Nanoesferas huecas de sílice encapsuladas con peroxidasa de rábano picante para detección intracelular de especies reactivas de oxígeno

Métodos / Experimental

Productos químicos y reactivos

Decane, n -hexanol (98%), hidróxido de amonio (NH ₄ OH, 35% en peso), ortosilicato de tetraetilo (TEOS, 98%), 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS, 95%) e isómero de isotiocianato de fluoresceína (FITC) se adquirieron de ACROS. Polioxietilen (5) isooctilfenil éter (Igepal CA-520), HRP tipo VI-A (HRP), 3,3′5,5′-tetrametilbencidina (TMB), ácido cítrico, dimetilsulfóxido (DMSO) e isotiocianato de rodamina B ( RITC) se adquirieron de Sigma-Aldrich. El 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolio se adquirió de Clontech. DHR123 y PMA se adquirieron de Cayman Chemical. Peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ , 35%) se compró a SHOWA Chemical Industry. Solución de hidroperóxido de terc-butilo (70% en H ₂ O) se adquirió de Aldrich. Perclorato de hierro (II) (Fe (ClO ₄ ) ₂ ) se compró a Alfa Aesar. Se generó agua ultrapura desionizada (D.I.) mediante un sistema Millipore Milli-Q Plus. Todos los reactivos se utilizaron sin purificación adicional.

Síntesis de nanoesferas huecas de sílice (HSN)

Los HSN se sintetizaron mediante un sistema de microemulsión inversa acompañado de un método de grabado selectivo como se describe en nuestros estudios anteriores [25, 29]. Por lo general, 20 ml de decano como fase oleosa, 1,63 ml de CA-520 como tensioactivo y 550 μL de n -hexanol como cotensioactivo se mezclaron y se agitaron magnéticamente con una barra de agitación revestida con PTFE de 2 cm a 650 rpm. Después de eso, 350 μL de D.I. se añadieron agua a la mezcla a temperatura ambiente, generando un sistema de microemulsión de agua en aceite (w / o). A continuación, se agregaron 25 μL de solución etanólica de APTMS (200 μL de APTMS en 1.4 mL de etanol absoluto) y 100 μL de TEOS con agitación. Después de agitar durante 10 min, se introdujeron 250 μL de amoniaco acuoso (35% en peso) en el sistema con agitación a 20 ° C. Después de 10 h, se añadió etanol al 95% para desestabilizar el sistema de microemulsión y las nanopartículas de sílice sólidas (SSN) se recogieron mediante centrifugación a 11.000 rpm durante 20 min. Para obtener HSN, los SSN se suspendieron en D.I. agua con agitación a 40 ° C durante 40 min. A continuación, se recogieron los HSN mediante centrifugación a 11.000 rpm durante 20 min y se lavaron varias veces con etanol al 95%. Finalmente, los HSN se suspendieron y se mantuvieron en etanol al 99,5%.

Síntesis de nanoesferas huecas de sílice encapsuladas con peroxidasa de rábano picante (HRP @ HSN)

Los HRP @ HSN se sintetizaron mediante un método basado en nuestros estudios anteriores [27, 28]. Normalmente, la síntesis es similar al procedimiento anterior, excepto que 350 μL de D.I. el agua se reemplazó por 350 μL de HRP acuosa (90 μL de 10 mg / mL de una solución de HRP en 350 μL de agua D.I.). Después de la síntesis, los HRP @ HSN se mantuvieron en D.I. agua a 4 ° C.

Síntesis de FITC-HSN y HRP @ FITC-HSN

Los HSN y HRP @ HSN con colorante de fluoresceína emisor de verde incorporado (designado FITC-HSN y HRP @ FITC-HSN) se sintetizaron de manera similar al procedimiento anterior, excepto que la solución etanólica de APTMS se reemplazó por una de FITC-APTMS. Se preparó una solución etanólica de FITC-APTMS mezclando 10 mg de FITC y 200 μL de APTMS con 1,4 mL de etanol absoluto en condiciones de oscuridad durante 18 ha temperatura ambiente.

