Puntos de carbono: Nanotermómetros de próxima generación pioneros – Una revisión exhaustiva

Resumen

La detección de temperatura sin contacto y de alta sensibilidad es fundamental para estudiar reacciones químicas básicas, procesos biológicos y aplicaciones en diagnóstico médico. Los nanotermómetros basados en nanomateriales garantizan sondas no invasivas para una detección precisa y sensible de la temperatura con resolución subcelular. Los sensores de temperatura basados en fluorescencia han demostrado gran capacidad, ya que operan en modo "sin contacto" y ofrecen las funciones duales de imagen celular y detección de temperatura a nivel molecular. Los avances en nanomateriales y nanotecnología han llevado al desarrollo de sensores novedosos, como los nanotermómetros (materiales de detección de temperatura con alta resolución espacial a nanoescala). Estos nanotermómetros se han desarrollado utilizando diferentes plataformas: proteínas fluorescentes, compuestos orgánicos, nanopartículas metálicas, nanopartículas dopadas con tierras raras y puntos cuánticos de semiconductores.

Los puntos de carbono (CDs) han atraído interés en muchos campos de investigación debido a sus propiedades sobresalientes: fluorescencia intensa, resistencia al fotoblanqueo, estabilidad química, precursores de bajo costo, baja toxicidad y biocompatibilidad. Informes recientes mostraron el comportamiento de detección térmica de algunos CDs, lo que los convierte en una alternativa a otros nanotermómetros basados en nanomateriales. Este tipo de termómetro basado en luminiscencia es prometedor para la detección de temperatura en nanocavidades y el mapeo térmico, permitiendo una mejor comprensión de los procesos biológicos. Dado que los CDs aún se encuentran en etapas tempranas como material a nanoescala para detección térmica, en esta revisión proporcionamos una comprensión exhaustiva de este nuevo nanotermómetro, métodos de funcionalización para mejorar la sensibilidad y resolución térmica, y el mecanismo del comportamiento de detección térmica.

Introducción

La temperatura es una variable termodinámica fundamental que influye notablemente en los sistemas biológicos y químicos. Debido a su amplio rango de aplicaciones, en prácticamente todos los campos de las ciencias naturales, la ingeniería, la agricultura y la medicina, la determinación precisa de la temperatura es de gran importancia. En aplicaciones médicas, la termometría se utiliza para la detección temprana de diversas enfermedades, como accidentes cerebrovasculares, cáncer o inflamaciones, uno de cuyos síntomas incipientes es la aparición de peculiaridades de temperatura localizadas.

Históricamente, la primera estimación de temperatura se basó posiblemente en la sensación o la observación. En la antigüedad, entre 200–10 a.C., los experimentos neumáticos (expansión del aire por calor) se citan como las referencias más antiguas reconocidas de aparatos utilizados para mediciones cuantitativas de calor. Entre los escritos más primitivos relacionados con la expansión del aire por calor se atribuyen a los trabajos de Filón de Bizancio y Herón de Alejandría sobre experimentos neumáticos. Más tarde, entre 1592 y 1603, Galileo Galilei inventó un termoscopio mediante experimentos con la expansión del aire por calor, construyendo un aparato simple con un tubo que contenía aire atrapado sobre una columna de agua. Tras Galileo, el italiano Santorio fue el primero en integrar este aparato simple en exámenes médicos de fiebre. El primer termómetro de líquido en vidrio completamente sellado, un tubo de vidrio lleno de alcohol, fue ensamblado por Fernando II en 1641. Logró medir la temperatura sin la influencia de la presión barométrica, a diferencia del termoscopio abierto de Galileo y Santorio. El trabajo práctico de Fahrenheit en termometría surgió en 1706; comenzó con alcohol pero se volvió legendario por sus termómetros de mercurio. El reconocimiento de la escala de temperatura centesimal se atribuye a Anders Celsius, quien en 1742 propuso una escala con cero en el punto de ebullición del agua y 100 en el punto de congelación. Las experimentaciones electrónicas se realizaron en el siglo XIX cuando Thomas Johann Seebeck consideró el concepto de termolectricidad. En una serie de experimentos entre 1820 y 1823, verificó el potencial eléctrico en los puntos de unión de dos metales diferentes cuando hay una diferencia de calor entre las uniones. Esto se conoció como el Efecto Seebeck y sirve como origen del termopar, considerado la medición de temperatura más precisa. La línea de tiempo esquemática del termómetro se muestra en la Fig. 1.

