Nanoplataformas de sílice mesoporosa hueca recubiertas de quitosano, sensibles a enzimas, para administración dirigida de fármacos en colon

Resumen

Se desarrolló un sistema de administración específico de colon sensible a enzimas basado en esferas de sílice mesoporosa hueca (HMSS) a las que se unió quitosano biodegradable (CS) mediante enlaces azo escindibles (HMSS–N=N–CS). La doxorrubicina (DOX) se encapsuló en estado no cristalino en la cavidad hueca y los mesoporos de las HMSS con una alta capacidad de carga del 35,2 %. Los ensayos de liberación in vitro demostraron que HMSS–N=N–CS/DOX libera el fármaco en respuesta a enzimas. El CS injertado aumenta la biocompatibilidad y estabilidad, y reduce la adsorción de proteínas en las HMSS. Los resultados de irritación de mucosa gastrointestinal y citotoxicidad celular indicaron buena biocompatibilidad de HMSS y HMSS–N=N–CS. La captación celular mostró que la incorporación de DOX aumentó notablemente tras preincubar HMSS–N=N–CS/DOX con una mezcla enzimática colónica. HMSS–N=N–CS/DOX incubado con enzimas colónicas mostró mayor citotoxicidad, y su valor IC₅₀ fue tres veces menor que el del grupo sin enzimas. Este trabajo sienta las bases para futuras investigaciones sobre transportadores mesoporosos para administración oral específica de colon.

Introducción

Recientemente, los sistemas de administración de fármacos sensibles a estímulos (DDS) han atraído gran atención para la carga eficiente y liberación selectiva de fármacos en tejidos enfermos. Estos sistemas pueden llegar a los sitios diana y liberar el fármaco a demanda, mejorando los efectos terapéuticos y evitando efectos secundarios por fuga prematura. Diversos estímulos internos y externos, como potencial redox, pH, enzimas, temperatura y luz, se han usado para diseñar DDS sensibles. Entre ellos, las enzimas, como estímulos internos, han ganado relevancia por sus concentraciones distintas en diferentes tejidos.

En las últimas dos décadas, las esferas de sílice mesoporosa (MSS) con poros de 2–50 nm se han establecido como transportadores sensibles a estímulos, dado su gran volumen poroso, alta área superficial, estructura porosa organizada, superficie fácilmente funcionalizable y buena biocompatibilidad. Además, las nanopartículas de esferas de sílice mesoporosa hueca (HMSS) con estructura de caparazón mesoporoso y cavidad hueca son superiores a las MSS convencionales, ya que la estructura hueca permite albergar más fármaco con mayor capacidad de almacenamiento. Se han desarrollado todo tipo de nanotransportadores sensibles a estímulos basados en MSS usando diversos «guardián» como polímeros, nanopartículas inorgánicas, dendrímeros, biomacromoléculas, compuestos macroclíclicos péptidos y lípidos. Aunque numerosos DDS basados en MSS con tapones funcionales logran liberación sensible a estímulos externos o internos, pocos se han usado en administración dirigida específica de colon.

La administración oral es la vía preferida y sencilla. La administración dirigida específica de colon es muy atractiva para tratar enfermedades colónicas como la enfermedad de Crohn, el cáncer colorrectal y la colitis ulcerosa. Sin embargo, enfrenta desafíos: menor contenido de agua y superficie de absorción oral que en otros sitios del tracto gastrointestinal (GI). Además, los DDS orales encuentran un entorno fuertemente ácido en el estómago, que puede degradar los fármacos cargados, impidiendo la administración dirigida al colon. Por ello, se han diseñado varios DDS dependientes del pH para liberación desencadenada por pH en valores casi neutros (6–7) del tracto GI, resistiendo las condiciones ácidas del estómago. Solo existe una ligera diferencia de acidez entre la región intestinal (pH 6,8) y la colónica (pH 7,4); por tanto, estos DDS sensibles al pH dificultan la liberación específica de colon.

