Investigación sobre las características fisicoquímicas de un sistema basado en nanoliposomas para la administración dual de fármacos

Resumen

Los efectos sinérgicos de múltiples fármacos con diferentes modos de acción se utilizan para la quimioterapia combinatoria de cánceres intratables. La traducción de los efectos sinérgicos in vitro a la clínica se puede realizar utilizando un sistema de administración eficiente de los fármacos. A pesar de algunos estudios sobre liposomas de tamaño nanométrico que contienen erlotinib (ERL) y doxorrubicina (DOX) en una única vesícula de liposoma, no se han obtenido métodos de preparación fiables y reproducibles, así como las características fisicoquímicas de un nanoliposoma no PEGilado coencapsulado con ERL y DOX. aún se ha dilucidado. En este estudio, se prepararon nanoliposomas encapsulados en ERL utilizando el método de hidratación de película lipídica. Mediante ultrasonidos usando un sonicador de sonda, el diámetro del liposoma se redujo a menos de 200 nm. Se cargó DOX en los nanoliposomas encapsulados en ERL usando el método de gradiente de sulfato de amonio (AS) o gradiente de pH. Se investigaron los efectos de las condiciones de carga de DOX sobre la eficiencia de encapsulación (EE) de DOX para determinar un método eficaz de carga de fármaco. En el EE de DOX, el método de gradiente de AS fue más eficaz que el gradiente de pH. Los nanoliposomas encapsulados en fármacos duales tenían más del 90% de EE de DOX y 30% de EE de ERL, respectivamente. La microscopía electrónica de transmisión y los análisis de difracción electrónica de áreas seleccionadas de los nanoliposomas encapsulados en fármacos duales verificaron los cristales de sulfato de DOX altamente orientados dentro del liposoma, así como los pequeños cristales de ERL menos orientados en la región más externa del nanoliposoma. Los nanoliposomas fueron estables a diferentes temperaturas sin un aumento del diámetro de los nanoliposomas. Los nanoliposomas encapsulados en fármacos duales mostraron una liberación diferencial en el tiempo de ERL y DOX, lo que implica liberaciones secuenciales adecuadas para su sinergia. Los métodos de preparación y las características fisicoquímicas del sistema de administración dual de fármacos contribuyen al desarrollo del proceso óptimo y de sistemas más avanzados para las investigaciones traslacionales.

Antecedentes

Los cánceres intratables, como los cánceres de mama triple negativos, tienen límites para el tratamiento con terapias estándar debido a que la respuesta al daño del ADN está altamente interconectada con varias redes de señalización [1, 2, 3]. Se han estudiado estrategias terapéuticas que aumentan la quimiosensibilidad inicial de tales tumores recalcitrantes para desafiar los límites [4, 5]. Un estudio reciente que suprime las vías de señalización oncogénicas mientras se usa un agente que daña el ADN es una de las estrategias terapéuticas combinatorias [6, 7, 8]. El estudio sugirió que el pretratamiento de un inhibidor del factor de crecimiento para las células cancerosas resistentes sinergiza su respuesta apoptótica a un fármaco genotóxico [9, 10]. Existe una necesidad clínica muy importante de estrategias terapéuticas dirigidas a múltiples vías de supervivencia específicas de las células cancerosas para mejorar el grado de destrucción de las células tumorales y la posible reducción de la exposición total al fármaco durante el tratamiento [11, 12]. Mientras tanto, para trasladar los efectos sinérgicos in vitro de dos tipos de medicamentos a la clínica, es esencial un sistema de administración que pueda administrar ambos medicamentos y liberarlos de manera diferencial en el tiempo debido a la diferencia entre las propiedades farmacocinéticas (PK) de los fármacos y la dificultad para atacar las mismas células cancerosas en la secuencia temporal adecuada [13,14,15,16].

