Nanoplataformas de sílice mesoporosa hueca y sensible a enzimas cubiertas con quitosano para la administración de fármacos específicos al colon

Resumen

Se desarrolló un sistema de liberación específico de colon sensible a enzimas basado en esferas huecas de sílice mesoporosa (HMSS) a las que se unió quitosano (CS) biodegradable mediante enlaces azo escindibles (HMSS-N =N-CS). La doxorrubicina (DOX) se encapsuló en un estado no cristalino en la cavidad hueca y los mesoporos de HMSS con una alta cantidad de carga del 35,2%. La liberación de fármacos in vitro demostró que HMSS – N =N – CS / DOX realizaba una liberación de fármacos que respondía a las enzimas. El CS injertado podría aumentar la biocompatibilidad y estabilidad y reducir la adsorción de proteínas en HMSS. Los resultados de irritación de la mucosa gastrointestinal y citotoxicidad celular indicaron la buena biocompatibilidad de HMSS y HMSS – N =N – CS. Los resultados de la captación celular indicaron que la captación de DOX aumentó obviamente después de que HMSS-N =N-CS / DOX se preincubó con una mezcla de enzimas colónicas. HMSS – N =N – CS / DOX incubado con enzimas del colon mostró una mayor citotoxicidad y su IC ₅₀ el valor fue tres veces menor que el del grupo HMSS – N =N – CS / DOX sin enzimas de colon. El presente trabajo sienta las bases para la investigación posterior sobre los portadores mesoporosos para la administración oral de fármacos específicos del colon.

Introducción

Recientemente, los sistemas de administración de fármacos que responden a estímulos (DDS) han atraído una gran atención por la carga eficiente y la liberación selectiva de fármacos en los tejidos enfermos objetivo [1]. Los sistemas diseñados que responden a los estímulos pueden administrarse a sitios enfermos y realizar la liberación de fármacos a demanda para mejorar los efectos terapéuticos y obstaculizar los efectos secundarios inducidos por fugas prematuras. Todos los estímulos internos y externos, como el potencial redox [2], el pH [1], las enzimas [3] y la temperatura y la luz [4, 5], se han utilizado para diseñar DDS sensibles a estímulos. Entre estos estímulos, las enzimas, como estímulos internos, han ganado una gran atención debido a sus distintas concentraciones en diferentes tejidos [6].

Durante las últimas dos décadas, las esferas de sílice mesoporosa (MSS) con mesoporos que varían de 2 a 50 nm de tamaño se han establecido como portadores de fármacos que responden a estímulos [7, 8], ya que los MSS tienen un volumen de poro notablemente grande y una gran área de superficie para altas capacidad de carga del fármaco, estructura de poros bien organizada, superficie fácilmente funcional y buena biocompatibilidad [9]. Además, las nanopartículas de esferas huecas de sílice mesoporosa (HMSS) con una estructura de capa mesoporosa y una cavidad hueca son superiores a los MSS convencionales porque la estructura hueca puede contener de manera eficiente más fármacos con una mayor capacidad de almacenamiento que los portadores de MSS [10, 11]. Se desarrollaron todo tipo de nanoportadores sensibles a estímulos basados en MSS para alojar moléculas de fármacos utilizando varios guardianes, como polímeros [12], nanopartículas inorgánicas [13], dendrímeros, biomacromoléculas [14], compuestos macrocíclicos, péptidos [15] y lípidos [ dieciséis]. Aunque numerosos DDS basados en MSS con limitación funcional pueden realizar la liberación en respuesta a diversos estímulos externos o internos, pocos de ellos se han utilizado en la administración de fármacos dirigidos específicos al colon.

