la temperatura durante otros 5 min. El ChrGO obtenido se purificó con un filtro MWCO de 100 kDa (Millipore, EE. UU.) Y se liofilizó para su uso posterior.

Caracterizaciones

Se obtuvieron imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de GO de tamaño nanométrico en un microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 con un voltaje de aceleración de 200 kV (JEOL, Japón). Los espectros ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro UV / Vis / NIR Lambda 950 (Perkin-Elmer, EE. UU.). Los espectros de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) se recogieron utilizando un espectrómetro Vertex 70 FTIR que escanea de 4000 a 400 cm ⁻¹ con muestras preparadas como gránulos de KBr (Bruker, Alemania). Los espectros Raman se registraron usando un microscopio Raman Senterra R200-L con una longitud de onda de excitación de 532 nm (Bruker Optics, Alemania). Los patrones de difracción de rayos X (XRD) se examinaron con un difractómetro Bruker D8 Advance (Bruker, Alemania). Los elementos superficiales se registraron mediante espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD con radiación monocromática Al Ka (1486,6 eV) (Shimadzu, Japón). El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en un PerkinElmer Pyris 1 TGA a una velocidad de calentamiento de 5 ° C / min de 30 a 800 ° C en una atmósfera de nitrógeno (PerkinElmer, EE. UU.). La carga superficial de los compuestos se midió con un instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Reino Unido).

Carga y liberación de medicamentos

Se suspendieron cuatro miligramos de nanopartículas de ChrGO en 20 ml de solución acuosa de adriamicina (0,4 mg / ml). Después de la sonicación durante 0,5 h, se agitó en la oscuridad durante 24 h, evitando la luz. La adriamicina descargada se eliminó mediante centrifugación, filtración a través de filtros Amicon MWCO de 50 kDa (Millipore, EE.UU.) y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 8,0) hasta que el sobrenadante se volvió incoloro. La concentración de adriamicina se determinó utilizando una curva de concentración de adriamicina estándar mediante espectrometría UV-Vis a 490 nm con un SpectraMax ^® Lector de microplacas M5 (Molecular Devices, EE. UU.). La cantidad de carga de adriamicina en ChrGO se determinó con una absorbancia UV-Vis midiendo la concentración de la pérdida de adriamicina en el sobrenadante de Amicon ^® Filtro centrífugo ultra-15 mL.

Se estudiaron las características de liberación de adriamicina de ChrGO. El ChrGO cargado con adriamicina se sumergió en 10 ml de solución tampón PBS. A intervalos especificados, se recogieron 2 ml de solución de adriamicina liberada desprendida de ChrGO mediante filtración por centrifugación a través de filtros Amicon MWCO de 50 kDa (Millipore, EE. UU.). El volumen de solución de ChrGO / adriamicina se mantuvo constante mediante la adición de 2 ml de solución tampón de PBS reciente después de cada muestreo. La cantidad de adriamicina liberada por ChrGO se midió mediante una absorbancia UV-Vis a 490 nm con un SpectraMax ^® Lector de microplacas M5 (Molecular Devices, EE. UU.). Los estudios de liberación se investigaron en diferentes soluciones de pH (valores de pH 5 y 7,4).

Análisis de biocompatibilidad y ensayo de eficacia terapéutica

Las células BT-474 y Cos-7 se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con FBS al 10% o DMEM suplementado con FBS al 10%, respectivamente, y se cultivaron en una atmósfera humidificada de CO ₂ al 5% a 37 ° C. El ensayo de biocompatibilidad de GO y ChrGO se realizó en células BT-474 o Cos-7 mediante un ensayo de citotoxicidad celular. Las células se sembraron en placas planas de 96 pocillos a una densidad de 3 x 10 ⁴ células por pocillo y preincubados durante 18 h antes del tratamiento con GO y ChrGO. Luego, las diluciones de los agentes probados se agregaron a las células y se incubaron durante otras 24 h. La viabilidad de las células fue determinada por CellTiter 96 ^® una solución acuosa. La absorbancia se midió a 490 nm con un SpectraMax ^® Lector de microplacas M5 (Molecular Devices, EE. UU.).