Figura 1. Esquema de la evolución de los termómetros

Los termómetros convencionales se pueden categorizar en:

1. Termómetros de vidrio con líquido basados en la expansión térmica de materiales
2. Termopares basados en el efecto Seebeck
3. Sensores ópticos

Además, se pueden clasificar como termómetros de contacto o sin contacto. El modo de contacto, que incluye termómetros clásicos de líquido en vidrio, termopares, termistores y detectores de temperatura por resistencia (RTD), todos requieren cableado eléctrico y contacto directo entre el termómetro y el sustrato. Este modo no es apropiado para aplicaciones donde el ruido electromagnético es fuerte, las chispas podrían ser peligrosas, el ambiente es destructivo o las partes se mueven rápidamente. Además, los termómetros tradicionales no son capaces de mediciones cuando la resolución espacial baja a la escala submicrométrica, por ejemplo, en variaciones de temperatura intracelular y mapeo de temperatura de microcircuitos y microfluídica. De igual manera, las aplicaciones de ingeniería requieren estrategias termosensibles avanzadas para regiones miniaturizadas y entornos difíciles. Por lo tanto, para dominios a nanoescala, se deben considerar otros enfoques y materiales.

La termometría sin contacto novedosa puede superar los problemas mencionados. Por ejemplo, los termómetros ópticos moleculares son una generación más reciente de herramientas analíticas que consisten en clases moleculares que utilizan la medición de luz emitida para extraer la temperatura. Las sondas fluorescentes sensibles a la temperatura ofrecen un área prometedora para la termometría en aplicaciones de nanosistemas. La información de temperatura puede extraerse basándose en su intensidad de fluorescencia, forma de banda, desplazamiento de Stokes o vida media de decaimiento, que pueden relacionarse con la temperatura si se calibran adecuadamente.

Los termómetros moleculares tienen gran potencial en el diagnóstico de células enfermas o cancerígenas, que tienen temperaturas fisiológicas variables que las células ordinarias. En aplicaciones médicas, las posibilidades van desde el control de la expresión génica inducido por temperatura y el metabolismo celular hasta la penetración y tratamiento selectivo de células enfermas y la mejora de la disipación de calor de fuentes de calor integradas. Recientemente, nanomateriales como semiconductores, poliméricos y nanopartículas metálicas se han utilizado como sensores térmicos (nanotermómetros) que mostraron resolución térmica submicrométrica.

Termómetros que pueden resolver subgrados de temperatura en un amplio rango y que también pueden integrarse dentro de sistemas vivos podrían ofrecer una herramienta influyente en incontables áreas de investigación biológica, física y química. Por tanto, en esta revisión nos centramos en una "nueva generación" o "nueva clase" de nanotermómetro basado en nanomateriales de carbono (materiales carbonáceos). Según nuestro conocimiento, no existe un artículo de revisión reportado sobre puntos de carbono como nanotermómetro. Recientemente, los puntos de carbono (puntos cuánticos de carbono, puntos cuánticos de grafeno) junto con sus características únicas mostraron propiedades térmicas sensibles que los convierten en excelentes candidatos para comportamiento termométrico a nanoescala. Aquí se revisan definiciones, ventajas y mecanismos del comportamiento de detección térmica de los puntos de carbono. Finalmente, se presentan perspectivas futuras de esta nueva clase de termo-materiales.

Nanotermometría

Por "nanotermometría" se entiende el uso de materiales termosensibles a nanoescala para proporcionar información de temperatura sobre el entorno local de regiones a nano o microescala. Las sondas térmicas basadas en nanopartículas tienen gran capacidad en un amplio espectro de aplicaciones de detección, y numerosos "nanotermómetros" progresivos se han reportado recientemente. Además, diferentes tipos de nanomateriales convencionales han mostrado propiedades luminescentes termosensibles, como polímeros, nanocristales, nanopartículas dopadas con tierras raras y nanopartículas metálicas.