El quitosano (CS), un polisacárido catiónico, biodegradable y natural, consta de unidades de glucosamina y N-acetil-D-glucosamina β-(1-4) enlazadas. El CS ha recibido gran atención en medicina biológica por sus propiedades: biodegradabilidad, biocompatibilidad, mucoadhesividad y actividad antibacteriana. Comparado con polímeros, polielectrolitos y supermoléculas sintetizados mediante procesos complejos, el CS es relativamente barato y fácilmente disponible por desacetilación exhaustiva de la quitina. Además, se ha reportado que el CS puede abrir uniones estrechas entre células, aumentando la absorción de fármacos. Por tanto, el polímero CS se seleccionó como agente tapón por su buena biocompatibilidad y tamaño adecuado para cubrir los mesoporos de las HMSS y bloquear la liberación del fármaco.

En este trabajo, se diseñó por primera vez un DDS específico de colon sensible a enzimas basado en material HMSS (HMSS–N=N–CS) como se muestra en el Esquema 1. Los transportadores HMSS se prepararon mediante una estrategia de grabado selectivo. El polímero CS se unió a la superficie de las HMSS mediante enlaces azo para actuar como guardián y bloquear las aberturas. Los enlaces azo entre HMSS y CS pueden ser escindidos por enzimas en sitios colónicos, resultando en la separación del CS de las aberturas de las HMSS. La DOX se usó como fármaco modelo para incrustar en la cavidad de las HMSS, y se realizaron experimentos de liberación in vitro para evaluar la liberación sensible a enzimas en presencia de enzimas colónicas. La microscopía confocal de barrido láser (CLSM) y la citometría de flujo (FCM) se usaron para investigar la captación celular por células Caco-2. Finalmente, se midió la citotoxicidad de HMSS–N=N–CS/DOX hacia células Caco-2.

Materiales y métodos

Materiales

Tetraetoxisilano (TEOS); N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida clorhidrato (EDC); quitosano (DAC ≥ 95 %); bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB); 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES); 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT); ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico; bromuro de potasio (pureza espectral, ≥ 99,5 %); N-hidroxisuccinimida (NHS) y DOX se compraron en Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). El ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico fue suministrado por Inno-chem Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Medios de cultivo celular DMEM, penicilina-estreptomicina y suero fetal bovino (FBS) fueron suministrados por GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, EE. UU.). Todos los reactivos analíticos se usaron sin purificación adicional.

Preparación de HMSS–N=N–CS

Preparación de HMSS–NH₂

Las nanopartículas HMSS se prepararon basándose en un trabajo publicado usando un método de grabado selectivo. Primero, las esferas de sílice sólidas se sintetizaron por un método Stober modificado. Brevemente, 6 mL de TEOS se vertieron en una mezcla de 10 mL de agua desionizada, 74 mL de etanol y 3 mL de NH₃·H₂O concentrado. La mezcla se agitó 60 min para obtener suspensiones coloidales de sílice a temperatura ambiente. Las esferas sólidas se centrifugaron, lavaron y secaron. Luego, la capa de sílice mesoporosa se recubrió sobre las esferas sólidas. 300 mg de sílice sólida se dispersaron en 50 mL de agua desionizada por ultrasonicación 45 min. La suspensión se vertió en una mezcla de 60 mL etanol, 450 mg CTAB, 90 mL agua y 1,7 mL NH₃·H₂O. Tras agitar 60 min, se añadió TEOS (0,75 mL). Las nanopartículas se centrifugaron tras agitar 6 h, se recolocaron en 40 mL agua. Se añadió 1,2 g Na₂CO₃ con agitación vigorosa. La mezcla se mantuvo a 55 °C 12 h. Los productos HMSS se recogieron y lavaron con etanol anhidro. El método de post-grafting con relación HMSS:APTES 4:1 (m/v) preparó HMSS–NH₂ a 80 °C bajo N₂ 8 h; el CTAB se eliminó por reflujo.

Preparación de HMSS–N=N–COOH

Ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico (50 mg) se añadió en PBS pH 5,8. Luego, EDC (5 mg/mL) y NHS (3 mg/mL) se añadieron para activar el ácido a 30 °C 1 h. Se añadieron 10 mL PBS con 15 mg/mL HMSS–NH₂ y la mezcla se agitó 24 h. El HMSS–N=N–COOH resultante se separó por centrifugación y lavado con etanol.