La eficacia de los complejos ChrGO / adriamicina solos o en tratamiento combinado con trastuzumab sobre la proliferación en células BT-474 se investigó mediante un ensayo de inhibición de la proliferación [16]. Las células BT-474 se sembraron en placas planas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10 ⁴ células por pocillo y se incubaron durante 24 h. Luego, los complejos ChrGO / adriamicina solos o en tratamiento combinado con trastuzumab se introdujeron en las células BT-474 en el medio de cultivo. Después de 96 h de incubación, las células viables se determinaron mediante CellTiter 96 ^® una solución acuosa. La absorbancia se midió con un SpectraMax ^® Lector de microplacas M5 a 490 nm (Molecular Devices, EE. UU.). Los datos se analizaron con ANOVA de una vía. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Análisis del ciclo celular y ensayo de apoptosis

Para el análisis del ciclo celular, se sembraron células BT-474 en placas de seis pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁵ células por pocillo y se dejó adherir durante 16 h. Las células se trataron con complejos ChrGO / adriamicina solos o en combinación con trastuzumab durante 24 h. Se recolectaron células BT-474 y se fijaron con etanol al 70% (v / v) a 4 ° C durante 24 h. Las células BT-474 fijadas se tiñeron con una solución de yoduro de propidio (15 μg / mL) que contenía ribonucleasa A (10 μg / mL) a 25 ° C durante una hora. Luego, las células se analizaron con un citómetro de flujo (BD Biosciences, EE. UU.). Para el ensayo de apoptosis, se sembraron células BT-474 en placas de 96 pocillos de paredes blancas a una densidad de 2 × 10 ⁴ células por pocillo y se dejó adherir durante 18 h. Las células se trataron con complejos ChrGO / adriamicina, trastuzumab solo o en tratamiento combinado durante 24 h. Luego, se descartó el medio de cultivo y 100 µL de Caspase-Glo ^® Se añadió 3/7 de reactivo a cada pocillo y se incubó a TA durante 2 h. La luminiscencia se midió con un SpectraMax ^® Lector de microplacas M5 (Molecular Devices, EE. UU.). Los resultados se analizaron mediante ANOVA de una vía. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización

La morfología de las hojas de GO sintetizadas se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La Figura 1a revela la distribución de tamaño uniforme de las nanohojas de GO por debajo de 100 nm, con un tamaño medio de aproximadamente 45 nm. La alta densidad de electrones de GO mostró un mejor contraste en comparación con el quitosano, que es apenas visible debido a su baja densidad de electrones y su naturaleza hidratada [21]. Debido a la mayor área de superficie, las láminas de GO a nanoescala o GO reducidas se han utilizado ampliamente como portadores de fármacos [22]. El patrón de difracción de electrones de área seleccionada (SAED) en la Fig. 1c muestra los anillos concéntricos, lo que demuestra la presencia de una naturaleza policristalina correspondiente al óxido de grafeno [23].

un Imagen TEM con poco aumento de nanohojas GO, b imagen TEM de alta resolución de nanohojas y c un patrón SAED típico de nanohojas GO

Para estabilizar las nanohojas de GO en solución fisiológica, se prepararon nanohojas de GO funcionalizadas con quitosano mediante reducción asistida por microondas utilizando un sistema de microondas [24]. El GO-quitosano reducido resultante (ChrGO) se analizó mediante espectrometría UV-Vis. La Figura 2a muestra los espectros UV-Vis de GO y ChrGO. GO exhibió un pico de absorción agudo a 230 nm y un hombro a 300 nm, que se atribuye al π - π * transición de enlaces aromáticos C =C y n - π * transición de enlaces C =O, respectivamente [25, 26]. Después de que el quitosano fue injertado en GO, el pico a 230 nm corrió al rojo a 270 nm para ChrGO, y el hombro a 300 nm obviamente desapareció, lo que se atribuyó a la restauración parcial de la conjugación electrónica entre los átomos de carbono aromáticos [27]. En la Fig. 2b se muestra una solución negra de ChrGO sintetizado, que indica la formación de óxido de grafeno parcialmente reducido (p-rGO). Tanto las nanohojas GO como ChrGO estaban bien dispersas en H ₂ desionizado O. La estabilidad coloidal de los derivados GO o GO en solución acuosa es muy importante para su aplicación biomédica. Los resultados sugirieron que el quitosano se conjugó con GO después de la reducción.

un Espectro UV-Vis de las nanohojas GO y ChrGO en solución acuosa, b fotografías de nanohojas GO y ChrGO sintetizado

