Preparación Optimizada y Caracterización Fisicoquímica de Nanoliposomas de Doble Fármaco Encapsulando Erlotinib y Doxorrubicina

Resumen

La quimioterapia combinatoria sinérgica depende de administrar fármacos con mecanismos distintos de manera coordinada. Presentamos una plataforma de nanoliposomas no PEGilada reproducible que co-encapsula erlotinib (ERL) en la bicapa lipídica y doxorrubicina (DOX) en el núcleo acuoso. Los lípidos (DSPC, colesterol, POPG) se ensamblaron por hidratación de película delgada, seguida de sonicación con sonda para lograr vesículas sub-200 nm. DOX se cargó usando gradientes de sulfato de amonio (AS) o pH; el gradiente AS rindió >90 % eficiencia de encapsulación (EE) de DOX versus ~17 % para el método de pH. La EE de ERL alcanzó 30 %. La microscopía electrónica de transmisión reveló núcleos cristalinos de DOX-sulfato y cristales de ERL menos ordenados en la bicapa. Las vesículas permanecieron estables en tamaño entre 4–37 °C y liberaron ELR rápidamente (<8 h) mientras DOX liberó lentamente, permitiendo un perfil sinérgico tiempo-diferencial. Estos hallazgos establecen una plataforma robusta de nanoliposomas de doble fármaco adecuada para estudios traslacionales.

Antecedentes

Los cánceres de mama triple-negativo y otros tumores refractarios resisten monoterapias estándar debido a vías entrelazadas de daño ADN y supervivencia. Regímenes de combinación que primero preparan tumores con un inhibidor de factor de crecimiento y luego los exponen a un agente genotóxico han mostrado sinergia preclínica. Para traducir tales efectos in vitro clínicamente, un vehículo de administración que co-entregue ambos agentes y sincronice su liberación es esencial, especialmente cuando la farmacocinética difiere marcadamente.

Los nanoliposomas —vesículas de bicapa fosfolipídica— encapsulan naturalmente fármacos hidrofílicos en su núcleo y fármacos hidrofóbicos en su membrana, logrando co-localización y acumulación tumoral mejorada vía el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR). Sin embargo, protocolos de fabricación confiables, reproducibles y datos fisicoquímicos completos permanecen escasos, limitando la traducción clínica.

Métodos

Materiales

DSPC, POPG, colesterol (Avanti Polar Lipids), DOX·HCl y ERL base libre (Boryung Co. / Shanghai Send), sulfato de amonio, ácido cítrico (Daejung), y reactivos (Sigma‑Aldrich).

Preparación de Nanoliposomas de Doble Fármaco

ERL se incorporó en una mezcla 27:20:3 (p/p/p) DSPC:colesterol:POPG (3:50 p/p fármaco) y se secó a película delgada. Hidratación con 250–400 mM AS (o 300 mM ácido cítrico, pH 3,9) a 65 °C produjo vesículas multilamelares. Sonicación con sonda (5 s encendido/2 s apagado, 20 % amplitud, 36 J/pulso) en baño de hielo-agua redujo el tamaño a ~140 nm. El exceso de AS se eliminó por diálisis nocturna contra PBS (pH 7,4).

DOX (1,5 mg/mL, 2 mL) se añadió a 8 mL de liposomas cargados con ERL y se cargó por gradiente de pH o gradiente AS. Se evaluaron cuatro protocolos de carga de DOX (incubación, sonicación, equilibración, diálisis) para optimizar EE.

Caracterización

Dispersión dinámica de luz midió tamaño y polidispersidad; TEM (JEM‑2100F) visualizó morfología y estructuras cristalinas. La eficiencia de encapsulación se calculó a partir de fármaco liberado por Triton X‑100 y cuantificado por UV‑Vis (ERL) o fluorescencia (DOX). La liberación in vitro empleó cassettes de diálisis en PBS (pH 7,4) a 37 °C. La estabilidad física se evaluó monitoreando tamaño a 4, 25 y 37 °C durante 21 días.

Resultados y Discusión

Control de Tamaño por Sonicación

Los liposomas ERL sin tratar eran ~760 nm, reduciéndose a ~222 nm dentro de 10 min de sonicación con sonda; sonicación adicional produjo cambios de tamaño insignificantes. La sonicación en baño de agua logró reducción similar más rápido pero aumentó el calentamiento, por lo que se prefirió enfriamiento en baño de hielo-agua. Los liposomas post-diálisis promediaron 140 nm.

Eficiencia de Carga de DOX

La carga por gradiente AS produjo 90 %+ EE, superando ampliamente el ~17 % del gradiente de pH. Una concentración de 350 mM AS maximizó EE y minimizó variabilidad, probablemente debido a cristalización favorable de DOX-sulfato. Entre los cuatro protocolos, la combinación de incubación a 65 °C, 15 min sonicación con sonda y 30 min equilibración a temperatura ambiente (Grupo 2) rindió la EE más alta (~98 %). Sonicación más larga o equilibración retardada redujeron EE, presumiblemente por fuga de AS.

Morfología y Cristalinidad

Imágenes TEM confirmaron vesículas esféricas <200 nm. TEM de alta resolución y SAED revelaron cristales de DOX-sulfato altamente ordenados en el núcleo y cristales de ERL menos ordenados en la superficie externa de la bicapa. Controles de fármaco único mostraron patrones cristalinos similares, validando la integridad estructural del sistema de doble fármaco.

Estabilidad Física

Los cambios de diámetro fueron <15 % a 4 °C, <10 % a 25 °C y <6 % a 37 °C durante 21 días, indicando estabilidad robusta. La alta temperatura de transición de fase de DSPC y contenido de 40 % colesterol probablemente contribuyeron a esta resiliencia.

Liberación Tiempo-Diferencial

En PBS, ERL liberó ~65 % a 48 h, mientras que DOX liberó ~30 %. La ventana inicial de 8 h mostró >4 % h⁻¹ liberación de ERL versus <1 % h⁻¹ DOX, confirmando un perfil de liberación secuencial conducente a acción sinérgica.

Conclusiones

Establecimos una plataforma de nanoliposomas no PEGilada escalable que co-encapsula ERL y DOX con alta EE y tamaño controlado. La sonicación con sonda tras hidratación de película reduce óptimamente el diámetro vesicular. La carga por gradiente AS, especialmente con 350 mM AS y breve equilibración post-sonicación, rinde la mayor EE de DOX. TEM y SAED confirman arreglos cristalinos distintos de cada fármaco. Las vesículas son físicamente estables y exhiben liberación tiempo-diferencial de ERL y DOX, posicionándolas como vehículo prometedor para terapia oncológica sinérgica.

Abreviaturas

DOX

Doxorrubicina

DSPC

1,2‑Distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina

EE

Eficiencia de encapsulación

EPR

Permeabilidad y retención mejorada

ERL

Erlotinib

PK

Farmacocinética

POPG

1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal sódica)

SAED

Difracción electrónica de área seleccionada

SEM

Error estándar de la media

Tc

Temperatura de transición de fase

TEM

Microscopía electrónica de transmisión