Preparación de HMSS–N=N–CS

0,15 g CS y 0,5 mL ácido acético se añadieron en 50 mL agua para preparar solución de CS. 100 mg HMSS–N=N–COOH se dispersaron en 25 mL PBS pH 5,0 y se activaron con EDC y NHS 0,5 h. Luego, 10 mL solución CS se vertieron en la suspensión con agitación continua 1 día. Finalmente, el HMSS–N=N–CS sintetizado se centrifugó y lavó para recoger las muestras.

Extracción de mezcla enzimática colónica de microflora

La microflora colónica se recogió según trabajo publicado. Luego, el cultivo se inoculó para obtener mezcla enzimática secretada por microflora colónica a 37 °C. El medio colónico simulado con mezcla enzimática se filtró a través de filtro 0,22 μm para eliminar restos celulares. El filtrado se liofilizó para obtener la mezcla enzimática en polvo, usada en estudios posteriores.

Proceso de carga de fármaco y liberación sensible a enzimas

25 mg DOX se disolvieron en 5 mL solución HCl pH 3,5. 100 mg HMSS–N=N–CS se añadieron a la solución DOX y se agitaron a temperatura ambiente 12 h. Luego, se usó NaOH 0,2 M para ajustar pH a 7,0, y la suspensión se agitó otras 12 h. El HMSS–N=N–CS cargado con DOX (denominado HMSS–N=N–CS/DOX) se centrifugó y lavó para eliminar DOX adsorbido en superficie. El sobrenadante se recogió en cada paso para medir la eficiencia de carga (LE) de DOX a 480 nm por espectrofotometría UV-Vis. La masa total de DOX cargada se calculó restando la DOX no cargada tras el proceso de carga de la masa inicial de DOX añadida. HMSS/DOX se preparó como control usando HMSS como transportador inicial. La LE de DOX se calculó según la ecuación:

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

Donde m_A fue la masa de DOX añadida, m_B la masa de DOX en sobrenadante, y m_C la masa total de HMSS–N=N–CS.

La liberación in vitro sensible a enzimas de DOX desde HMSS–N=N–CS/DOX se evaluó así: 2 mg HMSS–N=N–CS/DOX y HMSS/DOX se dispersaron en PBS pH 7,4 agitando a 125 rpm con diferentes concentraciones de mezcla enzimática colónica (0, 0,3 y 1 mg/mL). A intervalos determinados, 1 mL medio de liberación se tomó para medir absorbancia. La liberación de DOX se midió a 480 nm. HMSS/DOX se usó como control.

Adsorción de BSA

La cantidad de adsorción de BSA se evaluó según trabajos publicados. BSA se añadió en PBS pH 7,4 (0,5 mg/mL). 5 mg HMSS, HMSS–NH₂ y HMSS–N=N–CS se añadieron a 2,5 mL PBS (pH 7,4). Se suministró igual volumen de solución BSA, y la suspensión se colocó en agitador a 100 rpm. Tras 6 h, centrifugación recogió el sobrenadante. Finalmente, la concentración de BSA se midió a 595 nm tras tinción con solución azul brillante Coomassie.

Caracterización

La estructura de red mesoporosa y morfología de nanopartículas HMSS se evaluaron por imágenes TEM (EM–208S, CSIS, EE. UU.). El área superficial y distribución de tamaño de poro se caracterizaron usando analizador de adsorción de nitrógeno (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). Los potenciales ξ y tamaños de partícula se caracterizaron en Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido). Análisis TGA se midió en equipo TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Japón) con velocidad de calentamiento 10 °C/min bajo flujo nitrógeno. Espectros FT-IR se midieron usando espectrómetro FT-IR (Bruker Tensor27, Suiza). Rango 400–4000 cm⁻¹ con técnica pastilla KBr. XRD de potencia se realizó en difractómetro Siemens D5005 (Karlsruhe, Alemania) con radiación Cu-Kα (λ = 1,5418 Å).