Se realizó espectroscopía FTIR para caracterizar la estructura de GO, quitosano y ChrGO (Fig. 3a). Los picos característicos de GO se situaron a 3440 cm ⁻¹ y 1376 cm ⁻¹ , correspondientes a los enlaces O – H y C – OH, respectivamente. El pico a 1072 cm ⁻¹ fue asignado a la vibración de estiramiento de C – N – C. Notablemente, los picos de moléculas de quitosano a 2912 cm ⁻¹ y 2848 cm ⁻¹ se atribuyeron a las vibraciones de estiramiento del CH ₃ - y –CH ₂ - [28, 29]. El p-rGO funcionalizado con quitosano dio como resultado nuevos enlaces, lo que condujo a nuevos picos en los espectros ChrGO. Hay una disminución significativa en las intensidades de la banda C =O a 1636 cm ⁻¹ en ChrGO en comparación con el de GO, lo que sugiere que el proceso de reducción eliminó los grupos de GO que contienen oxígeno [30]. El espectro FTIR de ChrGO confirmó la conjugación exitosa de quitosano en GO. Además, se utilizó espectroscopía Raman para caracterizar las propiedades electrónicas y la estructura del grafeno. La banda G se atribuye a la E _2g fonones de sp ² dominios de carbono, mientras que la banda D se asigna a la vibración de sp ³ dominios de átomos de carbono y átomos de carbono desordenados. La intensidad de la banda D indica las características de los desórdenes y defectos en las hojas de carbón [31]. La reducción de las nanohojas de GO también se analizó en la relación de señal de la banda D frente a la banda G [32]. El espectro Raman representativo de GO muestra dos picos característicos de la banda D (1341 cm ⁻¹ ) y la banda G (1591 cm ⁻¹ ) en la Fig. 3b. Cambio en la intensidad relativa de I _D / I _G El valor ilustra el cambio en el estado de conjugación electrónica del GO en el proceso de reducción [33]. El cambio de la banda D muestra una funcionalización exitosa de GO reducido. El valor de I _D / Yo _G aumenta de 0,99 (GO) a 1,12 (ChrGO), que se atribuye a la introducción de sp3 defectos después de la funcionalización y recuperación incompleta de la estructura característica del grafeno [34]. Esta observación está de acuerdo con el informe anterior y sugiere la formación de grafeno funcionalizado con quitosano [16].

un Espectros FTIR de GO, ChrGO y quitosano, b Espectros Raman de GO y ChrGO

La composición de la superficie de ChrGO fue confirmada por XPS. La exploración completa del espectro XPS de ChrGO muestra tres picos en 284, 399 y 533 eV, que se asignan a C1s, N1s y O1s (Fig. 4a), respectivamente. El análisis elemental relativo mostró un aumento en los niveles de nitrógeno y oxígeno ChrGO, con una disminución asociada en el contenido de carbono en comparación con GO. Los espectros C1s de alta resolución de ChrGO que se muestran en la Fig. 4b exhiben cuatro picos separados, correspondientes a C – C o C =C ( sp ² , 284,7 eV), C-O (epoxi / hidroxilos, 286,4 eV), C =O ( sp ³ , 288.2 eV) y O =enlaces C – O (carboxilatos, 289.1 eV). La aparición de un pico de amida en ChrGO proporciona evidencia de la funcionalización del quitosano en GO [35]. Los abundantes grupos funcionales hidrófilos en la superficie hicieron que ChrGO fuera altamente soluble en una solución acuosa, lo que es consistente con los resultados de FTIR. Las biomoléculas como los aminoácidos reductores y el ácido alfa-linolénico en el extracto de levadura pueden tener un papel importante en la fabricación asistida por microondas de ChrGO [20].

un Examinar los espectros XPS de GO y ChrGO, b espectros de alta resolución de C1s

