Nanoesferas de Sílice Huecas Encapsulando Peroxidasa de Rábano Picante para Detección Intracelular de ROS

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son fundamentales en la señalización celular, pero su sobreproducción impulsa daño oxidativo. La cuantificación precisa de ROS en células vivas es esencial para biología básica y diagnóstico clínico. Las sondas fluorogénicas tradicionales acopladas con peroxidasa de rábano picante (HRP) sufren de la pobre permeabilidad de membrana de HRP. Presentamos nanoesferas de sílice huecas encapsulando HRP (HRP@HSNs) fabricadas mediante un enfoque sol-gel templado por microemulsión. Estos nanorreactores retienen actividad enzimática robusta, cruzan fácilmente membranas celulares y exhiben excelente biocompatibilidad. El acoplamiento de HRP@HSNs con la sonda dihidrorrodamina 123 (DHR123) permitió detección cualitativa y semicuantitativa de peróxido de hidrógeno intracelular (H₂O₂) en macrófagos RAW 264.7 activados. La plataforma puede funcionalizarse fácilmente con ligandos de direccionamiento, ofreciendo capacidades de imagen ROS específicas de orgánulos o tipos celulares.

Antecedentes

Los ROS —incluyendo superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo, oxígeno singlete y peroxinitrito— se generan continuamente durante el metabolismo aeróbico, principalmente de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. Las defensas antioxidantes, tanto enzimáticas (ej. superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasas) como no enzimáticas (vitaminas A, C, E, urato, bilirrubina), normalmente neutralizan estas especies. El desequilibrio conduce a estrés oxidativo, dañando ADN, lípidos, proteínas y contribuyendo a enfermedades como diabetes, cáncer, trastornos cardiovasculares y neurodegenerativos (Alzheimer, Parkinson) [1–5].

Avances recientes en microscopía fluorescente han permitido imagen no invasiva de ROS a nivel de célula única, principalmente mediante sondas ratiométricas o basadas en intensidad que se vuelven fluorescentes tras oxidación de un precursor no fluorescente [6–8]. La especificidad es crítica; las sondas basadas en boronato, por ejemplo, atacan H₂O₂ vía oxidación bioortogonal [9]. Sin embargo, muchas sondas son inestables in vivo, pobremente penetrantes en tejidos y rápidamente eliminadas renalmente [12–14]. Estrategias como enlaces estabilizadores, sensores genéticamente codificados, reporteros bioluminiscentes o trazadores PET se han explorado [15–18]. Las nanoformulaciones mejoran aún más la imagen ROS al incrementar especificidad y sensibilidad [19–22].

Enzimas con alta actividad catalítica son biosensores poderosos, pero su forma libre carece de estabilidad y permeabilidad de membrana, limitando uso intracelular. Sensores de HRP basados en electrodos son inadecuados para imagen en células vivas. La encapsulación de HRP dentro de caparazones de nanopartículas puede proteger la enzima y facilitar entrega intracelular, como se demostró con nanoesferas de sílice huecas (HSNs) [25–27]. Este estudio evalúa HRP@HSNs para detección intracelular de ROS, evaluando carga, actividad, captación celular, citotoxicidad e imagen funcional en macrófagos.

Métodos/Experimental

Químicos y Reactivos

Decano, n-hexanol (98%), hidróxido de amonio (35% p/p), TEOS (98%), APTMS (95%), FITC y otros reactivos se obtuvieron de ACROS y Sigma-Aldrich. HRP (tipo VI-A), DHR123, PMA y H₂O₂ (35%) se compraron de Cayman y SHOWA Chemical Industry. Todos los reactivos se usaron tal como recibidos.

Síntesis de Nanoesferas de Sílice Huecas (HSNs)

HSNs se prepararon por microemulsión agua-en-aceite con grabado selectivo, siguiendo protocolos de nuestro trabajo previo [25, 29]. Brevemente, 20 mL decano, 1.63 mL CA-520 y 550 µL n-hexanol se agitaron a 650 rpm, luego se añadieron 350 µL agua para formar la microemulsión. APTMS (25 µL, 200 µL en 1.4 mL etanol) y TEOS (100 µL) se introdujeron, seguidos por 250 µL amoníaco 35% a 20 °C. Tras 10 h, etanol 95% desestabilizó la emulsión; nanopartículas de sílice sólidas (SSNs) se recogieron por centrifugación (11,000 rpm, 20 min). SSNs se grabaron en agua a 40 °C por 40 min para producir caparazones huecos, luego se lavaron y almacenaron en etanol 99.5%.

Síntesis de Nanoesferas de Sílice Huecas Encapsulando Peroxidasa de Rábano Picante (HRP@HSNs)

El procedimiento replica la síntesis de HSNs, sustituyendo 350 µL agua por 350 µL HRP acuosa (10 mg mL⁻¹). HRP@HSNs se almacenaron en agua desionizada a 4 °C.