Cultivo celular y experimento de captación celular

Células Caco-2 se cultivaron en medio suplementado con 10 % FBS, 1 % aminoácidos no esenciales, 1 % (v/v) piruvato sódico, 1 % estreptomicina. Células NIH-3T3 se cultivaron en DMEM con 1 % estreptomicina y 10 % FBS. La captación de nanotransportadores por células Caco-2 se caracterizó usando FCM y CLSM. Células Caco-2 se sembraron en placas 24 pocillos. Tras cultivo overnight, DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX, y HMSS–N=N–CS/DOX preincubado con nanopartículas de enzima colónica (equivalente a 5 μg/mL DOX) se añadieron a pocillos correspondientes. Tras incubación 2 h, el medio se retiró y lavó con PBS. Las células se fijaron con formaldehído 4 % y tiñeron con Hoechst 33258 para observación CLSM. FCM usó para evaluación cuantitativa de captación celular. Células Caco-2 se sembraron en placas 6 pocillos e incubaron 24 h. Tras lavado con PBS, se incubaron con DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX, y HMSS–N=N–CS/DOX preincubado con enzima colónica (equivalente a 5 μg/mL DOX) en DMEM sin suero 2 h. Luego, células se enjuagaron con PBS frío, tripsinizaron y resuspendieron en 0,5 mL PBS. La fluorescencia DOX en células se midió usando citómetro de flujo FACS Canto (Becton, Dickinson, EE. UU.).

Ensayo in vitro de proliferación celular

La citotoxicidad de transportadores vacíos HMSS y HMSS–N=N–CS hacia células NIH-3T3 y Caco-2 se testó por ensayo MTT. Brevemente, células Caco-2 y NIH-3T3 se sembraron separadamente en placas 96 pocillos e incubaron overnight. El medio viejo se sustituyó por medio sin suero con diferentes concentraciones de nanopartículas. Tras incubación 2 días, se añadieron 50 μL solución MTT (2 mg mL^–1) e incubaron 4 h para medir células vivas. Luego, se retiró solución MTT y se añadieron 150 μL DMSO para disolver formazán. La absorbancia se midió en lector de microplacas (Tecan, Männedorf, Suiza) a 570 nm. La citotoxicidad de DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX, y HMSS–N=N–CS/DOX preincubado con mezclas enzimáticas de microflora colónica se midió usando células Caco-2 con concentraciones DOX correspondientes (0,1, 1, 5, 10, 20 μg/mL). Tiempo incubación 48 h, demás procesos iguales.

Estudios de toxicidad

Los tests de irritación de mucosa gastrointestinal son vitales para evaluar la bioseguridad in vivo de administración oral. Ratas Sprague-Dawley macho (180 ± 10 g) se dividieron aleatoriamente en tres grupos (tres ratas cada grupo). Ratas recibieron suero salino, HMSS, y nanopartículas HMSS–N=N–CS con dosis 100 mg/kg cada día. Tras 7 días, todas las ratas fueron sacrificadas, tejidos recogidos y examinados por examen histopatológico (H&E). Para evaluar bioseguridad de nanopartículas HMSS y HMSS–N=N–CS, el peso corporal de ratones BALB/c (18–20 g) se registró tras administración oral a dosis 100 mg/kg cada dos días. Todos los procedimientos experimentales se realizaron según directrices para Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de Universidad Médica Qiqihar y aprobados por Comité de Ética de dicha universidad.

Estadísticas

Datos estadísticos se analizaron con software SPSS usando prueba t de Student de dos colas. Barras de error presentadas son DE. Un p < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de HMSS–N=N–CS

Las HMSS se prepararon basándose en trabajos previos con ligeros cambios. Primero, se prepararon nanoesferas de SiO₂ sólidas, y una capa mesoporosa se recubrió sobre la superficie de las nanoesferas de sílice sólida conteniendo plantilla CTAB. Luego, Na₂CO₃ se usó para grabar selectivamente las nanoesferas de SiO₂ sólidas mientras la capa mesoporosa era protegida por plantilla CTAB. La preparación de HMSS–N=N–CS con CS unido como «guardián» por enlace azo se describe en Fig. 1a. Primero, las superficies de nanopartículas HMSS se modificaron con APTES como reactivo de acoplamiento alquilo para convertirse en HMSS amino-funcionalizadas (HMSS–NH₂) por método de post-modificación. Posteriormente, HMSS–N=N–COOH se preparó por reacción de amidación entre grupos amino de HMSS–NH₂ y grupos carboxilo de ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico. Luego, CS se modificó covalentemente sobre superficie de nanopartículas HMSS por reacción de amidación entre grupos carboxilo de HMSS–N=N–COOH y grupos amino en CS.