Es bien sabido que la administración oral de fármacos es la forma favorita y sencilla de administrar fármacos. La administración de fármacos dirigida al colon es muy fascinante para el tratamiento de enfermedades del colon, incluida la enfermedad de Crohn, el cáncer colorrectal y la colitis ulcerosa. Sin embargo, la administración de fármacos específicos al colon puede encontrar varios problemas, entre ellos, que haya menos contenido de agua y relativamente menos superficie para la adsorción oral allí que en otros sitios del tracto gastrointestinal (GI) [17,18,19]. Además, los DDS orales también se encuentran con un ambiente ácido fuerte en el estómago, lo que podría acelerar la degradación de los fármacos cargados en el tracto gastrointestinal, eliminando así la capacidad de realizar la administración dirigida al colon [19]. Por esta razón, se han diseñado varios DDS dependientes del pH para realizar la liberación del fármaco desencadenada por el pH a valores de pH casi neutros (6-7) del tracto gastrointestinal, resistiendo las condiciones altamente ácidas en la región del estómago [20,21,22 , 23]. Sólo existe una ligera diferencia en la acidez entre las regiones intestinal (pH 6,8) y colónica (pH 7,4); por lo tanto, estos DDS sensibles al pH tienen dificultades para realizar la liberación específica del colon.

El quitosano (CS), un polisacárido catiónico y biodegradable presente de forma natural, está constituido por unidades de glucosamina y N-acetil-D-glucosamina enlazadas con β- (1-4) [24]. El CS ha recibido una gran atención en la medicina biológica debido a sus fascinantes propiedades, que incluyen biodegradabilidad, biocompatibilidad, mucoadhesividad y actividad antibacteriana [25,26,27,28,29]. En comparación con los polímeros, polielectrolitos y supramoléculas sintetizados mediante procesos complicados, el CS es relativamente barato y fácilmente disponible mediante la desacetilación exhaustiva de la quitina [30, 31, 32]. Además, se ha informado de que el CS puede abrir uniones estrechas entre las células, aumentando así la absorción del fármaco [33]. Por lo tanto, se seleccionó el polímero CS como agente de remate debido a su buena biocompatibilidad y tamaño apropiado para cubrir los mesoporos del HMSS para bloquear la liberación del fármaco.

En nuestro trabajo, se diseñó por primera vez un DDS sensible a enzimas específico de colon basado en un material HMSS (HMSS-N =N-CS) como se muestra en el Esquema 1. En este sistema, los portadores del HMSS se prepararon mediante un método selectivo estrategia de grabado. El polímero CS se unió a la superficie de HMSS mediante enlaces azo para actuar como un guardián para bloquear las aberturas de HMSS. Los enlaces azo entre HMSS y CS pueden ser escindidos por enzimas en los sitios del colon [34, 35], lo que resulta en la separación de CS de las aberturas de HMSS. Se utilizó DOX como fármaco modelo que se incrustaría en la cavidad del HMSS, y se llevaron a cabo experimentos de liberación de fármacos in vitro para evaluar la liberación que responde a enzimas en presencia de enzimas colónicas. Se utilizaron microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y citometría de flujo (FCM) para investigar la captación celular por las células Caco-2. Finalmente, se midió la citotoxicidad de HMSS – N =N – CS / DOX hacia las células Caco-2.

Ilustración esquemática de a proceso de preparación de HMSS – N =N – CS y b la carga de fármaco y la liberación de HMSS – N =N – CS / DOX en respuesta a la enzima en respuesta a la enzima del colon

Materiales y métodos

Materiales

Tetraetoxisilano (TEOS); Clorhidrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilcarbodiimida (EDC); quitosano (DAC ≥ 95%); bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB); 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES); Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT); ácido azobenceno-3,3'-dicarboxílico; bromuro de potasio (pureza espectral, ≥ 99,5%); Se adquirieron N-hidroxisuccinimida (NHS) y DOX de Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). El ácido azobenceno-3,3'-dicarboxílico fue suministrado por Inno-chem Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Los medios de cultivo celular DMEM, penicilina-estreptomicina y suero fetal bovino (FBS) fueron suministrados por GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, EE.UU.). Todos los reactivos analíticos no se purificaron más antes de su uso.