Eficiencia de atrapamiento de HRP y capacidad de carga de HRP @ HSN

Primero, se agitó una mezcla compuesta de HRP (6 mg en 500 μL de agua D.I.) y RITC (3 mg en 350 μL de DMSO) en condiciones de oscuridad durante 24 ha 4 ° C. Después de eso, la mezcla se transfirió a una membrana de diálisis compuesta de celulosa regenerada con un límite de peso molecular de 12 ~ 14 kDa. Luego, para eliminar el RITC sin reaccionar, la bolsa de diálisis se dializó frente a 1 L de D.I. agua y se agita suavemente durante 3 días. Finalmente, el HRP marcado con RITC (designado RITC-HRP) se utilizó para sintetizar RITC-HRP @ HSN.

Para determinar la capacidad de carga de HRP, se disolvieron RITC-HRP @ HSN en 1 mL de NaOH (1 M) durante 1 h, y la cantidad de RITC-HRP atrapado se calculó a partir de una curva de calibración establecida mediante el trazado de la intensidad de fluorescencia frente a la concentración de RITC-HRP. La fluorescencia se midió con un instrumento Hitachi F-4500 a una longitud de onda de excitación de 543 nm y una longitud de onda de emisión de 550 ~ 650 nm. La eficiencia de atrapamiento de HRP y la capacidad de carga de HRP @ HSN se definieron de la siguiente manera:eficiencia de atrapamiento (%) =masa de RITC-HRP en RITC-HRP @ HSN / masa inicial de RITC-HRP; y capacidad de carga =masa de RITC-HRP en HRP-RITC @ HSN / masa de RITC-HRP @ HSN.

Ensayo de actividad de HRP

Para detectar la actividad de la enzima peroxidasa, se utilizó un sustrato cromogénico de TMB. TMB se puede convertir en un producto coloreado cuando se oxida mediante HRP utilizando peróxido de hidrógeno como agente oxidante. Primero, se prepararon varias concentraciones de HRP nativa y HRP @ HSN en tampón de fosfato y citrato (pH 5,2). Luego, cada solución se complementó con 50 μL de la solución TMB (20 μM en DMSO) y 50 μL de H ₂ O ₂ (20 μM en agua D.I.). La reacción se controló midiendo la absorbancia a 655 nm usando un lector de microplacas (BioTek Synergy Hybrid Reader). La actividad de HRP encapsulada en HSN se calculó a partir de la curva de calibración de HRP nativa.

Ensayo de reactividad de HRP @ HSN a varios ROS

Se incubó DHR123 (20 μM) solo o mezclado con HRP @ HSN (50 μg / mL) con varios tipos de ROS (100 μM) en 100 μL de solución DMEM (pH 7,4). La emisión de fluorescencia a 530 nm (λex =488 nm) se controló cada 5 min durante los primeros 120 min. Los ROS investigados se obtuvieron de la siguiente manera:peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) y el hidroperóxido de terc-butilo (TBHP) se prepararon a partir de soluciones acuosas al 32 y al 70% disponibles comercialmente, respectivamente. Superóxido (O ₂ ^{• -} ) se generó a partir de una reserva 10 mM de superóxido de potasio (KO ₂ ) en DMEM. Los radicales hidroxilo (• OH) y los radicales terc-butoxi (• OtBu) se produjeron mediante la reacción de Fe (ClO ₄ 1 mM) ) ₂ con 100 μM H ₂ O ₂ o TBHP de 100 μM, respectivamente.

Ensayo de viabilidad y cultivo celular

La línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 se obtuvo de ATCC. Las células RAW264.7 se mantuvieron en DMEM con FBS al 10%, penicilina 100 U / ml y estreptomicina 100 μg / ml (Gibco) a 37 ° C en CO ₂ al 5% atmósfera. Normalmente, 2 × 10 ⁵ Se sembraron células RAW264.7 por pocillo en placas de 24 pocillos para los ensayos de viabilidad. Después de 24 h, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con diferentes cantidades (0, 50, 100 y 200 μg / mL) de una suspensión de nanopartículas en DMEM sin suero durante 2 h. Para el ensayo de citotoxicidad, las células tratadas con nanopartículas se lavaron dos veces con medio de cultivo seguido de incubación con reactivo WST-1 (Clontech) a 37 ° C durante 2 h. Para el ensayo de proliferación, las células después del tratamiento con nanopartículas durante 2 h se dejaron crecer en medio de crecimiento regular durante 24 h seguido de incubación con el reactivo WST-1. La viabilidad celular se determinó mediante el colorante formazán generado por células vivas y se midió la absorbancia a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 650 nm, utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, modelo 680).