Como se muestra en imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) en Fig. 1a, el diámetro promedio de HMSS fue 280 nm, con estructura hueca uniforme y caparazón mesoporoso altamente ordenado. El espesor promedio del caparazón mesoporoso fue ~90 nm. Comparado con superficie lisa de HMSS, la superficie de HMSS–N=N–CS con polímero injertado (Fig. 1b) era rugosa, indicando que CS cubría el transportador HMSS.

Las áreas superficiales y distribuciones de poros de materiales mesoporosos juegan papel crucial en carga y entrega de moléculas huésped para liberación controlada. Curvas de distribución de tamaño de poro e isotermas se midieron por análisis de adsorción/desorción N₂ (Fig. 2). Parámetros detallados (área superficial BET (S_BET), volumen total poroso (V_P), distribución tamaño poro (D_P)) se muestran en Tabla 1. El S_BET y V_P de HMSS puras fueron 810,7 m²/g y 0,969 cm³/g, respectivamente, y D_P ~3,8 nm. El D_P de HMSS–NH₂ fue casi igual al de HMSS tras aminación, indicando que mesoporos no se bloquearon tras funcionalización amino. El S_BET y V_P de HMSS–N=N–CS disminuyeron marcadamente tras modificación con compuesto azo y recubrimiento CS, indicando que CS cubrió la superficie de HMSS.

El injerto exitoso de HMSS–N=N–CS se verificó por varios métodos. El potencial ξ de HMSS–NH₂ cambió grandemente tras funcionalización, variando de −27,9 a +31,4 mV (Fig. 3a), atribuido a adición de grupos amino en superficie HMSS. Tras reaccionar HMSS–NH₂ con ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico para formar HMSS–N=N–COOH, el potencial ξ disminuyó a −2,0 mV por grupos carboxilo en superficie. Tras injertar polímero CS para formar HMSS–N=N–CS, el potencial ξ volvió a +32,4 mV, atribuido a recubrimiento CS abundante en amino positivamente cargado. Curvas de análisis termogravimétrico (TGA) de HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, y HMSS–N=N–CS se muestran en Fig. 3b. Comparado con HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS perdió peso adicional ~19 %, debido a eliminación de cadenas CS. El injerto de enlaces azo en superficie HMSS también se confirmó por cambio de color durante preparación de HMSS–N=N–COOH (inset Fig. 3b). El reactivo HMSS–NH₂ es blanco, mientras producto HMSS–N=N–COOH fue amarillento-pardo tras reacción con grupos amino. El diámetro hidrodinámico (D_H) e índice polidispersidad (PDI) de HMSS, HMSS–NH₂, y HMSS–N=N–CS se determinaron en agua destilada (Fig. 3c). HMSS tuvo diámetro 309 nm y PDI 0,190. Tras adición de grupos amino para formar HMSS–NH₂, D_H aumentó a 324 nm. Diámetro HMSS–N=N–CS fue 342 nm, mayor que HMSS–NH₂ por cadenas CS injertadas. PDI HMSS–N=N–CS (0,177) menor que HMSS–NH₂, indicando tamaños partículas más uniformes tras injerto CS. Comparado con diámetros TEM, los diámetros HMSS y HMSS–N=N–CS medidos por DLS fueron mayores. El D_H se midió en ambiente acuoso con capa hidratación, mientras tamaño TEM se obtuvo de nanopartículas secas. Espectros FT-IR de HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS, y CS se muestran en Fig. 4d. Comparado con picos HMSN–NH₂, aumento picos adsorción 2853 y 2925 cm⁻¹ atribuido a vibración −CH₂ en injerto enlaces azo carboxilo-terminal. Tras añadir CS a superficie HMSS–N=N–COOH, aumentaron picos 1660 cm⁻¹ y 3435 cm⁻¹, atribuidos a υ_(C=O) en banda amida y vibración N–H en CS. Todos los resultados probaron preparación exitosa HMSS–N=N–CS.