Preparación de HMSS – N =N – CS

Preparación de HMSS – NH ₂

Las nanopartículas de HMSS se prepararon basándose en el trabajo publicado utilizando un método de grabado selectivo [36]. Las esferas sólidas de sílice se sintetizaron en primer lugar mediante un método Stober modificado. Brevemente, se vertieron 6 ml de TEOS en la mezcla de 10 ml de agua desionizada, 74 ml de etanol y 3 ml de NH ₃ concentrado. · H ₂ O. Posteriormente, la mezcla se agitó durante 60 min para obtener suspensiones de sílice coloidal a temperatura ambiente. Las esferas sólidas se centrifugaron, lavaron y secaron para su uso posterior. Luego, la capa de sílice mesoporosa se cubrió con esferas sólidas de sílice. Se dispersaron 300 miligramos de sílice sólida en 50 ml de agua desionizada mediante ultrasonidos durante 45 min. Y las suspensiones de sílice se vertieron en una mezcla de 60 ml de etanol, 450 mg de CTAB, 90 ml de agua y 1,7 ml de NH ₃ · H ₂ O. Después de agitar la mezcla durante 60 min, se añadió TEOS (0,75 ml). Posteriormente, las nanopartículas se centrifugaron después de agitar durante 6 h para recolectar muestras y luego se redispersaron en 40 mL de agua. Aproximadamente 1,2 g de Na ₂ CO ₃ se añadió a la suspensión de agua con agitación vigorosa. Después de que la mezcla se mantuvo a 55 ° C durante 12 h, se recogieron los productos de nanopartículas de HMSS y se lavaron con etanol anhidro. El método posterior al injerto con una proporción de HMSS y APTES de 4:1 (m / v) para preparar HMSS – NH ₂ a 80 ° C bajo N ₂ condición durante 8 h, a CTAB se eliminó por reflujo [3].

Preparación de HMSS – N =N – COOH

Se añadió ácido azobenceno-3,3'-dicarboxílico (50 mg) en PBS a pH 5,8. A continuación, se añadieron (5 mg / ml), EDC y (3 mg / ml) NHS para activar el ácido azobenceno-3,3'-dicarboxílico a 30ºC durante 1 h. Y 10 ml de PBS que contienen 15 mg / ml de HMSS – NH ₂ Se añadió y la mezcla se agitó durante 24 h. Y el HMSS – N =N – COOH resultante se separó por centrifugación y se lavó con etanol.

Preparación de HMSS – N =N – CS

Se añadieron 0,15 g de CS y 0,5 ml de ácido acético en 50 ml de agua para preparar la solución de CS. Y se dispersaron 100 mg de HMSS – N =N – COOH en 25 mL de PBS pH 5.0 y se activaron por EDC y NHS durante 0.5 h. Luego, se vertió solución CS (10 ml) en la suspensión con agitación continua durante 1 día. Finalmente, el HMSS-N =N-CS sintetizado se centrifugó y se lavó para recolectar las muestras.

Extracción de la mezcla de enzimas colónicas de la microflora

La microflora colónica se recogió de acuerdo con un trabajo publicado [37]. Luego, se inoculó el cultivo para obtener la mezcla de enzimas secretadas por la microflora colónica a 37 ° C. El medio colónico simulado que contiene la mezcla de enzimas se filtró a través de un filtro de 0,22 µm para eliminar todos los restos celulares del fluido de cultivo. Posteriormente, el filtrado se liofilizó para obtener la mezcla de enzimas en forma de polvo, que se utilizó en el estudio posterior.

Proceso de carga de fármacos y liberación en respuesta a enzimas

Se disolvieron veinticinco miligramos de DOX en 5 ml de una solución de HCl de pH 3,5. Y se agregaron 100 mg de HMSS – N =N – CS en la solución de DOX y se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. Posteriormente, se utilizó una solución 0,2 M de NaOH para ajustar el pH de la mezcla a 7,0 y la suspensión se agitó durante otras 12 h. Luego, el HMSS – N =N – CS cargado con DOX (denominado HMSS – N =N – CS / DOX) se centrifugó y se lavó para eliminar el DOX adsorbido en la superficie de HMSS – N =N – CS. El sobrenadante se recogió en cada paso para medir la eficiencia de carga de DOX (LE) a 480 nm mediante espectrofotometría UV-Vis. La masa total de DOX cargada en HMSS – N =N – CS se calculó restando la DOX descargada después de los procesos de carga de fármaco de la masa inicial de DOX agregada. El HMSS / DOX se preparó como control utilizando HMSS como portador inicial. El LE de DOX se calculó de acuerdo con la ecuación:

$$ \ mathrm {LE} \ \ left (\% \ right) =\ frac {m_A- {m} _B} {m_A- {m} _B + {m} _C} \ times 100 $$

En el que m _A fue la masa añadida de DOX, m _B era la masa de DOX en el sobrenadante y m _C fue la masa total de HMSS – N =N – CS.