Análisis de absorción celular

Células RAW264.7 a 1 × 10 ⁶ por pocillo se sembraron en placas de seis pocillos durante la noche. Luego, se trataron macrófagos RAW264.7 con diferentes cantidades (0, 50, 100 y 200 μg / mL) de una suspensión de nanopartículas en medio DMEM sin suero durante 2 h. Después de eso, las células se lavaron tres veces con PBS y se separaron con una solución de tripsina-EDTA. La captación de nanopartículas por macrófagos RAW264.7 se examinó mediante citometría de flujo. El azul tripán se utilizó para apagar la fluorescencia de las nanopartículas adsorbidas en la membrana exterior de las células.

Análisis de citometría de flujo de la producción de ROS en macrófagos RAW264.7 estimulados por PMA

Normalmente, después de 2 h de tratamiento de macrófagos RAW264.7 con nanopartículas, las células se lavaron tres veces con PBS seguido de incubación con DHR123 20 µM en DMEM sin suero durante 30 min. Luego, las células RAW264.7 se lavaron con PBS y se incubaron con medio de cultivo que contenía PMA a diferentes concentraciones durante 1 h. Después del lavado, se recolectaron macrófagos RAW264.7 y se analizaron con un citómetro de flujo FACS Canto II.

Análisis cuantitativo

RAW264.7 celdas a 3 × 10 ⁴ por pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos para ensayos semicuantitativos. Después de la incubación con 50 μL de 100 μg / mL de una suspensión de nanopartículas en DMEM libre de suero durante 2 h, las células tratadas con nanopartículas se trataron con 50 μL de DMEM libre de suero que contenía diferentes concentraciones de PMA y 20 μM de DHR123 para un adicional 1 ha 37ºC. Al mismo tiempo, los estándares externos de H ₂ O ₂ mezclados con 50 μg / ml de HRP @ HSN se utilizaron para desarrollar una curva de calibración trazando la intensidad de la fluorescencia frente a la concentración de H ₂ O ₂ . La intensidad de la fluorescencia se midió con un lector de microplacas (BioTek Synergy Hybrid Reader) con excitación a 488 nm y emisión a 530 nm. Usando la curva de calibración establecida, cantidades de H ₂ O ₂ en células RAW264.7 estimuladas con diversas cantidades de PMA.

Caracterización

Se tomaron imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) en un JEOL JEM-1200 EX II que funcionaba a 100 kV. Las imágenes se registraron con una cámara CCD GatanOrius. Las muestras se dispersaron en etanol al 95% y se dejaron caer sobre una rejilla de cobre recubierta de carbón, y luego se secaron al aire y se examinaron. Para verificar la HRP en las esferas huecas, se agitó una muestra de tinción negativa en acetato de uranilo (UA) acuoso al 1% durante 1 h, y luego se centrifugó para eliminar el UA restante. Finalmente, la muestra se dispersó en etanol y se dejó caer sobre la rejilla de cobre para obtener imágenes. Se realizaron mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) y potencial zeta en un Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido). Se obtuvieron imágenes ópticas de células RAW264.7 con un microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1.

Resultados y discusión

Diseño y síntesis de HSN y HRP @ HSN

Normalmente, los HSN y HRP @ HSN se sintetizaron mediante un proceso de sol-gel catalizado por amoníaco combinado con un sistema de microemulsión de agua en aceite (w / o) de acuerdo con nuestro método anterior [27, 28]. El esquema 1 ilustra la síntesis de HRP @ HSN. Según las imágenes TEM (Fig. 1), los HSN con y sin HRP encapsulado mostraron un diámetro promedio de 45 nm (archivo adicional 1:Figura S1). La tinción UA mostró claramente una densidad de electrones mejorada dentro de las HRP @ HSN, pero no se observó tinción fuera de las HRP @ HSN (Fig. 1b), lo que indica que las enzimas HRP se atraparon con éxito dentro de la cavidad interior de las HRP @ HSN.