Un sistema de administración de nanoliposomas es uno de los sistemas de administración de fármacos duales que se puede aplicar a la terapia de combinación. Los componentes principales de los liposomas son en general fosfolípidos similares a los de las membranas celulares. Los fosfolípidos forman una esfera concéntrica de dos capas con un compartimento interno y membranas de dos capas [17]. Los nanoliposomas pueden permitir que los fármacos que tienen diferentes propiedades fisicoquímicas se carguen en el compartimento interno y la membrana bicapa de los liposomas y luego se administren a la lesión. Por lo tanto, el efecto sinérgico in vivo de los dos fármacos administrados utilizando el sistema nanoliposomal se puede lograr mediante una mejor colocalización de los fármacos en las células cancerosas no solo mediante la reconciliación de las propiedades PK de cada fármaco, sino también la así llamada permeabilidad y retención mejoradas ( EPR) efecto del tejido tumoral. Además de la encapsulación de fármacos en el compartimento interior, el nanoliposoma puede solubilizar fármacos hidrófobos, mejorar su estabilidad, modular sus propiedades de circulación sanguínea y, por tanto, inducir su acumulación en los tejidos tumorales [18].

A pesar de los estudios recientes sobre sistemas de administración de quimioterapia combinada basados en nanoliposomas, los procesos de preparación de los sistemas deben optimizarse para una fabricación confiable y reproducible, y las características fisicoquímicas de los mismos deben dilucidarse para el desarrollo de sistemas más avanzados [13, 19]. En nuestro estudio, un sistema de administración nanoliposomal coencapsulado con elrotinib (ERL; base libre de ERL, log _P =3.3) y doxorrubicina (DOX; DOX HCl, log _P =1,27) en una única vesícula de liposomas se preparó como un sistema de nanoliposomas modelo de acuerdo con un informe anterior, excepto para una formulación de liposomas denominada no pegilada [13], y se estudiaron las características fisicoquímicas del sistema. Se llevaron a cabo estudios de liberación de fármacos in vitro para investigar una liberación diferencial de tiempo de los fármacos. Entre varios métodos como la extrusión, la sonicación y la homogeneización a alta presión [20, 21, 22], se utilizó la ultrasonicación con un sonicador de sonda para reducir el diámetro de los liposomas debido a su procesabilidad más eficiente. Se realizó un estudio comparativo sobre los efectos de las tecnologías de carga de fármacos, como el método de gradiente de sulfato de amonio o pH, sobre la eficiencia de encapsulación (EE) del fármaco, para optimizar la encapsulación del fármaco. Además, se determinó el proceso más eficaz para la encapsulación de fármacos mediante la investigación de los efectos de las condiciones del proceso sobre el EE del fármaco. Se optimizaron las condiciones de preparación para el sistema de administración de fármacos dual nanoliposomal encapsulado tanto con ERL como con DOX y liberando los fármacos en una secuencia adecuada. Los métodos de preparación optimizados y las características del sistema de administración dual de fármacos sugieren una plataforma de procesos de preparación confiables y reproducibles y un sistema de administración más avanzado para estudios traslacionales.

Métodos

Materiales

1,2-Distearoil- sn -glicero-3-fosfocolina (DSPC) y 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfo- (1′- rac -glicerol) (sal de sodio) (POPG) se suministraron de Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AI, EE.UU.). El colesterol era de Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, EE. UU.). El clorhidrato de doxorrubicina (DOX) y la base libre de erlotinib (ERL) se adquirieron de Boryung Co., Ltd. (Seúl, Corea) y Shanghai Send Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China), respectivamente. El sulfato de amonio (AS) y el ácido cítrico (CA) anhidro se suministraron de Daejung Chemicals &Metals Co., Ltd. (Siheung-si, Corea). Todos los demás reactivos eran de grado reactivo y suministrados por Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, EE. UU.).

Preparación de nanoliposomas encapsulados en fármacos duales

Los procesos generales para preparar los nanoliposomas encapsulados tanto con ERL como con DOX se muestran en la Fig. 1. En resumen, se prepararon liposomas encapsulados con ERL utilizando el llamado método de hidratación de película lipídica delgada [23]. Se añadió ERL a la mezcla de lípidos formando la película de lípidos delgada con el fin de encapsular el fármaco en la membrana de la bicapa de lípidos de los liposomas. El diámetro de los liposomas se redujo mediante ultrasonidos con un sonicador de sonda (Vibra Cell; Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, EE. UU.). Se encapsuló DOX en el compartimento acuoso interno de nanoliposomas encapsulados en ERL usando un gradiente de concentración de iones transmembrana de los nanoliposomas. Los métodos experimentales y analíticos detallados del proceso se sugieren en las siguientes secciones.