Estado del fármaco y eficiencia de carga

DOX se eligió para investigar comportamientos carga y liberación HMSS–N=N–CS. Cuando pH suspensión nanopartículas HMSS–N=N–CS se ajustó a 3,5, el biopolímero CS se volvió positivamente cargado (pK_a CS 6,3) por grupos amino protonados en ambiente ácido. El polímero CS se cargó positivamente e hinchó, abriendo mesoporos HMSS por interacción repulsiva entre cargas CS. Así, DOX accedió a mesoporos HMSS–N=N–CS por difusión. Sin embargo, tras ajustar mezcla cargada a 7,4, cadenas CS desprotonaron y colapsaron para impedir liberación prematura DOX.

La LE de HMSS–N=N–CS/DOX fue 35,2 %, mucho mayor que otros sistemas administración DOX basados en sílice mesoporosa. La alta LE DOX en nanotransportadores HMSS se atribuyó a cavidad hueca, gran área superficial, y red mesoporosa, que actúan como reservorio fármaco. El estado físico DOX en HMSS–N=N–CS/DOX se evaluó por difracción rayos X (XRD). Como muestran perfiles XRD (Fig. 4), DOX crudo mostró picos difracción cristalinos característicos e intensos. La mezcla física (PM) HMSS–N=N–CS y DOX también mostró picos difracción cristalinos obvios. Sin embargo, HMSS–N=N–CS/DOX no mostró picos cristalinos distintos, probando que estado físico DOX en HMSS–N=N–CS/DOX era no cristalino por restricciones estructura mesoporosa HMSS.

Liberación in vitro sensible a enzimas en ambiente colónico simulado

Para investigar liberación sensible a enzimas HMSS–N=N–CS, nanopartículas HMSS–N=N–CS/DOX y HMSS/DOX se añadieron a PBS pH 7,4 con diferentes concentraciones mezcla enzimática colónica. Como muestra Fig. 5a, HMSS–N=N–CS/DOX exhibió liberación lenta DOX en PBS pH 7,4, porcentaje acumulado solo ~10 % en 24 h, indicando buena capacidad tapón de polímeros CS y enlaces azo. Como se esperaba, con enzima diluida en PBS pH 7,4, liberación acumulada DOX mejoró a >20 % mismo período. Además, cantidad liberación DOX aumentó dramáticamente a casi 40 % con enzima concentrada. Comparado con liberación sensible a enzimas desde HMSS–N=N–CS/DOX, liberación DOX desde HMSS/DOX tuvo tendencias similares con o sin enzima concentrada. El porcentaje liberación relativamente bajo se debió a interacción electrostática entre HMSS cargado negativamente y DOX cargado positivamente. Resultados probaron que liberación DOX desde HMSS–N=N–CS/DOX se aceleró marcadamente por enzimas extraídas de microflora en regiones colónicas. El mecanismo liberación sensible a enzimas podría ser que enlaces azo en HMSS–N=N–CS son degradados por enzima, causando desprendimiento CS de superficie HMSS y liberación rápida desde HMSS. Se ha reportado que enlaces azo son escindidos por enzimas secretadas por microflora colónica.

Adicionalmente, para evaluar liberación sensible a enzimas desde HMSS–N=N–CS/DOX en ambiente GIT mimético, nanoplataformas HMSS–N=N–CS/DOX se dispersaron inicialmente en JGS 2 h, luego en JIS 6 h, y finalmente transportadores se añadieron a PBS pH 7,4 con 1 mg/mL enzima extraída. Como muestra Fig. 5b, en jugo gástrico simulado, liberación DOX fue relativamente rápida, cantidad acumulada alcanzó 15 % en 2 h. Liberación rápida se debió a interacción más débil entre HMSS–N=N–CS y DOX en condiciones ácidas que neutras. Luego, liberación DOX se desaceleró en JIS 2–8 h. Sin embargo, tras incubar HMSS–N=N–CS/DOX con enzimas extraídas en PBS pH 7,4, liberación DOX continuó aumentando marcadamente, cantidad acumulada alcanzó >50 % en 24 h. La liberación incompleta DOX desde HMSS–N=N–CS/DOX se debió a fuerte interacción entre DOX cargado positivamente y HMSS cargado negativamente.