El patrón de difracción de rayos X (XRD) de GO y ChrGO se presenta en la Fig. 5a. En los espectros GO XRD, el pico principal a 11,0 ° y el pico débil a 20,7 ° presentan claramente la estructura del grafito. La característica pico de difracción a 11,0 ° correspondiente al plano (001) de GO, que muestra la síntesis exitosa de GO [36]. La pequeña protuberancia entre 20 ° y 24 ° muestra los restos grafíticos, que se atribuyen al grafito prístino sin oxidar [37]. Con la funcionalización del quitosano, el pico (001) de GO desaparece, mientras que el pico de difracción amplio a 21,4 ° se vuelve prominente. Este cambio se puede atribuir a la reducción del GO, donde la reducción hace que el paquete rGO sea más ajustado que el GO. La reflexión (002) de la muestra ChrGO es muy amplia, lo que sugiere que la muestra está muy mal ordenada a lo largo de la dirección de apilamiento, lo que puede atribuirse a la reducción incompleta de GO [33]. Los comportamientos de descomposición de GO, quitosano y ChrGO se han estudiado mediante análisis de gravedad térmica (TGA) [38]. Las curvas de TGA de ChrGO, GO y quitosano se muestran en la Fig. 5b, que se midieron en una atmósfera de nitrógeno. GO comenzó a perder peso por debajo de los 100 ° C, lo que se atribuyó a la eliminación del agua libre adsorbida en la estructura apilada [39]. El GO perdió 42% de su peso en el rango de 191-231 ° C, lo que se relacionó con la descomposición de grupos lábiles que contienen oxígeno. La tasa de pérdida de peso de ChrGO a 100–250 ° C es significativamente más baja que la de GO, y es obvio que ChrGO mostró un patrón de descomposición diferente en comparación con GO. La eliminación térmica de ChrGO y quitosano puro tuvo lugar de 250 a 440 ° C, lo que está relacionado con la despolimerización y pirólisis de grupos funcionales más estables, como las unidades glucosídicas de quitosano y grupos carboxilo [40]. En comparación con GO, ChrGO fue térmicamente estable y dio una pérdida de peso importante del 36% en la primera etapa de descomposición a 250–440 ° C, mientras que se muestra poca pérdida de peso para el GO. La pérdida de peso significativa en la región de alta temperatura de 450-800 ° C se debió a la degradación térmica del esqueleto carbónico, que podría atribuirse a los residuos de quitosano y biomoléculas del extracto de levadura, como los aminoácidos [41].

un Patrones XRD de GO y ChrGO, b Curvas TGA de GO, quitosano y ChrGO

La carga superficial de GO y ChrGO se midió con un instrumento Malvern Zeta Nano ZS-90, que es un parámetro importante de estabilidad coloidal. La mayor densidad de carga superficial en las nanohojas GO crea una dispersión coloidal más estable [42]. Como se muestra en el archivo adicional 1:Fig. S1, el potencial zeta de GO disminuyó monótonamente de - 10,7 mV a pH 3 a - 35,5 mV a pH 11, lo que confirmó la carga negativa en la superficie de las nanohojas de GO. El valor del potencial zeta de ChrGO fue comparativamente menor que el potencial de GO a cualquier pH entre 3 y 11. Las nanohojas de ChrGO mostraron estabilidad en todo el rango de valores de pH, mientras que se informó que los coloides de GO reducidos eran menos estables en agua desionizada debido a aumentado π - π apilamiento en las superficies desoxigenadas [43]. Aunque algunos grupos amina libres estaban presentes en la superficie del quitosano [44], no se logró un potencial zeta más alto de ChrGO. El valor de potencial zeta más bajo de ChrGO podría atribuirse a las abundantes moléculas de aminoácidos negativos del extracto de levadura, que mejoraron la estabilidad coloidal en solución fisiológica [20]. La superficie cargada negativamente de ChrGO los hace potencialmente aplicables para la carga y administración del medicamento.

Biocompatibilidad de ChrGO como sintetizado

La biocompatibilidad de ChrGO sintetizado es importante para sus aplicaciones en la administración de fármacos. La citotoxicidad celular de ChrGO y GO se investigó mediante un ensayo de citotoxicidad. Las células Cos-7 y las células BT-474 se incubaron en presencia de ChrGO o GO durante 24 h. Los resultados de la citotoxicidad celular se muestran en la Fig. 6. Se podría concluir que ChrGO no mostró una citotoxicidad celular obvia para las células Cos-7 y BT-474. Incluso a una concentración de 100 μg / mL, la viabilidad celular estaba por encima del 90%. Sin embargo, GO exhibió citotoxicidad celular significativa de una manera dependiente de la dosis, con solo 73.0 ± 0.5% y 71.0 ± 0.5% de supervivencia celular para células Cos-7 y BT-474 a una concentración de 100 μg / mL, respectivamente. Los resultados demostraron que el quitosano funcionalizado en la superficie de GO mostró una citotoxicidad muy baja y una biocompatibilidad mejorada. Se ha informado que la funcionalización superficial de GO con macromoléculas atenúa notablemente sus efectos citotóxicos [45]. Hu y col. informó que el suero fetal bovino en medio celular disminuyó notablemente la citotoxicidad celular de GO en células A549 de cáncer de pulmón de células no pequeñas [46].