Diagrama de flujo de la síntesis de nanoesferas huecas de sílice encapsuladas en peroxidasa de rábano picante (HRP @ HSNs). APTMS, 3-aminopropiltrimetoxisilano; TEOS, ortosilicato de tetraetilo; SSN, nanopartícula de sílice sólida

Imágenes TEM de a nanoesferas huecas de sílice (HSN), b HSN teñidos con acetato de uranilo, c HSN encapsulados en peroxidasa de rábano picante (HRP @ HSN) y d HRP @ HSNs teñidos con acetato de uranilo. Recuadro:una vista ampliada

Las mediciones de DLS y los análisis de potencial zeta realizados a temperatura ambiente se muestran en la Tabla 1. Los datos de DLS mostraron que tanto los HSN como los HRP @ HSN dieron potenciales zeta positivos en agua (pH ~ 6,5) con diámetros hidrodinámicos de 188 ± 4 y 184 ± 6 nm en agua, respectivamente. Sin embargo, cuando las nanopartículas se dispersaron en DMEM sin suero, los diámetros hidrodinámicos aumentaron a 1767 ± 94 nm para HSN y 1598 ± 127 nm para HRP @ HSN. Estos indican un pequeño grado de agregación de HSN, pero aún estaban bien suspendidos en los medios. Mientras tanto, los potenciales zeta negativos de ambas nanopartículas medidas en los medios implican que algunos de los iones y biomoléculas del medio biológico pueden haber sido adsorbidos en las superficies de las nanopartículas [30, 31]. Bajo esta condición, las superficies cargadas positivamente de las nanopartículas estaban cubiertas por sustancias cargadas negativamente, lo que rápidamente provocó la agregación de las nanopartículas a través de interacciones electrostáticas. Para reducir la agregación no específica y promover la estabilidad coloidal de las nanopartículas, se introdujo albúmina de suero bovino (BSA) en los medios biológicos [28]. Posteriormente, los diámetros hidrodinámicos de HSN y HRP @ HSN mostraron una disminución considerable de los diámetros hidrodinámicos a 197 ± 43 y 195 ± 19 nm respectivamente.

Eficiencia de atrapamiento de HRP y capacidad de carga de HRP @ HSN

Para investigar la eficacia y la capacidad de carga del atrapamiento de HRP, se preparó HRP marcado con tinte fluorescente (RITC) (denominado RITC-HRP). La intensidad de fluorescencia de los RITC-HRP @ HSN se midió suspendiendo las nanopartículas en NaOH 1 M, y la cantidad de RITC-HRP encapsulado se determinó de acuerdo con una curva de calibración establecida representando la intensidad de fluorescencia frente a la concentración de RITC-HRP nativo. en las mismas condiciones (Archivo adicional 1:Figura S2). Para estudiar los efectos de la concentración de enzima sobre la eficiencia de atrapamiento y la capacidad de carga, se introdujeron en la síntesis tres cantidades diferentes de HRP (11,1, 22,2 y 33,3 nmol). Vale la pena señalar que en este rango de concentración, independientemente de la cantidad de enzima introducida, la eficiencia de atrapamiento de las enzimas para cada uno de los tres casos fue de aproximadamente el 6%. Esta baja eficacia puede deberse al hecho de que sólo una fracción de las gotitas de microemulsión nucleó y creció hasta HSN; la mayoría de las gotas de microemulsión no estaban nucleadas y permanecieron en su pequeño tamaño de ~ 8 nm [25]. Es posible que se necesite trabajo futuro para aumentar la eficiencia de carga. Sin embargo, la capacidad de carga de HRP de HRP @ HSN aumentó gradualmente a 12,5 ± 1,2 μg de HRP / mg de HSN cuando se utilizó 33,3 nmol de HRP (archivo adicional 1:Tabla S1). Esto indica que la capacidad de carga de HRP se puede controlar mediante la cantidad de enzima presente en la reacción.