Adsorción proteica y estabilidad HMSS–N=N–CS

Para administración oral, propiedades superficiales nanotransportadores afectan inevitablemente comportamientos liberación fármaco y bioadsorción. Ensayo adsorción proteica en superficie evaluó efecto CS injertado en superficie HMSS. Como muestra Fig. 6a, nanotransportadores HMSS desnudos tuvieron adsorción BSA dramática hasta 16,5 %, atribuida a gran área superficial y cavidad hueca HMSS, fuerte capacidad adsorción, e interacciones inespecíficas entre grupos silanol HMSS y BSA. Además, HMSS–NH₂ tuvo adsorción BSA relativamente alta 10,2 %. Sin embargo, porcentaje BSA adsorbido en superficie disminuyó marcadamente a 2,5 % tras añadir polímero CS como cubierta, reduciendo dramáticamente efecto en comportamiento in vivo HMSS–N=N–CS. Para observar estabilidad HMSS–N=N–CS y HMSS, 20 mg cada uno se añadieron a PBS pH 7,4 y agua desionizada. Como muestra Fig. 6b, aunque ambos eran relativamente estables en agua, HMSS floculó rápidamente en PBS pH 7,4. Por el contrario, dispersabilidad HMSS–N=N–CS mejoró obviamente tras injertar polímero CS en superficies HMSS. Además, transportadores HMSS–N=N–CS permanecieron estables >12 h sin precipitación en PBS pH 7,4. Resultados probaron que recubrimiento con polímero CS hidrofílico mejora dispersabilidad y disminuye adsorción proteica en superficie HMSS–N=N–CS.

Captación celular

Células Caco-2, como células adenocarcinoma colorrectal epitelial humano, son modelo ampliamente usado en administración oral fármacos. Como muestra Fig. 7a, células Caco-2 incubadas con DOX libre mostraron señal fluorescencia relativamente fuerte por DOX, ya que DOX cargado positivamente entraba en célula y luego núcleo. Comparado con grupo DOX libre, grupo HMSS–N=N–CS/DOX mostró intensidad señal fluorescencia más débil por liberación incompleta DOX desde HMSS–N=N–CS/DOX. Sin embargo, tras preincubar HMSS–N=N–CS/DOX con mezcla enzimática colónica 1 h, mostró señal fluorescencia marcadamente aumentada. Esto se atribuyó a escisión enlaces azo por mezcla enzimática, llevando a remoción CS de superficies HMSS, acelerando significativamente liberación DOX desde HMSS–N=N–CS/DOX. Para evaluar cuantitativamente diferencias captación celular HMSS–N=N–CS/DOX y HMSS–N=N–CS/DOX incubado con enzimas extraídas, se usó FCM. Como muestra Fig. 7b, intensidad fluorescencia media (MFI) grupo HMSS–N=N–CS/DOX fue 124,7, más débil que grupo DOX libre, con valor p < 0,001. Emocionantemente, tras preincubar HMSS–N=N–CS/DOX con mezcla enzimática colónica 1 h, MFI aumentó marcadamente a 357 e incluso superó grupo DOX libre debido a liberación acelerada DOX desde HMSS–N=N–CS/DOX tras rotura enlaces azo. Todos resultados indicaron que enlaces azo en HMSS–N=N–CS/DOX pueden ser escindidos en presencia enzimas colónicas, llevando a desprendimiento CS de superficie HMSS y acelerando liberación DOX desde HMSS.