Biocompatibilidad de GO y ChrGO. Se cultivaron concentraciones variables de nanopartículas con a Celdas Cos-7 y b Células BT-474 y se determinó su efecto sobre la viabilidad celular

Carga y liberación de fármaco

La posible aplicación biomédica de ChrGO como transportador de fármacos se mide por el comportamiento de carga y liberación del fármaco. Las características estructurales de los derivados del grafeno son muy eficaces para la administración de fármacos aromáticos debido a su gran superficie específica. La adriamicina es uno de los agentes quimioterapéuticos tumorales primarios contra una variedad de neoplasias malignas hematológicas y tumores sólidos y se utiliza con frecuencia como fármaco modelo para evaluar los sistemas de administración de fármacos derivados del grafeno [47]. La capacidad de carga de la adriamicina en las nanohojas ChrGO se verificó mediante el pico característico de absorbancia UV-Vis de la adriamicina a 490 nm. Como se esperaba, la eficiencia de carga máxima de la adriamicina unida a las nanohojas ChrGO fue tan alta como 169,8%, lo que se atribuyó en parte a la gran superficie de las nanohojas ChrGO. Los nanocompuestos ChrGO / adriamicina cargados con adriamicina se dispersaron fácilmente en un tampón fisiológico, mostrando una solución transparente con un color ligeramente rojizo.

Para explorar el perfil de liberación de adriamicina de los complejos ChrGO / adriamicina, se introdujeron los diferentes valores de pH de PBS para imitar entornos de células tumorales. Archivo adicional 1:La Fig. S2 muestra los perfiles de liberación acumulativa de adriamicina de ChrGO / adriamicina a pH 5 y 7,4. La adriamicina liberada de ChrGO / adriamicina se caracterizó por una liberación rápida inicial y luego una etapa de liberación más lenta en una solución de PBS a pH 5,0. La liberación acumulada de adriamicina fue del 6,5% en las primeras 3 horas y luego mostró un lento aumento hasta el 26,7% en 96 horas a pH 5,0. Por el contrario, el porcentaje de adriamicina de ChrGO / adriamicina aumentó más lentamente y fue menor a pH 7,4, mostrando un porcentaje de liberación de adriamicina desde el 2,5% en las primeras 3 h hasta el 7,4% en 96 h. Estudios anteriores han demostrado los perfiles de liberación de fármacos de GO funcionalizado muy lentamente en un medio a pH 7,4 [48]. La protonación de los grupos carboxilo en ChrGO disminuye el apilamiento π – π, los enlaces de H y las interacciones electrostáticas entre la adriamicina y ChrGO, lo que facilita la liberación de adriamicina en el medio acético [49]. La sensibilidad del pH le da a ChrGO / adriamicina potencial para la administración de fármacos en un sitio específico, lo que posteriormente aumenta la citotoxicidad en las células tumorales.

Eficacia terapéutica de los complejos ChrGO / Adriamycin

La eficacia terapéutica de los complejos ChrGO / adriamicina dentro de las células cancerosas BT-474 que sobreexpresan HER2 se investigó mediante el ensayo de inhibición de la proliferación. La sobreexpresión del receptor HER2 tiene un papel clave en la transformación de las células de cáncer de mama BT-474. El tratamiento con trastuzumab solo, un anticuerpo monoclonal anti-HER2, produce una inhibición significativa del crecimiento de las células BT-474 [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

un In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. ** p < 0.01, ***p < 0.001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

un Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. ** p < 0.01, ***p < 0.001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.

Conclusiones

In the present work, the chitosan-functionalized graphene oxide nanosheets were structured with microwave-assisted reduction, which demonstrated biocompatibility and good dispersion stability. The as-prepared nanocomposites showed high efficiency of drug encapsulation and delivery. The ChrGO/adriamycin nanosheets displayed significant growth inhibition of BT-474 in a dose-dependent manner. The combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in superior therapeutic efficacy in BT-474 cells compared to that with each agent alone. The results are favourable for the development of intracellular nanocarriers to deliver drugs in a controlled manner, which is expected to improve the therapeutic effect on HER2-overexpressing cancer therapies.

Disponibilidad de datos y materiales

The datasets supporting the conclusions of this current study are available from the corresponding authors upon reasonable request.

Abreviaturas

ChrGO:: Chitosan-functionalized graphene oxide
EGFR:: Epidermal growth factor receptor
HER2:: Human epidermal growth factor receptor-2
GO:: Óxido de grafeno
DMEM:: Dulbecco's modified Eagle medium
FBS:: Suero fetal bovino
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión
UV–Vis:: Ultraviolet–visible
FTIR:: Infrarrojos por transformada de Fourier
XRD:: Difracción de rayos X
XPS:: Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X
TGA:: Análisis termogravimétrico
PBS:: Solución salina tamponada con fosfato
SAED:: Difracción de electrones de área seleccionada
TGA:: Gravimetric analysis

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