Citotoxicidad y absorción celular de HSN y HRP @ HSN

Para evaluar la citotoxicidad in vitro de HSN y HRP @ HSN, se examinó la viabilidad celular mediante ensayos WST-1. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S3, no se observó ningún cambio significativo en la proliferación celular RAW264.7 después de los tratamientos de nanopartículas durante 2 h, o 2 h seguido de 24 h adicionales de cultivo. No se encontró ningún efecto obvio sobre la función mitocondrial celular causado por las nanopartículas de sílice en los puntos de tiempo indicados, independientemente de la presencia o ausencia de HRP dentro de los HSN.

A continuación, se prepararon respectivamente HSN conjugados con FITC y HRP @ HSN para investigar el efecto de concentración de nanopartículas en el etiquetado RAW264.7. Los resultados de la citometría de flujo (archivo adicional 1:Figura S4) mostraron que las células RAW264.7 se etiquetaron con éxito con FITC-HSN y HRP @ FITC-HSN a diferentes concentraciones durante 2 h en medios sin suero. En ambos casos, se encontraron aumentos dependientes de la dosis en la eficiencia de marcado, y más del 80% de las células RAW264.7 se marcaron mediante exposición a nanopartículas a una concentración de> 50 μg / ml durante 2 h. Propiedades como el etiquetado intracelular de alta eficiencia con un tiempo de incubación corto, una dosis relativamente baja de nanopartículas y la ausencia de citotoxicidad hacen que los HRP @ HSN sean adecuados para la detección intracelular de ROS.

Reactividad de HRP @ HSN a varios ROS

Según el ensayo de actividad enzimática de HRP utilizando TMB como sustrato, aproximadamente el 40% de la actividad enzimática inicial permaneció tras la encapsulación posterior de HRP en HSN. Esta disminución en la actividad específica observada de la enzima encapsulada (moles de sustrato convertidos por unidad de enzima por unidad de tiempo) podría haber resultado de limitaciones de transferencia de masa, que ocurren cuando los sustratos cruzan la capa de sílice hacia el HRP [32]. No obstante, la estrategia de encapsulación proporciona características adicionales, por ejemplo, la capa de sílice porosa puede proteger a la HRP contra la proteólisis al tiempo que permite el transporte de pequeñas moléculas de reactivos y productos [26, 27]. En conjunto, la reactividad observada de HRP @ HSN a ROS, evaluada mediante la incorporación de una sonda fluorescente (DHR123), podría ser el resultado de una combinación de la afinidad de las nanopartículas, así como la propiedad intrínseca de HRP por ROS.

Se utilizaron sistemas sin células para generar una variedad de ROS biológicamente relevantes, incluido el peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ), TBHP, radicales hidroxilo (• OH), radicales terc-butoxi (• OtBu) y superóxido (O ₂ • ^- ). Primero, se incubó DHR123 con un panel de ROS en ausencia y presencia de HRP o HRP @ HSN, seguido de la medición de la intensidad de fluorescencia del producto rodamina 123 (R123). Como se muestra en la Fig. 2, independientemente del tipo de ROS que se empleó, la intensidad de la fluorescencia se midió de forma dependiente del tiempo (30, 60, 90 y 120 min). Sin embargo, las aparentes diferencias de intensidad entre varios ROS dependen de las propiedades intrínsecas de DHR123. Por un lado, de acuerdo con un estudio previo [33], la Fig. 2a muestra que ni H ₂ O ₂ ni O ₂ • ^- podría oxidar DHR123 a R123. Además, el DHR123 mostró una mayor reactividad para los radicales • OtBu y • OH que otros ROS. Con la actividad catalítica de HRP, se observaron incrementos notables en la intensidad de fluorescencia en presencia de HRP nativa y HRP @ HSN como se muestra en la Fig. 2b, c. Se observó que la mayor intensidad de fluorescencia encontrada en el caso de HRP nativa en comparación con HRP @ HSN en el mismo tiempo de reacción se correlacionó positivamente con sus actividades enzimáticas observadas.