Evaluación in vitro viabilidad celular

Para probar efecto liberación sensible a enzimas HMSS–N=N–CS/DOX en condiciones colónicas simuladas, se realizó ensayo viabilidad celular in vitro usando células Caco-2. El fármaco anticancerígeno clásico DOX se usó en ensayo viabilidad. Previo a este ensayo, diferentes concentraciones HMSS y HMSS–N=N–CS vacíos se emplearon para determinar biocompatibilidad nanoplataforma hacia células Caco-2 y NIH-3T3 normales (fibroblastos embrionarios ratón) a varias concentraciones 10–250 μg/mL por ensayo MTT. Como muestra Fig. 8a, b, HMSS y HMSS–N=N–CS a diferentes concentraciones mostraron citotoxicidad despreciable tras incubación con células Caco-2 o NIH-3T3, viabilidad células Caco-2 87,9 % y 88,3 % a alta concentración 100 μg/mL, respectivamente, lo cual es suficientemente alto para aplicaciones clínicas dada alta carga fármaco HMSS. Además, células NIH-3T3 incubadas con HMSS y HMSS–N=N–CS 48 h tuvieron alta viabilidad (>80 %) a concentración relativamente alta 100 μg/mL. Resultados indicaron que HMSS y HMSS–N=N–CS son citocompatibles y pueden emplearse para administración oral.

El efecto nanotransportador cargado DOX HMSS–N=N–CS/DOX sobre viabilidad células Caco-2 se muestra en Fig. 8c. DOX libre mostró citotoxicidad fuerte y dependiente concentración hacia células 4T1, atribuido a que DOX libre cargado positivamente atraviesa fácilmente membranas celulares 4T1. Valor IC₅₀ grupo DOX libre se determinó 10,18 μg/mL usando software SPSS Statistics. Comparado con DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX exhibió mayor viabilidad celular a misma concentración DOX por liberación incompleta DOX desde HMSS–N=N–CS inducida por fuertes interacciones electrostáticas entre HMSS cargado negativamente y DOX cargado positivamente. Valor IC₅₀ grupo HMSS–N=N–CS/DOX fue 32,22 μg/mL, mucho mayor que DOX libre. Sin embargo, HMSS–N=N–CS/DOX preincubado con enzimas colónicas concentradas mostró citotoxicidad dependiente concentración obvia, y valor IC₅₀ calculado 9,41 μg/mL, mucho menor que HMSS–N=N–CS/DOX. Esto se atribuye a enzimas colónicas degradan enlaces azo en HMSS–N=N–CS, llevando a desprendimiento CS injertado de superficie HMSS, causando liberación rápida DOX desde transportadores HMSS.

Estudios de toxicidad

Los riesgos uso HMSS–N=N–CS son factor vital considerar antes aplicaciones clínicas futuras. Tinción H&E de irritación mucosa gastrointestinal es esencial para evaluar bioseguridad in vivo sistema administración para administración oral (Fig. 9a). Comparado con grupo suero salino, tanto grupos HMSS como HMSS–N=N–CS no mostraron cambios histopatológicos marcados ni hiperemia tras administración oral una semana con dosis 100 mg/kg. No se observó muerte ni comportamientos inusuales ratas durante experimento. Disminución peso corporal es índice importante y simple para toxicidad sistémica in vivo. Como muestra Fig. 9b, pesos corporales ratones en grupos HMSS y HMSS–N=N–CS aumentaron ligeramente y fueron similares a grupo suero salino. Resultados indicaron que HMSS y HMSS–N=N–CS mostraron buena biocompatibilidad como transportadores fármacos para administración oral.

Conclusiones

En resumen, CS biodegradable se unió mediante enlaces azo para tapar aberturas HMSS y lograr administración fármacos específica colon sensible a enzimas. DOX se cargó en cavidad hueca y mesoporos HMSS en estado no cristalino con alta eficiencia carga 35,2 %. Resultados estabilidad y adsorción BSA ilustraron que compuertas CS aumentan biocompatibilidad y estabilidad HMSS. Resultados liberación in vitro probaron que HMSS–N=N–CS/DOX exhibió comportamiento liberación fármaco sensible a enzimas en presencia enzimas colónicas. Resultados captación CLSM y FCM indicaron que captación celular DOX aumentó obviamente tras incubar HMSS–N=N–CS/DOX con mezcla enzimática colónica. Resultados viabilidad celular indicaron que HMSS–N=N–CS/DOX incubado con enzimas colónicas mostró mayor citotoxicidad, y valor IC₅₀ disminuyó obviamente de 32,22 μg/mL para HMSS–N=N–CS/DOX a 9,41 μg/mL tras incubación.