La liberación in vitro de DOX sensible a enzimas de HMSS – N =N – CS / DOX se evaluó de la siguiente manera. Se dispersaron dos miligramos de nanopartículas de HMSS – N =N – CS / DOX y HMSS / DOX en PBS de pH 7,4 agitando a 125 rpm con diferentes concentraciones de mezcla de enzimas colónicas (0 mg / mL, 0,3 mg / mL y 1 mg / mL) . A intervalos de tiempo especificados, se extrajo 1 ml de medio de liberación para medir la absorbancia. La liberación de DOX se midió a 480 nm. Se utilizó HMSS / DOX como control.

Adsorción de BSA

La cantidad de adsorción de BSA se evaluó sobre la base de los trabajos publicados [38, 39]. Se añadió BSA en PBS a pH 7,4 (0,5 mg / ml). Cinco miligramos de HMSS y HMSS – NH ₂ y HMSS-N =N-CS se añadieron a 2,5 ml de PBS (pH 7,4). Y se suministró la solución de BSA de igual volumen y la suspensión se colocó en un agitador a 100 rpm. Después de 6 h, se utilizó centrifugación para recoger la solución superior. Por último, la concentración de BSA se midió a 595 nm después de teñirse con una solución de azul brillante de Coomassie.

Caracterización

La estructura de la red mesoporosa y la morfología de las nanopartículas del HMSS se evaluaron mediante imágenes TEM (EM-208S, CSIS, EE. UU.). El área de superficie y la distribución del tamaño de los poros de las nanopartículas se caracterizaron usando un analizador de análisis de adsorción de nitrógeno (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). Los potenciales ξ y los tamaños de partículas se caracterizaron en un Nanosizador Nano-z90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido). El análisis de TGA se midió en un equipo TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Japón) con una velocidad de calentamiento de 10 ° C / min bajo un flujo de nitrógeno. Los espectros espectrofotométricos infrarrojos de transformada de Fourier (FT-IR) se midieron usando un espectrómetro FT-IR (Bruker Tensor27, Suiza). El rango se llevó a cabo de 400 a 4000 cm ⁻¹ utilizando la técnica de pellets de KBr. Power XRD se realizó en un difractómetro de rayos X Siemens D5005 (Karlsruhe, Alemania) con radiación Cu-Kα ( λ =1,5418 Å).

Experimento de cultivo celular y absorción celular

Las células Caco-2 se cultivaron en un medio suplementado con FBS al 10%, aminoácidos no esenciales al 1%, ácido pirúvico sódico al 1% (v / v) y estreptomicina al 1%. Se cultivaron células NIH-3T3 en DMEM con estreptomicina al 1% y FBS al 10%. La captación de las células Caco-2 de los nanoportadores se caracterizó utilizando FCM y CLSM. Se sembraron células Caco-2 en placas de 24 pocillos. Después de cultivar durante la noche, se agregaron DOX libre, HMSS – N =N – CS / DOX y HMSS – N =N – CS / DOX preincubados con nanopartículas de enzima colónica (igual a la concentración de 5 μg / ml de DOX) a los pocillos correspondientes . Después de una incubación continuada durante 2 h, se eliminó el medio celular y se lavó minuciosamente con PBS. Luego, las células se fijaron con formaldehído al 4% y se tiñeron con Hoechst 33258 para observación CLSM. Se utilizó FCM para obtener una evaluación cuantitativa de la captación celular. Se sembraron células Caco-2 en placas de 6 pocillos y se incubaron adicionalmente durante 24 h. Después de lavar con PBS, las células Caco-2 se incubaron con DOX libre, HMSS – N =N – CS / DOX y HMSS – N =N – CS / DOX preincubados con nanopartículas de enzima colónica (igual a la concentración de 5 μg / mL DOX) en DMEM sin suero durante 2 h. Luego, las células Caco-2 se enjuagaron con PBS frío, se tripsinizaron y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS. La fluorescencia de DOX en las células se midió con un citómetro de flujo FACS Canto (Becton, Dickinson, EE. UU.).