Procesos para la preparación y caracterización de nanoliposomas encapsulados en fármacos duales

Liposomas encapsulados con ERL

Una mezcla de lípidos compuesta de DSPC, colesterol y POPG en una proporción de 27:20:3 ( w / w / w ) se mezcló con base libre de ERL en una relación en peso del fármaco al lípido total, 3:50. Esas mezclas se disolvieron en 9 ml de un disolvente mixto de cloroformo:metanol =2:1 ( v / v ). La solución lipídica se colocó en un matraz de fondo redondo y, para formar una membrana lipídica, el disolvente se eliminó usando un evaporador rotatorio (Rotavapor R-210; BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Suiza) al vacío a 40 ° C. La membrana se secó al vacío durante la noche para eliminar todo el disolvente residual. En estos procesos, las moléculas de ERL se insertan en la membrana lipídica a través de atracciones hidrofóbicas y luego se encapsulan espontáneamente en la membrana bicapa lipídica de los liposomas, que se forman mediante el siguiente proceso de hidratación.

Para hidratar la membrana lipídica que contiene ERL, se añadieron 8 ml de tampón AS 250-400 mM o ácido cítrico 300 mM (pH 3,9) a la membrana formada en la superficie interna del matraz de fondo redondo. Después de la incubación de la membrana a 65 ° C durante 30 min mediante la rotación del matraz, la suspensión de liposomas se sonicó usando un sonicador de baño (Branson 3510E-DTH; Branson, Danbury, CT, EE. UU.). Para reducir el diámetro de los liposomas, la suspensión de liposomas se sonicó usando el sonicador de sonda en condiciones tales como un pulso de 5 s encendido y 2 s apagado, una amplitud del 20% y una energía de 36 J por pulso en un baño de agua helada. , o un baño de agua con agitación magnética. Para eliminar el AS que se descargó en los nanoliposomas, se realizó la diálisis de los nanoliposomas durante la noche en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) con un tubo de diálisis con membrana de celulosa (corte de peso molecular 14.000 (MWCO); Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, Estados Unidos). En el caso de la suspensión de nanoliposomas preparada usando el tampón de ácido cítrico, el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 6,5 usando un tampón de bicarbonato de sodio 300 mM para hacer un gradiente entre el interior y el exterior de los nanoliposomas.

Carga de DOX en nanoliposomas encapsulados con ERL

Para encapsular DOX en nanoliposomas encapsulados en ERL, primero se disolvió el clorhidrato de DOX en una solución acuosa de NaCl al 0,9% a 65 ° C. En general, se añadieron 2 ml de una solución de DOX de 1,5 mg / ml a 8 ml de la suspensión de nanoliposomas encapsulada en AS y ERL o encapsulada en ácido cítrico y ERL. Los procesos de carga de fármaco de la suspensión de nanoliposomas con DOX añadido se compusieron de incubación, sonicación con el sonicador de baño, equilibrio a temperatura ambiente (RT) y diálisis contra PBS (pH 7,4) utilizando la membrana de celulosa del tubo de diálisis para eliminar el DOX no encapsulado de la suspensión de nanoliposomas. Los efectos de las condiciones de carga de DOX en el EE de DOX se investigaron utilizando cuatro grupos experimentales. El grupo 1 fue la mezcla de solución de DOX y los liposomas, que se trató en la secuencia de una incubación a 65 ° C durante 30 min, una sonicación a 65 ° C durante 5 min y una diálisis durante la noche. El grupo 2 se incubó a 65 ° C durante 30 min, se sonicó a 65 ° C durante 5 min, se equilibró durante 30 min a TA y luego se dializó durante la noche. El grupo 3 se incubó a 65 ° C durante 30 min, se sonicó a 65 ° C durante 15 min y luego se dializó durante la noche. El grupo 4 se incubó a 65 ° C durante 30 min, se sonicó a 65 ° C durante 15 min, se equilibró durante 30 min a TA y luego se dializó durante la noche.