Así, los nanosensores térmicos son termómetros no invasivos, de modo sin contacto, precisos, que funcionan a nanoescala con alta resolución de sensibilidad. La detección térmica utilizando nanomateriales puede lograrse manipulando sus propiedades ópticas. La nanotermometría de fluorescencia se puede clasificar en varias clases según el parámetro preciso del cual se deriva la medición térmica: intensidad de la señal, forma de la banda, vidas de fluorescencia, desplazamiento de banda, polarización de la longitud de onda de excitación y desplazamiento espectral. En el primer caso, la fluorescencia cambia con diferentes temperaturas y puede detectarse como un aumento (o disminución) absoluto en la señal.

La nanotermometría de luminiscencia sin contacto, que utiliza nanomateriales luminescentes con emisiones dependientes de la temperatura, es predominantemente apropiada para aplicaciones biológicas. Estos nanomateriales luminescentes incluyen polímeros fluorescentes, nanopartículas metálicas, nanopartículas dopadas con tierras raras y nanodiamantes que tienen una propiedad termosensible en el rango fisiológico. Estos trabajos pioneros fueron capaces de proporcionar la temperatura promedio para células individuales. Las sondas luminescentes dependientes de la temperatura basadas en colorantes orgánicos (p. ej., Rodamina 6G) y polímeros (p. ej., poli(N-isopropil acrilamida)) generalmente muestran mala fotoestabilidad y pronunciada sensibilidad cruzada al oxígeno, lo cual es indeseable para trabajo en células vivas. Además, existe una fuerte dependencia del pH en la vida media del fluoróforo, lo que dificulta su uso sin el control preciso del pH del entorno estudiado.

Otra clase de nanotermómetros basada en nanocristales semiconductores puros y dopados se ha reportado, con candidatos más prominentes como CdSe, ZnS, InP o PbSe. Los puntos cuánticos de semiconductores (SQDs) son candidatos para termómetros a nanoescala, considerando que tienen alto rendimiento cuántico, larga vida antes del fotoblanqueo y biocompatibilidad adecuada tras modificación superficial apropiada. Además, pueden conjugarse fácilmente a proteínas y ADN para detección e imagen. El desafío excepcional que enfrenta este tipo de termómetros luminescentes es el reconocimiento asociado de brillo, fotoestabilidad, sensibilidad y precisión a T = 20–40 °C al sondear microentornos subcelulares. Los SQDs han sido revisados extensivamente en términos de síntesis, propiedades fisicoquímicas, luminiscencia y aplicaciones potenciales. Aquí dirigimos la atención del lector a estas numerosas revisiones notables. Comparados con colorantes orgánicos, los SQDs exhiben brillo superior para detección, un perfil de excitación más amplio para multiplexación y mejor fotoestabilidad para estudios a largo plazo. Además, los SQDs como sensores de temperatura son resistentes al pH y otras variaciones ambientales prevalentes dentro de una célula.

Generalmente, en los SQDs, debido a una combinación de diferentes procesos, un aumento de temperatura produce una disminución en la intensidad de fluorescencia (quenching), acompañada de un desplazamiento espectral. Este desplazamiento puede asumirse lineal en el rango biofísico. La magnitud de ambos efectos (quenching de luminiscencia y desplazamiento espectral) depende fuertemente del material que constituye los QDs y de su tamaño.

Cada grupo de nanomateriales luminescentes tiene limitaciones de uso junto con sus ventajas. Como se describió, los SQDs son favorecidos más que polímeros fluorescentes y colorantes orgánicos. Los SQDs son buenos en términos de fotoestabilidad, eficiencia cuántica y fluorescencia ajustable, pero los QDs no pueden usarse para rastrear una sola molécula para monitoreo a largo plazo debido a su parpadeo intrínseco. Además, el principal inconveniente de los QDs es su toxicidad, debida a su contenido de metales pesados, incluyendo metales como cadmio; esto limita sus aplicaciones biológicas y ambientales. Además, la disponibilidad de elementos precursores en la naturaleza es relativamente baja y, por tanto, los SQDs se consideran costosos.