Ensayo de proliferación celular in vitro

La citotoxicidad de HMSS y HMSS – N =N – CS portadores en blanco hacia las células NIH-3T3 y Caco – 2 se testificó mediante el ensayo MTT [40, 41]. En resumen, las células Caco-2 y las células NIH-3T3 se sembraron por separado en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. El medio celular antiguo fue sustituido por un medio libre de suero que contenía diferentes concentraciones de nanopartículas. Después de la incubación durante 2 días, 50 μL de solución MTT (2 mg mL ^–1 ) se añadió y se incubó durante 4 h para medir las células vivas. Luego, se eliminó la solución de MTT y se agregaron 150 μL de DMSO para disolver el formazán. Posteriormente, se midió la absorbancia en un lector de microplacas (Tecan, Männedorf, Suiza) a 570 nm. La citotoxicidad de DOX libre, HMSS – N =N – CS / DOX y HMSS – N =N – CS / DOX preincubados con mezclas de enzimas extraídas de la microflora colónica se midió utilizando células Caco-2 con las correspondientes concentraciones de DOX de (0,1, 1, 5, 10 y 20 μg / mL). El tiempo de incubación fue de 48 h, y los otros procesos experimentales fueron los mismos que los descritos anteriormente.

Estudios de toxicidad

Las pruebas de irritación de la mucosa gastrointestinal son vitales para la evaluación de la bioseguridad in vivo de la administración oral de fármacos. Se dividieron aleatoriamente ratas macho Sprague-Dawley (180 ± 10 g) en tres grupos (tres ratas para cada grupo). A las ratas se les administraron nanopartículas de solución salina, HMSS y HMSS – N =N – CS con una dosis de 100 mg / kg por día. Después de 7 días, se sacrificaron todas las ratas y los tejidos se recogieron y examinaron mediante examen histopatológico (H&E). Para evaluar la bioseguridad de las nanopartículas de HMSS y HMSS – N =N – CS, se registraron los pesos corporales de los ratones BALB / c (18–20 g) después de la administración oral a una dosis de 100 mg / kg cada dos días. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las pautas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Qiqihar y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Qiqihar.

Estadísticas

Los datos estadísticos se analizaron con un software SPSS utilizando t de Student de dos colas -prueba. Las barras de error presentadas en este estudio son DE. A p <0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de HMSS – N =N – CS

Los HMSS se prepararon sobre la base de trabajos anteriores con cambios menores [36]. Primero, SiO ₂ sólido Se prepararon nanoesferas y se revistió una capa mesoporosa sobre la superficie de las nanoesferas de sílice sólida que contenían la plantilla de CTAB. Entonces, Na ₂ CO ₃ se utilizó para grabar selectivamente el sólido SiO ₂ nanoesferas mientras que la capa mesoporosa estaba protegida por la plantilla CTAB. En la Fig. 1a se describe la preparación de HMSS – N =N – CS con CS adjunto como "guardián" mediante un enlace azo. Primero, las superficies de las nanopartículas de HMSS se modificaron con APTES como reactivo de acoplamiento de alquilo para convertirse en HMSS con funcionalidad amino (HMSS – NH ₂ ) por un método de posmodificación. Posteriormente, se preparó HMSS – N =N – COOH mediante una reacción de amidación entre los grupos amino de HMSS – NH ₂ y los grupos carboxilo del ácido azobenceno-3,3'-dicarboxílico. Luego, CS se modificó covalentemente en la superficie de nanopartículas de HMSS mediante una reacción de amidación entre los grupos carboxilo de HMSS – N =N – COOH y los grupos amino en CS.

TEM de a HMSS y b HMSS – N =N – CS

Como se muestra en la imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la Fig. 1a, el diámetro medio del HMSS era de 280 nm, y los HMSS tenían una estructura hueca uniforme y una capa mesoporosa muy ordenada. El espesor medio de la capa mesoporosa fue de aproximadamente 90 nm. En comparación con la superficie lisa del HMSS, la superficie del polímero injertado HMSS – N =N – CS (Fig. 1b) era rugosa, lo que indica que el CS cubría el portador del HMSS.