Diámetro, morfología y estabilidad física de nanoliposomas encapsulados en fármacos duales

El diámetro de los nanoliposomas encapsulados en el fármaco se midió a 25 ° C usando un analizador de tamaño de partículas (ELS-Z; Otsuka Electonics Co., Ltd., Osaka, Japón). Se observaron la morfología y el diámetro medio de los nanoliposomas encapsulados en fármaco simple o doble utilizando un microscopio electrónico de transmisión de emisión de campo (FE-TEM) (JEM 2100F; JEOL Ltd., Tokio, Japón, instalado en el Instituto de Ciencias Básicas de Corea) a 200 kV. Para preparar la muestra, la suspensión de nanoliposomas se vertió sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono y la rejilla se secó al aire a temperatura ambiente antes de observarla al microscopio. Se investigó la estabilidad física de los nanoliposomas duales encapsulados en fármaco incubados en PBS (pH 7,4) a diferentes temperaturas de 4, 25 y 37 ° C controlando un cambio en el diámetro de los liposomas en función del tiempo. El diámetro de los liposomas se midió utilizando un analizador de tamaño de partículas (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Worcestershire, Reino Unido).

EE de drogas

La eficiencia de encapsulación (EE) de DOX o ERL en los nanoliposomas encapsulados en fármaco dual se determinó mediante la siguiente Eq. (1).

$$ \ mathrm {EE} \ \ left (\% \ right) ={C} _f / {C} _i \ times 100 $$ (1)

donde C _f es la cantidad encapsulada de ERL o DOX en los nanoliposomas medida después de la destrucción de los nanoliposomas con Triton-X 100 al 10% para una liberación completa de ERL o DOX de ellos. La absorbancia de ERL se midió utilizando un espectrómetro UV-Vis (espectrofotómetro DU-800; Backman Coulter Inc., Fullerton, CA, EE. UU.) A 345 nm y la intensidad de fluorescencia de DOX se utilizó un espectrofluorómetro (SFM-25; Tegimenta AG, Rotkreuz , Suiza) a 495 y 590 nm de longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. La cantidad de ERL o DOX se calculó utilizando la curva de calibración de ERL o DOX preparada de antemano. C _i es la cantidad de ERL o DOX añadida a la mezcla de lípidos o nanoliposomas encapsulados en ERL. Las cantidades se determinaron midiendo la absorbancia o la intensidad de fluorescencia de cada fármaco en las longitudes de onda correspondientes.

Liberación de medicamentos

Se llenó un casete de diálisis (10.000 MWCO, Slide-A-Lyser Dialysis Cassette G2; Thermo Scientific Corp., Rockford, IL, EE.UU.) con la suspensión de nanoliposomas encapsulados tanto con DOX como con ERL. El casete se colocó en PBS (pH 7,4) y el medio de prueba de liberación se agitó continuamente a 37ºC. En puntos de tiempo predeterminados, se tomaron alícuotas de la muestra del casete para determinar la concentración de cada fármaco y luego se calculó la liberación del fármaco mediante la siguiente Eq. (2).

$$ \ mathrm {Droga} \ \ mathrm {liberación} \ \ left (\% \ right) =\ left ({D} _i- {D} _t \ right) / {D} _i \ times 100 $$ (2 )

donde D _t es la concentración de DOX o ERL que queda en los nanoliposomas en un momento dado durante el período de prueba de liberación y D _i es la concentración de DOX o ERL encapsulada en los nanoliposomas antes del experimento de liberación del fármaco. La concentración de DOX se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia de la muestra con el espectrómetro de fluorescencia a 495 y 590 nm de longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. La concentración de ERL se determinó midiendo la absorbancia de la muestra a 345 nm con el espectrómetro UV-Visible.

Análisis estadístico

Los resultados se presentan como media ± SEM, a menos que se indique lo contrario.

Resultados y discusión

Efecto de los procesos de preparación en las características de los nanoliposomas