Síntesis de FITC-HSNs y HRP@FITC-HSNs

Para introducir fluorescencia verde, FITC-APTMS (10 mg FITC, 200 µL APTMS en 1.4 mL etanol, 18 h, oscuridad) reemplazó el APTMS etanólico en la síntesis, produciendo FITC-HSNs y HRP@FITC-HSNs.

Eficiencia de Encapsulación y Capacidad de Carga de HRP

HRP se marcó con RITC para crear RITC-HRP, que se encapsuló formando RITC-HRP@HSNs. Tras disolución en NaOH 1 M, la fluorescencia se midió (Hitachi F-4500, λ_ex = 543 nm, λ_em = 550–650 nm) y comparó con curva de calibración. Eficiencia de encapsulación (%) = (masa de RITC-HRP en nanoesferas / RITC-HRP inicial) × 100; capacidad de carga (µg HRP mg⁻¹ HSNs) se calculó correspondientemente.

Ensayo de Actividad HRP

La actividad HRP se cuantificó usando sustrato cromogénico TMB. Soluciones enzimáticas (HRP nativa y HRP@HSN) se mezclaron con 20 µM TMB y 20 µM H₂O₂ en tampón fosfato/citrato (pH 5.2). La absorbancia a 655 nm se registró con lector BioTek Synergy; la actividad se derivó de la curva de calibración de HRP nativa.

Ensayo de Reactividad con Diversos ROS

DHR123 (20 µM) con o sin HRP@HSNs (50 µg mL⁻¹) se incubó con 100 µM de ROS (H₂O₂, TBHP, superóxido, •OH, •OtBu) en DMEM (pH 7.4). La fluorescencia (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) se midió cada 5 min por 120 min.

Cultivo Celular y Ensayo de Viabilidad

Macrófagos RAW264.7 se cultivaron en DMEM + 10% FBS + antibióticos a 37 °C, 5% CO₂. Para viabilidad, 2 × 10⁵ células/pozo se sembraron en placas de 24 pozos; tras 24 h, las células se expusieron a 0–200 µg mL⁻¹ de nanopartículas en DMEM sin suero por 2 h. Reactivo WST-1 (Clontech) evaluó viabilidad (450 nm, referencia 650 nm) con lector Bio-Rad 680.

Análisis de Captación Celular

1 × 10⁶ células RAW264.7/pozo se incubaron con 0–200 µg mL⁻¹ de nanopartículas marcadas con FITC por 2 h. Tras lavado y tripsinización, la captación se cuantificó por citometría de flujo; azul tripano extinguió fluorescencia extracelular.

Citometría de Flujo de Producción ROS en Macrófagos Estimulados con PMA

Tras 2 h exposición a nanopartículas y 30 min carga DHR123, las células se estimularon con 1 µg mL⁻¹ PMA por 1 h antes de análisis en FACS Canto II.

Análisis Cuantitativo

Placas de 96 pozos se sembraron con 3 × 10⁴ células RAW264.7/pozo. Tras 2 h tratamiento con nanopartículas y 1 h incubación con PMA (variado) + DHR123 (20 µM), la fluorescencia (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) se midió. Una curva de calibración (H₂O₂ + HRP@HSN) permitió conversión de fluorescencia a concentración H₂O₂.

Caracterización

TEM (JEOL JEM-1200 EX II, 100 kV) confirmó núcleos huecos de 45 nm; tinción con acetato de uranilo verificó HRP interna. Dispersión dinámica de luz (Malvern Zetasizer Nano ZS) evaluó tamaño hidrodinámico y potencial zeta; las células se imaginaron con Zeiss Axio Observer Z1.

Resultados y Discusión

Diseño y Síntesis de HSNs y HRP@HSNs

HRP@HSNs se produjeron mediante química sol-gel catalizada por amoníaco dentro de microemulsión w/o (Esquema 1). TEM (Fig. 1) muestra esferas monodispersas de 45 nm; tinción con acetato de uranilo confirma encapsulación de HRP dentro de la cavidad hueca. DLS revela diámetros hidrodinámicos de 188 ± 4 nm (HSNs) y 184 ± 6 nm (HRP@HSNs) en agua, que aumentan a 1.8–1.7 µm en DMEM sin suero debido a agregación. Albúmina sérica bovina (BSA) reduce esta agregación, produciendo partículas estables de 195–197 nm.