Las áreas de superficie y la distribución de los poros de los materiales mesoporosos jugaron un papel crucial en la carga y entrega de las moléculas del huésped para una liberación controlada. Las isotermas y las curvas de distribución del tamaño de los poros se midieron mediante N ₂ análisis de adsorción y desorción (Fig. 2). Parámetros detallados (el área de superficie Brunauer-Emmett-Teller (BET) ( S _APUESTA ), volumen total de poros ( V _P ) y la distribución del tamaño de los poros ( D _P )) se muestran en la Tabla 1. Las S _APUESTA y V _P de HMSS puro fueron 810,7 m ² / gy 0,969 cm ³ / g, respectivamente, y la D _P fue de aproximadamente 3,8 nm. La D _P de HMSS – NH ₂ fue casi el mismo que el del HMSS después de la aminación, lo que indica que los mesoporos no se bloquearon después de la funcionalización amino. La S _APUESTA y V _P de HMSS-N =N-CS disminuyeron notablemente después de la modificación por el compuesto azoico y el revestimiento de CS, lo que indica que el CS había revestido la superficie del HMSS [1].

un Las isotermas de adsorción / desorción de nitrógeno y b distribuciones de tamaño de poro de HMSS, HMSS – NH ₂ y HMSS – N =N – CS

El éxito del injerto de HMSS – N =N – CS se verificó mediante varios métodos. El ξ potencial de HMSS – NH ₂ sufrió un gran cambio después de la funcionalización, que varió de - 27,9 a + 31,4 mV, como se muestra en la Fig. 3a, que se atribuyó a la adición de los grupos amina a la superficie del HMSS. Después de HMSS – NH ₂ reaccionó con ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico para formar HMSS-N =N-COOH, el potencial ξ disminuyó aún más a -2,0 mV debido a los grupos carboxilo en la superficie del HMSS. Después de que el polímero CS se injertó más en la superficie del HMSS para formar HMSS – N =N – CS, el potencial ξ volvió a + 32,4 mV. El resultado se atribuyó al recubrimiento de CS cargado positivamente con abundantes aminoácidos en la superficie del HMSS [1]. Curvas de análisis termogravimétrico (TGA) de HMSS, HMSS – NH ₂ , Las especies HMSS – N =N – COOH y HMSS – N =N – CS se muestran en la Fig. 3b. En comparación con HMSS – N =N – COOH, HMSS – N =N – CS perdió un peso adicional de aproximadamente 19%, que se debió a la eliminación de las cadenas de CS. El injerto de enlaces azo en la superficie de HMSS también fue confirmado por un cambio de color durante la preparación de HMSS-N =N-COOH, como se muestra en el recuadro de la Fig. 3b. El reactivo HMSS – NH ₂ es blanco, mientras que el producto HMSS – N =N – COOH era de color marrón amarillento después de que el ácido azobenceno-3,3′-dicarboxílico reaccionara con los grupos amino de HMSS. El diámetro hidrodinámico ( D _H ) y valores del índice de polidispersidad (PDI) de HMSS, HMSS – NH ₂ , y HMSS – N =N – CS se determinaron en agua destilada, como se muestra en la Fig. 3c. El HMSS tenía un diámetro de 309 nm y un PDI de 0,190. Después de la adición de grupos amina en las superficies de HMSS para formar HMSS – NH ₂ , la D _H aumentado a 324 nm. El diámetro de HMSS – N =N – CS era de 342 nm, que era más grande que el de HMSS – NH ₂ debido a las cadenas CS injertadas. El PDI de HMSS – N =N – CS (0,177) fue menor que el de HMSS – NH ₂ , lo que indica que los tamaños de partícula promedio se habían vuelto aún mayores después del injerto de CS. En comparación con los diámetros obtenidos de TEM, los diámetros de HMSS y HMSS – N =N – CS medidos por DLS fueron mayores. La D _H de las nanopartículas se midió en un ambiente acuático con una capa de hidratación, mientras que el tamaño de las nanopartículas proporcionadas por TEM se obtuvo a partir de nanopartículas secas [3]. Espectros FT-IR de HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH, HMSS – N =N – CS y CS se muestran en la Fig. 4d. En comparación con los picos de HMSN – NH ₂ , un aumento en los picos de adsorción a 2853 y 2925 cm ⁻¹ se atribuyó a la vibración de - CH ₂ en el injerto de enlaces azo carboxi-terminales. Después de que se agregó CS a la superficie de HMSS – N =N – COOH, hubo aumentos en los picos de adsorción a 1660 cm ⁻¹ y 3435 cm ⁻¹ , que se atribuyeron a υ _{(C =O)} en la banda de amida y la vibración de N – H en el CS. Todos los resultados demostraron la preparación exitosa de HMSS – N =N – CS.