Se prepararon nanoliposomas duales encapsulados en fármaco encapsulando ERL en una membrana de bicapa lipídica y DOX en el compartimento interno de los nanoliposomas. Los liposomas encapsulados solo con ERL se prepararon hidratando la membrana lipídica incorporada con ERL con una solución acuosa de AS. Durante estos procesos, las moléculas de ERL se incorporan en la membrana lipídica a través de atracciones hidrofóbicas y luego se encapsulan espontáneamente en la membrana bicapa lipídica de los liposomas. Después de la hidratación, la suspensión de liposomas se sometió a ultrasonidos usando el sonicador de sonda de tipo cuerno para reducir el diámetro de los liposomas. Para investigar los efectos de la ultrasonicación y los métodos de enfriamiento en el diámetro del liposoma, los liposomas se trataron con un aumento del tiempo de sonicación en diferentes condiciones de enfriamiento y los resultados se muestran en la Fig. 2. La Figura 2a representa el efecto del tiempo de ultrasonicación en el diámetro e índice de polidispersidad (PDI) de los liposomas tratados bajo la condición de enfriamiento de un baño de agua helada. El diámetro de los liposomas encapsulados con ERL no tratados por ultrasonidos fue de 759 ± 44 nm. Sin embargo, hasta 10 min de ultrasonidos, el diámetro del liposoma disminuyó notablemente a 222 ± 40 nm, y después de 10 min, no hubo cambios significativos en el diámetro a medida que aumentaba el tiempo de ultrasonidos. Estos resultados indican que los liposomas encapsulados en ERL formados por la hidratación son en su mayoría vesículas multilaminares (MLV). La alta energía suministrada a los liposomas de tipo MLV a través de la ultrasonicación exfolia la multicapa de MLV y desmonta los liposomas grandes. En solución acuosa, los lípidos separados de las MLV se autoensamblan a través de atracciones hidrófobas y, por lo tanto, se transforman en nanoliposomas de tipo vesícula unilaminar grande (LUV) o de tipo UV pequeño (SUV). A medida que estos fenómenos se repiten, el diámetro medio de los nanoliposomas disminuye gradualmente [24, 25, 26]. Como se muestra en la Fig. 2a, el diámetro de los liposomas se redujo notablemente en un corto período de ultrasonidos. Se cree que durante este período, la mayoría de los liposomas de tipo MLV se convirtieron en liposomas de tipo LUV o SUV [27]. La ultrasonicación de más de 10 min provocó una ligera disminución del diámetro del liposoma, lo que indica una menor transformación del tipo de vesícula con el tiempo de ultrasonicación. El PDI del diámetro del liposoma disminuyó con un aumento del tiempo de ultrasonidos, lo que sugiere que el diámetro del liposoma se volvió uniforme con el tiempo a pesar de un ligero aumento del PDI después de 20 min. La Figura 2b representa el efecto del tiempo de ultrasonidos sobre el diámetro y el PDI de los liposomas tratados en condiciones de enfriamiento de un baño de agua. El diámetro de los liposomas no tratados por ultrasonidos fue 1433 ± 143 nm. El diámetro del liposoma disminuyó significativamente a 337 ± 67 nm hasta los 5 min de ultrasonidos, y después de 5 min, hubo una disminución gradual del diámetro hasta los 15 min, seguida de un pequeño cambio en el diámetro. El PDI del diámetro del liposoma varió con el tiempo de ultrasonidos hasta los 15 minutos y alcanzó una meseta a partir de entonces. En la condición de baño de agua, el tiempo empleado para reducir el diámetro de los liposomas por debajo del 30% del diámetro de los liposomas sin tratar fue más corto que el tiempo empleado en la condición de baño de agua helada. Se cree que la reducción del diámetro de los liposomas se realizó mediante la transferencia de la energía térmica generada por la ultrasonicación a los liposomas de tipo MLV. En comparación con la condición del baño de agua helada, la temperatura de la suspensión de liposomas sonicada en la condición de baño de agua se elevó demasiado, lo que implica que el calor de la suspensión de liposomas que tuvo lugar debido a un calentamiento en masa por cavitación ultrasónica se liberó de manera menos eficiente. Para evitar que la suspensión de liposomas sufra efectos secundarios tales como una evaporación media y un posible deterioro de las moléculas de lípidos inducido por el sobrecalentamiento, se eligió el baño de agua helada como condición de enfriamiento para la ultrasonicación. Por otro lado, los liposomas ultrasónicos se dializaron para eliminar el AS no encapsulado. Los nanoliposomas encapsulados en ERL y AS preparados usando ultrasonidos y diálisis tenían aproximadamente 140 nm del diámetro medio de nanoliposomas, lo que sugiere una ligera disminución del diámetro de nanoliposomas a través de la diálisis. Los nanoliposomas encapsulados en ERL y AS se utilizaron para la encapsulación de DOX en el compartimento interno de los nanoliposomas mediante el método de gradiente de AS.