Eficiencia de Encapsulación y Capacidad de Carga de HRP

La encapsulación de RITC-HRP produjo ~6% eficiencia de encapsulación en 11–33 nmol carga; la mayor capacidad de carga alcanzó 12.5 ± 1.2 µg HRP mg⁻¹ HSN a 33.3 nmol entrada. Aunque la eficiencia es modesta, demuestra que HRP puede retenerse dentro de la nanocavidad, y la carga puede ajustarse por concentración enzimática.

Citotoxicidad y Captación Celular

Ensayos WST-1 muestran ninguna reducción significativa en proliferación RAW264.7 tras 2 h o 26 h exposición a hasta 200 µg mL⁻¹ HSNs o HRP@HSNs, indicando baja citotoxicidad. Partículas marcadas con FITC lograron >80% eficiencia de marcado a >50 µg mL⁻¹ tras 2 h, confirmando entrega intracelular eficiente sin comprometer viabilidad celular.

Reactividad de HRP@HSNs a Diversos ROS

Ensayo de actividad HRP muestra ~40% retención de actividad nativa tras encapsulación, probablemente por limitaciones de difusión a través del caparazón de sílice. En ensayos libres de células, DHR123 sola no responde a H₂O₂ o superóxido pero reacciona fuertemente con •OH y •OtBu. HRP o HRP@HSNs amplifican marcadamente fluorescencia para todos los ROS probados, con mayor señal de HRP nativa correlacionando con su mayor actividad. Razones de fluorescencia relativa a 60 min revelan que ambas variantes HRP mejoran detección de H₂O₂ y superóxido, confirmando que la nanocavidad preserva función catalítica permitiendo difusión de sustrato.

Detección Intracelular de ROS con HRP@HSNs

Células RAW264.7 pre-tratadas con HRP@HSNs (2 h) y cargadas con DHR123 (30 min) mostraron fluorescencia marcadamente mayor tras estimulación PMA comparado a controles. Citometría de flujo muestra aumento >2-veces en fluorescencia R123 en células estimuladas; HRP@HSNs entregan actividad catalítica adicional, mientras HSNs simples producen aumento moderado de fluorescencia, probablemente reflejando respuestas de estrés celular. La intensidad de fluorescencia aumentó dependiente de dosis con tanto PMA (0.1–2 µg mL⁻¹) como HRP@HSNs (50–200 µg mL⁻¹). Imágenes confocales representativas confirman imagen intracelular ROS mejorada (Fig. 3d).

Aplicación de HRP@HSNs para Análisis Cuantitativo de H₂O₂

Usando curva de calibración externa H₂O₂ (0.625–15 µM), el H₂O₂ intracelular generado por macrófagos RAW264.7 estimulados con PMA se cuantificó. Células tratadas con 100 µg mL⁻¹ HRP@HSNs y 20 µM DHR123, luego expuestas a 0.1–2 µg mL⁻¹ PMA, produjeron concentraciones endógenas H₂O₂ de ~10 µM a ≥0.25 µg mL⁻¹ PMA. Esta medición semicuantitativa demuestra la utilidad de la plataforma para evaluar estrés oxidativo en células vivas.

Conclusiones

Hemos diseñado nanoesferas de sílice huecas que encapsulan HRP activo, creando sensores ROS intracelulares robustos. El caparazón de sílice poroso permite que sustratos pequeños alcancen la enzima atrapada mientras protege HRP de proteólisis. Acoplado con DHR123, HRP@HSNs proporcionan detección mejorada y semicuantitativa de H₂O₂ endógeno en macrófagos bajo estrés oxidativo. La funcionalización superficial con anticuerpos o péptidos permitirá direccionamiento específico a orgánulos o células tumorales, y cargas alternativas (ej. nanocatalizadores o sondas boronato) pueden ampliar el repertorio de sensado. Estos nanorreactores representan una plataforma versátil para imagen, cuantificación y entrega terapéutica dirigida simultánea de ROS en investigación biomédica y diagnóstico clínico.

Abreviaturas

APTMS

3-Aminopropiltrimetoxisilano

BSA

Albúmina sérica bovina

DHR123

Dihidrorrodamina 123

DLS

Dispersión dinámica de luz

FITC

Isotiocianato de fluoresceína

HRP

Peroxidasa de rábano picante

HSNs

Nanoesferas de sílice huecas

Igepal CA‑520

Éter polioxietileno (5) isooctilfenilo

mETC

Cadena de transporte electrónico mitocondrial

PET

Tomografía por emisión de positrones

PMA

Forbol 12-miristato 13-acetato

R123

Rodamina 123

RITC

Isotiocianato de rodamina B

ROS

Especies reactivas de oxígeno

SSN

Nanopartícula de sílice sólida

TBHP

Hidroperóxido terc-butilo

TEM

Microscopía electrónica de transmisión

TEOS

Ortosilicato de tetraetilo

TMB

3,3′,5,5′-Tetrametilbencidina