un Los potenciales ξ correspondientes de HMSS, HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH y HMSS – N =N – CS; b Las curvas TGA de HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH y HMSS – N =N – CS (el recuadro:la fotografía de ( a ) HMSS – N =N – COOH y ( b ) HMSS – NH ₂ ); c Distribución de tamaño de HMSS, HMSS – NH ₂ y HMSS – N =N – CS recuadro:los valores de PDI correspondientes de las nanopartículas; y d Espectros FT-IR de HMSS – NH ₂ , HMSS – N =N – COOH, HMSS – N =N – CS y CS

Patrones XRD de DOX, HMSS – N =N – CS, HMSS – N =N – CS / DOX y PM

Estado del fármaco y eficiencia de carga

Se eligió DOX para investigar los comportamientos de carga y liberación de HMSS – N =N – CS. Cuando el valor de pH de la suspensión de nanopartículas HMSS-N =N-CS se ajustó a pH 3,5, el biopolímero CS se cargó positivamente (el pK _a de CS fue 6,3) debido a los grupos amino protonados en el ambiente ácido [24]. El polímero de CS se cargó positivamente y se hinchó, lo que provocó la apertura de mesoporos de HMSS atribuida a la interacción repulsiva entre las cargas de CS. Por lo tanto, DOX obtuvo acceso a los mesoporos de HMSS – N =N – CS por difusión. Sin embargo, después de que la mezcla cargada con fármaco se ajustó a 7,4, las cadenas de CS se desprotonaron y colapsaron para dificultar la liberación prematura de DOX.

El LE de HMSS – N =N – CS / DOX fue del 35,2%, mucho mayor que el de otros sistemas de liberación de sílice mesoporosa cargados con DOX [3, 16]. El elevado LE de DOX en los nanoportadores del HMSS se atribuyó a la cavidad hueca, la gran superficie y la red mesoporosa, que podrían utilizarse como reservorio de fármacos. El estado físico de DOX en HMSS – N =N – CS / DOX se evaluó mediante difracción de rayos X de potencia (XRD). Como se muestra en los perfiles XRD (Fig. 4), la DOX en bruto exhibió picos de difracción cristalina del fármaco característicos e intensos. La mezcla física (PM) de HMSS – N =N – CS y DOX también mostró picos de difracción cristalinos obvios. Sin embargo, el HMSS-N =N-CS / DOX no mostró picos cristalinos distintos, lo que demostró que el estado físico de DOX en HMSS-N =N-CS / DOX no era cristalino debido a las limitaciones de la estructura mesoporosa del HMSS.