Puntos de carbono como nanotermómetros

Para superar los problemas que surgieron de los nanotermómetros no basados en carbono (explicados en la sección anterior), se han preparado nanomateriales basados en carbono que mostraron propiedades únicas, como baja toxicidad, preparación fácil, precursores de bajo costo, fotoestabilidad y biocompatibilidad. Estos nanomateriales basados en carbono mostraron propiedades de detección térmica sensibles. Además, la mejora de nanopartículas libres de metales es importante y urgente debido al peligro ambiental para aplicaciones biológicas de materiales tóxicos. Entre la familia de nanomateriales basados en carbono, los nanodiamantes fluorescentes se reportaron primero como nanotermómetros. Los nanodiamantes fluorescentes poseen biocompatibilidad intrínseca resultante de su superficie químicamente robusta e inerte. Otros nanodiamantes se han usado recientemente para detección térmica intracelular con precisión sub-grado. La sensibilidad térmica de estos nanodiamantes se basa en los llamados centros de color por vacancia de nitrógeno, que son defectos puntuales consistentes en un átomo de nitrógeno que reemplaza un átomo de carbono de la red y un sitio de red vacío cercano. El centro de vacancia de nitrógeno de nanodiamantes fluorescentes se ha estudiado extensivamente y se ha caracterizado bien por su fotofísica y uso en aplicaciones biológicas. El principio de funcionamiento de la termometría basada en vacancia de nitrógeno depende de la medición precisa de este centro de color, que puede detectarse ópticamente con alta resolución espacial. Sin embargo, la baja eficiencia de fluorescencia y la pobre controlabilidad impiden tremendamente la aplicación de nanodiamantes fluorescentes.

Una de las clases más nuevas de la familia de nanomateriales basados en carbono son los puntos de carbono (CDs) altamente luminescentes, que poseen fotoluminiscencia excepcionalmente brillante, estabilidad fotoquímica, solubilidad en agua, gran biocompatibilidad y no toxicidad. Los CDs son nanopartículas esféricas de dimensión cero con diámetros menores a 10 nm. Se han aplicado diversos enfoques para preparar diversos tipos de CDs, como ablación láser, solvotérmica, síntesis hidrotermal, asistida por microondas, descarga por arco, oxidación ácida y más enfoques químicos y físicos. Además, los CDs muestran una perspectiva deseable para diversas aplicaciones, como imagen biológica, detección química y biológica, administración dirigida de fármacos, análisis farmacéutico y catálisis. Los puntos de carbono han sido revisados extensivamente en términos de síntesis, propiedades fisicoquímicas y aplicaciones potenciales. Remitimos al lector a las numerosas buenas revisiones sobre puntos de carbono.

En años recientes, los CDs fluorescentes como sensores de temperatura han atraído mucha atención de investigadores. En principio, se necesita algún requisito para la medición de temperatura efectiva, como que los nanopuntos de carbono exhiban una variación apreciable en su fotoluminiscencia en el rango de temperaturas relevantes. La fotoestabilidad, estabilidad de pH y vida útil son otros requisitos a considerar para aplicaciones prácticas.

Los CDs son alternativas prometedoras para los puntos cuánticos de semiconductores (SQDs) convencionales. Comparados con QDs, los CDs muestran muchas ventajas sobresalientes como bajo costo, baja toxicidad y sus propiedades ópticas/químicas únicas y robustas. Además, los CDs muestran muy poco fotoblanqueo. Comparados con otros materiales fluorescentes, los CDs se producen a partir de fuentes de carbono económicas abundantes en la naturaleza. Además, existen varios métodos simples para modificar y funcionalizar el estado de superficie de los CDs, lo que permite adaptar la solubilidad, estabilidad, propiedades fisicoquímicas y rendimientos cuánticos según los requisitos experimentales.

En la literatura, hay un número escaso de artículos reportados de puntos de carbono con fluorescencia dependiente de la temperatura, mostrados en la Tabla 1.