un - c Intensidad de fluorescencia dependiente del tiempo de la reacción de especies reactivas de oxígeno (ROS) seleccionadas con a dihidrorrodamina 123 (DHR123), b DHR123 + peroxidasa de rábano picante (HRP) y c DHR123 + HSN encapsulados en peroxidasa de rábano picante (HRP @ HSN). d Relación de intensidad mejorada de la reacción de ROS seleccionados con DHR123 + HRP y DHR123 + HRP @ HSN a 1 h. Los datos que se muestran son para 20 μM de DHR123, 400 ng / mL de HRP, 50 μg / mL de HRP @ HSN y 100 μM de ROS. (* p <0.05 versus el grupo de control en los puntos de tiempo correspondientes)

Para permitir una comparación directa entre varios ROS, los datos en un intervalo de tiempo de 60 min se seleccionaron y se informaron como intensidad de fluorescencia relativa normalizada al control (archivo adicional 1:Figura S5). El análisis posterior de la relación de intensidad mejorada se mostró dividiendo la intensidad de fluorescencia relativa de DHR123 + HRP o DHR123 + HRP @ HSN por DHR123 (Fig. 2d). En ambos casos que contienen HRP, una tendencia similar de la relación de intensidad mejorada sobre varios ROS, así como aumentos significativos en la reactividad de DHR123 a H ₂ O ₂ y O ₂ • ^- Se observaron, lo que demuestra que el HRP encapsulado proporcionó un alto grado de actividad enzimática intrínseca, y las capas de sílice de los HRP @ HSN permitieron el transporte de moléculas pequeñas para llevar a cabo una biocatálisis selectiva.

Detección de ROS intracelulares con HRP @ HSN

Para evaluar la funcionalidad de detección de ROS de HRP @ HSN dentro de las células, se incubaron macrófagos RAW264.7 con HRP @ HSN durante 2 h, seguido de lavado y luego incubación con DHR123 (20 μM) durante 30 min. Posteriormente, las células se lavaron y trataron con PMA (1 μg / mL) durante 1 h adicional. Se sabe que la estimulación de macrófagos con PMA da como resultado la producción de superóxido, que se dismuta en peróxido de hidrógeno por la superóxido dismutasa o por dismutación espontánea [34,35,36]. Por lo tanto, PMA puede funcionar como un estimulante para generar H ₂ O ₂ en macrófagos RAW264.7 para evaluar el H ₂ intracelular O ₂ -capacidad de detección de HRP @ HSNs. Como se muestra en la Fig.3a, ambos casos de macrófagos RAW264.7 cultivados solos y cultivados con HSN mostraron una fluorescencia débil en el análisis de citometría de flujo, lo que indica que las células no estimuladas produjeron un nivel basal débil de ROS, donde no se indujeron ROS significativos en la presencia de HSN. Además, las células tratadas con HRP @ HSN mostraron un aumento de intensidad significativo (Fig. 3a), lo que sugiere que las HRP @ HSN administradas dieron actividad catalítica adicional dentro de las células.

un Análisis de citometría de flujo de macrófagos RAW264.7 estimulados con y sin forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en presencia y ausencia de nanopartículas. b PMA y c La concentración de HSN encapsulados en peroxidasa de rábano picante (HRP @ HSN) alteró de manera dependiente la fluorescencia de los macrófagos RAW264.7. d Las imágenes de fluorescencia representativas de macrófagos RAW264.7 en las condiciones indicadas. Barras de escala de 50 μm

Para los experimentos de estimulación, las células tratadas con PMA generalmente generaron niveles más del doble de fluorescencia de R123 en comparación con las células no estimuladas. Además, las células tratadas con HRP @ HSN tenían el nivel más alto de fluorescencia, seguidas de las HSN y luego las células solas. Se observó que el tratamiento de los macrófagos RAW264.7 estimulados con HSN dio como resultado un pequeño aumento en la intensidad de la fluorescencia en comparación con la del control. Este resultado sugirió que las respuestas al estrés celular se desencadenan con extrema rapidez y son sensibles a los estímulos externos, incluida la exposición a nanopartículas [37]. Además, tanto PMA (0.1, 0.25, 0.5, 1 y 2 μg / mL) como HRP @ HSNs (50, 100 y 200 μg / mL) indujeron la expresión de R123 de una manera dependiente de la dosis, como se evidencia en la Fig. . 3b, c.