Liberación de respuesta enzimática in vitro en un entorno colónico simulado

Para investigar la liberación enzimática de HMSS – N =N – CS, se añadieron nanopartículas de HMSS – N =N – CS / DOX y HMSS / DOX a PBS de pH 7,4 con diferentes concentraciones de mezcla de enzimas colónicas. Como se muestra en la Fig. 5a, HMSS-N =N-CS / DOX exhibió la liberación lenta de DOX en PBS a pH 7,4, y el porcentaje de liberación acumulada fue solo aproximadamente del 10% en 24 h, lo que indica una buena capacidad de limitación del CS polímeros y enlaces azo. Como era de esperar, en el caso de la enzima diluida en PBS a pH 7,4, la liberación acumulada de DOX mejoró a más del 20% en el mismo período. Además, la cantidad liberada de DOX aumentó drásticamente hasta casi un 40% en presencia de enzima concentrada. En comparación con la liberación de respuesta enzimática de HMSS – N =N – CS / DOX, la liberación de DOX de HMSS / DOX tuvo tendencias similares en presencia o ausencia de enzima concentrada. El porcentaje de liberación de fármaco relativamente bajo se debió a la interacción electrostática entre el HMSS cargado negativamente y el DOX cargado positivamente [42]. Los resultados anteriores demostraron que la liberación de DOX de HMSS – N =N – CS / DOX fue marcadamente acelerada por enzimas extraídas de la microflora en las regiones colónicas. El mecanismo de liberación que responde a la enzima podría ser que los enlaces azo en HMSS-N =N-CS sean degradados por la enzima, provocando el desprendimiento de CS de la superficie de HMSS y la liberación rápida de HMSS. Se ha informado que los enlaces azo son escindidos por enzimas secretadas por la microflora del colon [34, 35].

un Perfiles de liberación acumulada de HMSS / DOX y HMSS – N =N – CS / DOX en PBS de pH 7,4 en presencia de una mezcla de enzimas colónicas concentradas y diluidas; y b Comportamientos de liberación in vitro sensibles al pH de DOX de HMSS – N =N – CS en los medios de liberación de diferentes valores de pH

Además, para evaluar más a fondo la liberación de respuesta enzimática de HMSS-N =N-CS / DOX en el entorno mimético de GIT, las nanoplataformas de HMSS-N =N-CS / DOX se dispersaron inicialmente en SGF durante 2 hy luego se dispersaron más en SIF durante 6 h, y finalmente, los vehículos se añadieron a pH 7,4 de PBS que contenía 1 mg / ml de enzima extraída. Como se muestra en la Fig. 5b, en jugo gástrico simulado, la liberación de DOX fue relativamente rápida y la cantidad acumulada alcanzó el 15% en 2 h. La liberación relativamente rápida se debió a la interacción más débil entre HMSS – N =N – CS y DOX en condiciones ácidas que en condiciones neutrales [1]. Luego, la liberación de DOX se ralentizó en SIF durante 2-8 h. Sin embargo, después de que el HMSS-N =N-CS / DOX se incubó con las enzimas extraídas en PBS de pH 7,4, la liberación de DOX continuó aumentando notablemente y la cantidad de liberación acumulada alcanzó más del 50% en 24 h. La liberación incompleta de DOX de HMSS – N =N – CS / DOX se debió a la fuerte interacción entre el DOX cargado positivamente y el HMSS cargado negativamente.

La adsorción de proteínas y la estabilidad de HMSS – N =N – CS

Para la administración oral, las propiedades superficiales de los nanoportadores afectarán inevitablemente los comportamientos de liberación de fármacos y la bioadsorción [43]. Se utilizó un ensayo de adsorción de proteínas en la superficie para evaluar el efecto del CS injertado en la superficie del HMSS. Como se muestra en la Fig. 6a, los nanoportadores de HMSS desnudos tenían una adsorción de BSA espectacular de hasta el 16,5%, que se atribuyó a la gran superficie y la cavidad hueca del HMSS, la fuerte capacidad de adsorción y las interacciones no específicas entre los grupos silanol de HMSS y BSA [ 38, 39]. Además, HMSS – NH ₂ de manera similar, tenía una cantidad de BSA adsorbida relativamente alta del 10,2%. Sin embargo, el porcentaje de BSA adsorbido en la superficie disminuyó notablemente a 2.5% después de que se agregó el polímero CS como cobertura, disminuyendo así dramáticamente el efecto sobre el comportamiento in vivo de HMSS-N =N-CS. Para seguir observando la estabilidad de las muestras de HMSS-N =N-CS y HMSS, se agregaron 20 mg de HMSS-N =N-CS y HMSS a PBS de pH 7,4 y agua desionizada. As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

un BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH₂ and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0,05). b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

un CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. El IC ₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. El IC ₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

un Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)

Conclusiones

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC₅₀ value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.