Yu et al. en 2012 fueron los primeros en investigar la fluorescencia dependiente de la temperatura en nanopuntos de carbono y compararlos con nanopartículas basadas en semiconductores y metales. Se basaron en medir vidas de fotoluminiscencia dependientes de temperatura mediante la técnica de conteo de fotones individual correlacionado en tiempo (TCSPC). La dinámica de relajación de fotoluminiscencia se vuelve más rápida a temperaturas más altas, lo que puede atribuirse a procesos de decaimiento no radiativos. La medición de los espectros de fluorescencia de la película de CD en función de la temperatura, desde temperaturas criogénicas hasta temperatura ambiente, mostró que con el aumento de temperatura, la intensidad de fluorescencia muestra una disminución repetitiva.

El espectro PL exhibe picos asimétricos, por lo que los espectros PL a cada temperatura pudieron ajustarse bien mediante una función de dos gaussianas. La banda de alta energía, banda I; la banda de baja energía, banda II. Además, la brecha de energía (ancho de banda) de fluorescencia se inspeccionó como función de temperatura. El ancho de banda total es pronunciado por términos independientes de temperatura (dispersión electrón-electrón) y dependientes de temperatura (dispersión electrón-fonón y de superficie/defectos). El ancho de banda de la banda I y banda II es independiente de temperatura, lo que especifica que la dispersión electrón-electrón domina en los CDs.

Por tanto, el débil efecto de temperatura en los CDs concuerda con el hecho de que el mecanismo de interacción principal involucra interacciones electrón-electrón en lugar de acoplamiento electrón-fonón. Además, una banda PL ancha (> 100 nm) observada usualmente incluso a temperatura muy baja (77 K) se refiere a una fuerte interacción electrón-electrón. Este resultado es similar a nanoclústeres metálicos y diferente de QDs semiconductores. Por tanto, Yu y colaboradores especularon que los π-electrones en los CDs pueden actuar de manera similar a los electrones libres en nanoclústeres metálicos.

Kalytchuk et al. sintetizaron CDs N,S altamente luminescentes y solubles en agua mediante tratamiento hidrotérmico en un paso de ácido cítrico y cisteína. Recopilaron espectros de absorción en estado estacionario en un amplio rango de temperaturas para caracterizar las propiedades PL dependientes de temperatura de los CDs. Los espectros de absorción de CDs N,S dispersos en agua a temperaturas entre 10 y 70 °C (incrementos de 5 °C) se muestran en la Fig. 3a. A diferencia de nanocristales semiconductores, la posición e intensidad de la banda de absorción no cambiaron con la temperatura. Resultados similares se reportaron previamente para CDs sintetizados por tratamiento hidrotérmico de glucosa en presencia de glutatión.

En su trabajo, mostraron un gráfico de color de los espectros PL de CDs N,S adquiridos a temperaturas de 2 a 80 °C con paso de 2 °C. El aumento de temperatura redujo la intensidad de emisión PL aproximadamente en un factor de 2 sin ningún desplazamiento detectable de las emisiones PL. La posición del máximo de emisión PL, el ancho a media altura (fwhm) PL y la intensidad PL integrada se determinaron cuantitativamente a las temperaturas estudiadas.

La posición del pico PL de CDs N,S muestra una débil dependencia de temperatura, a diferencia de la mayoría de nanocristales semiconductores, cuya banda prohibida cambia con temperatura, induciendo desplazamiento de emisión PL. Además, su fwhm PL exhibe solo un ensanchamiento insignificante (1.4 ± 1 nm) en el mismo rango de temperatura, indicando que el pico PL de CDs N,S muestra un ensanchamiento térmico despreciable. Para caracterizar los procesos de relajación no radiativos en los CDs, analizaron el quenching de la intensidad PL integrada como función de temperatura. Un gráfico de la intensidad PL integrada dependiente de temperatura para CDs N,S se muestra normalizada a la intensidad a 2 °C, revelando que la intensidad disminuye monótonamente en el rango estudiado, siendo la de 80 °C aproximadamente la mitad que a 2 °C. Basándose en estos resultados, la energía de activación del quenching térmico para los CDs a temperaturas entre 2 y 80 °C se estimó en 17.0 ± 0.7 meV usando la fórmula de Arrhenius para CDs N,S, cercano al valor reportado por Yu et al.