Efectos del tiempo de sonicación de la sonda sobre el diámetro y el índice de polidispersidad de nanoliposomas encapsulados en ERL:un baño de agua helada ( a ) o un baño de agua ( b ) enfriamiento de la suspensión de liposomas en un recipiente durante la ecografía ( n =3, los datos se presentan como media ± SEM)

La Figura 3 muestra el diámetro de los nanoliposomas encapsulados con DOX y ERL según el tiempo de ultrasonidos utilizando un sonicador de baño durante un proceso de carga de DOX. Las variaciones bajas del diámetro fueron similares a las de 10 min de ultrasonidos de nanoliposomas encapsulados con ERL como se muestra en la Fig. 2a. A pesar del aumento del tiempo de ultrasonidos, el diámetro del nanoliposoma no cambió significativamente hasta los 45 min de ultrasonidos. Estos resultados pueden atribuirse al hecho de que los nanoliposomas encapsulados en DOX y ERL son LUV o SUV [27]. Mientras tanto, cuando el tiempo de ultrasonidos fue superior a 45 min, se produjo el aumento del SEM del diámetro medio de los nanoliposomas, lo que indica un aumento de las diferencias entre las muestras de liposomas. El PDI del diámetro disminuyó a medida que aumentaba el tiempo de ultrasonidos. Estos resultados sugieren que la uniformidad del diámetro de los liposomas aumentó con el tiempo de ultrasonidos a pesar de un ligero aumento del PDI después de 60 min de ultrasonidos. En resumen, el cambio en el diámetro de los nanoliposomas por ultrasonidos fue el más alto en la etapa de transformación donde los liposomas se convertirían de MLV a LUV o SUV. Por lo tanto, la ecografía para la reducción del diámetro de los liposomas fue la más efectiva cuando el tratamiento se realizó entre la hidratación de la membrana lipídica y la encapsulación de DOX en el compartimento interno de los nanoliposomas encapsulados en ERL durante un período relativamente corto.

Efectos del tiempo de sonicación del baño sobre el diámetro y el índice de polidispersidad de nanoliposomas encapsulados en DOX y ERL ( n =3, los datos se presentan como media ± SEM)

Efecto del método de carga de fármacos en EE

Los nanoliposomas duales encapsulados en fármaco se prepararon usando carga de DOX en nanoliposomas encapsulados en ERL con aproximadamente un 30% de EE de ERL y 140 nm de diámetro de nanoliposoma. La cantidad de DOX o ERL encapsulado en los liposomas se midió después de la destrucción de los liposomas con un tensioactivo para la liberación completa de los fármacos de los liposomas. La intensidad de fluorescencia de DOX y la absorbancia de ERL se midieron mediante espectrofluorometría y espectrometría UV-Vis, respectivamente. Para investigar los efectos de los métodos de carga de DOX sobre EE de DOX en nanoliposomas encapsulados con ERL y DOX, se utilizó un método de carga activa como el método de gradiente de pH o de gradiente AS para la encapsulación de DOX en los liposomas. Se investigó la diferencia en EE entre los dos métodos de carga de fármaco y los resultados se muestran en la Fig. 4. Los EE de DOX mediante el método de gradiente de AS fueron del 90% o más, y el EE mediante el uso de gradiente de pH fue de aproximadamente 17%, lo que indica que el método de gradiente de AS fue mucho más eficaz en la encapsulación de DOX que el método de gradiente de pH [28].

Eficiencia de encapsulación de DOX en nanoliposomas encapsulados en fármacos duales según métodos de carga de DOX y concentraciones de sulfato de amonio (AS):ácido cítrico CA ( n =3, los datos se presentan como media ± SEM)

Cuando se compararon los cambios en los EE de DOX según las concentraciones de AS, el EE fue el más alto y el SEM del EE fue el más bajo a 350 mM de AS. El método de gradiente AS o gradiente de pH utiliza un mecanismo de translocación de fármacos, que induce a los fármacos fuera de los nanoliposomas a migrar al compartimento interno de los nanoliposomas debido a una fuerza impulsora generada a partir de un gradiente de concentración de iones transmembrana de los nanoliposomas [29, 30]. El EE de DOX por el método de gradiente de AS fue, sin embargo, bastante más alto que el del método de gradiente de pH. Estos resultados pueden atribuirse al hecho de que el método de gradiente de AS es más eficaz en el desarrollo de complejos cristalinos que el método de gradiente de pH debido a una mayor cristalizabilidad entre el DOX ionizado y los contraiones dentro de los nanoliposomas [31, 32].