De acuerdo con el análisis de citometría de flujo, la Fig. 3d muestra las imágenes de fluorescencia representativas de macrófagos RAW264.7 estimulados con y sin PMA en presencia y ausencia de nanopartículas. El sistema fue capaz de visualizar H ₂ endógeno O ₂ generación en células RAW264.7, y la intensidad de fluorescencia más débil se observó en células tratadas con HRP @ HSN seguido de estimulación con PMA. Como se muestra en la Fig. 4a, la viabilidad celular de los macrófagos RAW264.7 en presencia del estimulante PMA o H ₂ exógeno O ₂ fue examinado mediante ensayos WST-1. Mientras que las ROS han estado implicadas en la apoptosis [38], solo se encontró un pequeño efecto sobre la viabilidad celular en el momento indicado, lo que hace que el siguiente análisis semicuantitativo sea práctico y significativo.

un Ensayo WST-1 de macrófagos RAW 264.7 después de tratamientos de H ₂ exógeno O ₂ o estimulación con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) durante 1 h. b Detección de la concentración de H ₂ O ₂ producido endógenamente por macrófagos RAW264.7 bajo diversas concentraciones del estimulante PMA en presencia de nanoesferas huecas de sílice encapsuladas con peroxidasa de rábano picante (HRP @ HSN) y dihidrorrodamina 123 (DHR123). Recuadro:una curva de calibración obtenida de los estándares externos de H ₂ O ₂ mezclado con HRP @ HSN y DHR123

Application of HRP@HSNs In Vitro for Quantitative Analysis of H₂ O ₂

To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H₂ O ₂ experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H₂ O ₂ endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H₂ O ₂ -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H₂ O ₂ is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H₂ O ₂ are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H₂ O ₂ has an extracellular concentration estimated at 10 ^− 7 ~10 ^− 6  M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H₂ O ₂ are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10 ^− 4  M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Conclusions

In summary, we have demonstrated that hollow silica nanospheres encapsulating HRP can be synthesized via a microemulsion-templating system and act as intracellular fluorescent ROS sensors. The shells of HRP@HSNs are permeable to small molecules, such as the enzyme substrates, which allows them to react with large enzyme payloads in the hollow cavity. Both the effective intracellular delivery and satisfactory catalytic activity of HRP@HSNs significantly enhance reduction-triggered fluorescence and constitute the ability of semi-quantitative measurements of endogenous H₂ O ₂ in RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Because the concentration and location of H₂ O ₂ in eukaryotic cells strongly rely on the types of cells, and cellular compartments [1], specific targeting of tumor cells or organelles could further be achieved by surface modification of HRP@HSNs with monoclonal antibodies or peptides. Also, non-enzymatic H₂ O ₂ detection could be realized by replacing the interior nanoreactors of HRP with nanoparticles [43, 44] or boronate-based fluorescent probes [42, 45]. Future efforts should be devoted to maximizing the sensitivity and specificity for H₂ O ₂ as well as enabling more informative designs of next-generation nanomaterials. Such hollow capsules could be a promising platform for modern nanomedicines that aims to simultaneously image, sensing, and deliver therapeutic molecules specifically to defective cells.

Abreviaturas

APTMS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

BSA:

Bovine serum albumin

DHR123:

Dihydrorhodamine 123

DLS:

Dispersión de luz dinámica

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

HRP:

Horseradish peroxidase

HSNs:

Hollow silica nanospheres

Igepal CA-520:

Polyoxyethylene (5) isooctylphenyl ether

mETC:

Mitochondrial electron transport chain

PET:

Positron emission tomography

PMA:

Phorbol 12-myristate 13-acetate

R123:

Rhodamine 123

RITC:

Rhodamine B isothiocyanate

ROS:

Reactive oxygen species

SSN:

Solid silica nanoparticles

TBHP:

Tert-butyl hydroperoxide

TEM:

Transmission electron microscopic

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

TMB:

3,3′5,5′-Tetramethylbenzidine

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