Además, Kalytchuk et al. examinaron la dinámica de emisión de CDs a diferentes temperaturas. La Fig. 4a–c exhibe la fuerte dependencia de temperatura de su emisión PL resuelta en tiempo, mostrando datos de espectroscopía de emisión resuelta en tiempo para tres temperaturas diferentes. Mapas transitorios de emisión PL de CDs se adquirieron en la región espectral entre 375 y 650 nm a 2, 50 y 80 °C. Hay un claro declive en el decaimiento PL al aumentar la temperatura, sugiriendo que los CDs tienen propiedades satisfactorias para sensores de temperatura basados en vida media PL. Es importante notar que se observó un decaimiento monoexponencial espectralmente uniforme a través de los perfiles de emisión de los puntos a todas las temperaturas estudiadas, indicando que la recombinación ocurre a través de canales altamente emisivos muy similares en todo el conjunto de CDs. La dinámica PL de los CDs es arguiblemente su cualidad más prometedora relacionada con aplicaciones de detección de temperatura. Específicamente, la sensibilidad de temperatura de los CDs los convierte en nanotermómetros de vida media PL.

La variación de la vida media PL de los CDs a temperaturas entre 2 y 80 °C se investigó a fondo; la Fig. 4d, e muestra datos de PL resueltos en tiempo recopilados en el máximo de emisión PL como función de temperatura. Un gráfico de color de PL transitorio en el rango de temperatura estudiado muestra que el aumento de temperatura conduce a un acortamiento monótono del decaimiento PL aparente. Todas las curvas de decaimiento registradas se ajustaron usando una función monoexponencial. Los datos de las vidas extraídas se presentan en la Fig. 4e. A medida que la temperatura aumenta de 2 a 80 °C, la vida PL disminuye monótonamente de 11.0 a 5.3 ns. El rango de temperatura sobre el cual se ha demostrado esta sensibilidad de vida PL (2–80 °C) cubre tanto el rango fisiológicamente relevante como las temperaturas de operación típicas de muchos dispositivos electrónicos. La sensibilidad pseudo-lineal absoluta de esta sonda térmica basada en CDs es 0.08 ns K⁻¹, y su sensibilidad relativa máxima es 1.79% K⁻¹ a 62 °C. El ajuste monoexponencial del decaimiento PL de la nanopartícula luminescente basada en CDs en el rango de temperatura estudiado produce un solo parámetro, la vida PL (τ), que puede convertirse directamente a unidades de temperatura usando una curva de calibración. Esta es una ventaja importante sobre los puntos cuánticos semiconductores típicos, que exhiben decaimiento multi-exponencial que limita su utilidad en aplicaciones que involucran mediciones de vida media PL.

También estudiaron la dependencia de temperatura de la vida media PL de CDs en solución salina fosfatada (PBS) y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), mostrando comportamiento similar.

Para demostrar la reutilizabilidad de los termómetros de luminiscencia basados en CDs, las curvas de decaimiento PL de muestras seleccionadas se midieron en siete ciclos sucesivos de calentamiento y enfriamiento a temperaturas entre 15 y 45 °C. En cada ciclo de medición, el decaimiento PL se midió tras 5 min de equilibrio térmico. No se observó histéresis térmica durante los ciclos de calentamiento y enfriamiento, y la variación de vida media PL resultante se grafica como función del tiempo, demostrando que la vida media PL de los CDs exhibe excelente estabilidad térmica.

Posteriormente, se prepararon varios CDs con emisión dependiente de temperatura usando diversos métodos de síntesis, como tratamiento hidrotermal y solvotérmico, reflujo de calor y ablación láser, como se muestra en la Tabla 1. Los CDs preparados mostraron fluorescencia dependiente de temperatura lineal en rangos fisiológicos. La intensidad de fluorescencia de los CDs disminuyó con el aumento de temperatura. Además, la reversibilidad y restaurabilidad de la intensidad de fluorescencia se estudiaron en todos los artículos. La Figura 6 muestra algunas propiedades comunes de CDs estudiadas en diversos artículos.