Efecto de las condiciones de carga de fármacos en EE

Para investigar el efecto de las condiciones de tratamiento para una mezcla de solución de DOX y nanoliposomas encapsulados en ERL en el EE de DOX durante el proceso de carga de DOX, se diseñaron y experimentaron cuatro grupos experimentales que se muestran en la Fig. 5a de acuerdo con las diferentes condiciones de tratamiento. El grupo 1 fue la mezcla tratada en la secuencia de incubación, sonicación y diálisis durante la noche. En el grupo 2, para investigar el efecto de un equilibrio de la mezcla sonicada sobre el EE, la mezcla se incubó, se sonicó, se equilibró durante 30 min a TA y luego se dializó durante la noche. Como grupo para investigar el efecto de una sonicación a largo plazo en el EE, el grupo 3 se incubó la mezcla, se sonicó a 65 ° C durante 15 min y luego se dializó durante la noche. Además, como grupo para investigar los efectos de una sonicación a largo plazo y un equilibrio en el EE, el grupo 4 se incubó la mezcla, se sonicó a 65 ° C durante 15 min, se equilibró durante 30 min a TA y luego se dializó durante la noche. En todos los grupos, la carga de DOX se llevó a cabo mediante el método de gradiente AS. Como se muestra en la Fig. 5b, los EE de DOX de los grupos 1, 2, 3 y 4 fueron 93 ± 7,8, 98 ± 2,5, 83 ± 4,9 y 59 ± 4,2%, respectivamente. En comparación con el EE del grupo 3, el EE del grupo 1 fue mayor, lo que indica que una duración más corta de la sonicación en baño es un tratamiento más eficaz para aumentar el EE en los nanoliposomas. En comparación con el EE del grupo 1, el grupo 2 tuvo mayor EE de DOX. El EE del grupo 4 fue el más bajo entre todos los grupos experimentados. En contraste con la mejora de EE por el equilibrio después de una sonicación a corto plazo aplicada al grupo 2, el equilibrio después de una sonicación a largo plazo aplicada al grupo 4 no fue eficaz para la mejora de EE. Estos resultados pueden deberse a la cantidad excesiva de energía suministrada a la suspensión, que podría romper los nanoliposomas durante el baño de sonicación descrita anteriormente. Además, se cree que mediante la sonicación en baño a largo plazo en los grupos 3 y 4, se redujo el EE debido a una disminución del contenido de AS en los nanoliposomas. Dado que la temperatura de la suspensión de nanoliposomas aumentó mucho más allá de la temperatura de transición de fase ( T _c ) mediante el baño de ultrasonidos a largo plazo, la fluidez de la bicapa lipídica aumentó y, por lo tanto, indujo la liberación de AS de los liposomas. Las muestras de nanoliposomas del grupo 3 se dializaron inmediatamente después del baño de sonicación, lo que sugiere un enfriamiento rápido de las muestras. Por el contrario, las muestras de nanoliposomas del grupo 4 se trataron mediante el baño de ultrasonidos a largo plazo seguido del equilibrio, que podría mantener la liberación de AS, aumentar la formación de complejo DOX-sulfato fuera de los liposomas y, por lo tanto, reducir el EE. Aunque el equilibrio después de la sonicación a largo plazo no fue eficaz, estos resultados sugieren que el proceso de carga de DOX, como un tratamiento secuencial de la mezcla de la solución de DOX y los nanoliposomas encapsulados en ERL, una incubación por encima de T _c de fosfolípido, una sonicación de baño, un equilibrio por debajo de la T _c , por ejemplo, en RT, y una diálisis nocturna, es un método más eficaz para aumentar la EE que otros procesos sin el tratamiento de equilibrio [33,34,35].

Eficiencia de encapsulación de DOX en nanoliposomas encapsulados en fármacos duales de acuerdo con diversas condiciones de carga del fármaco:condiciones de carga del fármaco para cada grupo experimental ( a ) y la eficacia de encapsulación de fármacos de los grupos experimentales ( b ) ( n =3, los datos se presentan como media ± SEM)

Morfología y estabilidad física de nanoliposomas encapsulados en fármacos duales

La Figura 6 muestra la morfología de los nanoliposomas observada por TEM. Las muestras para la observación de TEM se prepararon utilizando gota a gota de los nanoliposomas coencapsulados con ERL y DOX sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono y secando al aire a temperatura ambiente. Con el fin de comparar las características de los liposomas encapsulados en fármaco dual con los liposomas encapsulados en fármaco único, se observó mediante TEM la morfología de los nanoliposomas encapsulados en ERL o encapsulados en DOX. Como se muestra en la Fig. 6a, el diámetro de los nanoliposomas encapsulados con fármaco dual era menor de 200 nm y la forma era casi esférica. El diámetro de los liposomas observado a través del análisis TEM coincidió con el valor medido usando un analizador de tamaño de partículas que utiliza dispersión de luz dinámica. La Figura 6b muestra la imagen de un único nanoliposoma que contiene complejos DOX-sulfato dentro del liposoma. Se asumió que los complejos eran los cristales formados por atracción entre cationes DOX protonados y aniones sulfato divalentes [36]. La Figura 6c muestra una imagen TEM de alta resolución (HR-), que exhibió los cristales de fármaco en la región más externa del nanoliposoma presente en la Figura 6b. La imagen reveló que una red altamente cristalina en el compartimento interno del nanoliposoma y un dominio menos cristalino tienen un dominio amorfo cerca del carbono en la rejilla [37]. El dominio amorfo en la región más externa del nanoliposoma puede deberse a la inestabilidad de la bicapa lipídica tras la exposición al haz de electrones con alta energía. El patrón de difracción de electrones de área seleccionada (SAED) presente en la Fig. 6d exhibió una regularidad de puntos de difracción brillantes, lo que indica que los cristales mostrados en la Fig. 6c tienen una red cristalina altamente ordenada [38]. Para comparar los resultados del análisis TEM de los nanoliposomas encapsulados en fármaco dual con los de los nanoliposomas encapsulados en fármaco individual, el nanoliposoma encapsulado en ERL se observó mediante TEM y la imagen se muestra en la Fig. 6e. La región más externa del nanoliposoma presente en la Fig. 6e fue observada por HR-TEM, y el resultado se muestra en la Fig. 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.

Conclusiones

As a dual drug delivery system, a nanoliposomal delivery system encapsulating both ERL and DOX was prepared and characterized. The liposome diameter was controllable by ultrasonication, and the sonication for diameter reduction was effective when carried out after the film-hydration and before DOX encapsulation. The nanoliposome diameter decreased remarkably during an initial period of ultrasonication. DOX was loaded into ERL-encapsulated nanoliposomes through pH- or AS-gradient method. AS-gradient method showed higher EE of DOX than pH-gradient, and the AS concentration for higher EE of DOX was determined. Equilibration of a mixture of DOX solution and ERL-encapsulated nanoliposomes in DOX-loading process was advantageous for EE increase of DOX. By HR-TEM and SAED analyses of the dual drug-encapsulated nanoliposomes, not only the highly oriented crystals formed between protonated DOX cations and divalent sulfate anions inside the liposome but also the less oriented small crystals of ERL in the outermost layer of the nanoliposome were identified. ERL and DOX co-encapsulated in the nanoliposomes showed a time-differential release, indicating much faster release of ERL than that of DOX from the liposomes. The elucidated preparation methods of the nanoliposomal dual drug delivery system can contribute to development of advanced dual drug delivery systems and translational researches of the combination therapies exhibiting synergistic effects via sequential actions of the drugs.

Abreviaturas

DOX:: Doxorubicin
DSPC:: 1,2-Distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine
EE:: Encapsulation efficiency
EPR:: Enhanced permeability and retention
ERL:: Erlotinib
PK:: Pharmacokinetic
POPG:: 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sodium salt)
SAED:: Difracción de electrones de área seleccionada
SEM:: Standard error of mean
T _c :: Phase-transition temperature
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión

Efecto de campo ferroeléctrico Inducido por efecto de conmutación asimétrica resistiva en BaTiO3 / Nb:Heterouniones epitaxiales SrTiO3 Generación de especies reactivas de oxígeno en soluciones acuosas que contienen GdVO4:nanopartículas de Eu3 + y sus complejos con azul de metileno

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