Nguyen et al. sintetizaron puntos de carbono (CDs) usando ablación láser de femtosegundo de polvo de grafito en etilendiamina. Se formaron abundantes grupos funcionales en la superficie que forman múltiples estados de superficie en el sitio de superficie, resultando en multi-emisión de CDs. Investigaron la sensibilidad de temperatura dependiente de fluorescencia de CDs usando espectros de fluorescencia en estado estacionario. Los espectros de emisión dependientes de temperatura de los CDs a excitación de 320 nm se muestran en la Fig. 7a. Ambas intensidades de fluorescencia de los picos a 400 y 465 nm disminuyen gradualmente con el aumento de temperatura debido a la activación térmica de vías de decaimiento no radiativo. Las intensidades de pico cambian linealmente con temperatura en rango de 5 a 85 °C. Los CDs sensibles a temperatura mostraron cambio de intensidades de fluorescencia de 3.3 y 2.1% por °C para picos de 400 y 465 nm, respectivamente. Esto indica que los CDs pueden usarse como sensor de temperatura convencional basado en intensidad con alta sensibilidad.

Notablemente, la única propiedad de multi-emisión hace que los CDs sean fluoróforos prometedores para sensores de temperatura fluorescentes radiométricos. La relación de las dos intensidades de fluorescencia a 400 y 465 nm (excitación 320 nm) versus temperatura se muestra en la Fig. 7c. Hay una muy buena relación lineal entre la relación de intensidad de pico y temperatura en un amplio rango de 5 a 85 °C (R² = 0.998). La linealidad térmica es ventajosa ya que hace que la correlación entre la relación de intensidad de pico y temperatura sea directa y simultáneamente proporciona una sensibilidad térmica constante en todo el rango dinámico. La sensibilidad de temperatura de los CDs se determina en 1.48% °C⁻¹, comparable con otros materiales. Debe notarse que el rango de respuesta de temperatura de los CDs es mucho más amplio que los de otros reportes sobre sensores de temperatura de doble emisión y cubre tanto la temperatura fisiológica para estudios biológicos como la temperatura de trabajo para muchos dispositivos electrónicos. Además de excitación a 320 nm, los CDs también funcionan en otras longitudes de onda de excitación, como 340 y 365 nm, con la misma sensibilidad. Así, los CDs pueden utilizarse para detección de temperatura en muchas aplicaciones prácticas seleccionando diferentes longitudes de onda de trabajo.

Demostraron que el sensor de temperatura radiométrico era reversible entre 20 y 50 °C, cuatro ciclos y fotoestable (cuando cambiaba la intensidad de la fuente de energía). Este resultado sugiere que el sistema de detección de CDs es estable y robusto ante cambios en concentración de muestra, excitación o eficiencia de detección.

El aumento de temperatura no siempre viene acompañado de quenching PL; también podría mostrar mejora de PL. Macairan et al. mostraron la mejora de PL de puntos de carbono de doble fluorescencia con aumento de temperatura. Prepararon CDs biocompatibles de doble fluorescencia en una reacción asistida por microondas en un paso usando formamida y glutatión. Encontraron que tras excitación a 640 nm, la intensidad de fluorescencia y área integrada PL aumentan en el rango de 5–60 °C por un factor de 3.5 observado en todo el rango de análisis y temperatura. Como se muestra en la Fig. 8b, se observa una respuesta lineal (R² = 0.999) en todo el rango de análisis y la sensibilidad de temperatura se determinó en 3.71% °C⁻¹.

La fluorescencia dependiente de temperatura también se estudió tras excitación a 405 nm. Interesantemente, las bandas de fluorescencia azul y roja no son igualmente sensibles al cambio de temperatura. Con aumento de temperatura, la intensidad de fluorescencia (y el área integrada correspondiente bajo la curva) del componente azul muestra una ligera disminución en contraste con el componente rojo, que aumenta significativamente. Estas observaciones se notan en el rango de 5–60 °C donde la emisión azul disminuye en factor 1.3 en contraste con la emisión roja, que aumenta en factor 3.0.

Como se muestra en la Fig. 8d, la relación de fluorescencia roja a azul aumenta con temperatura, y una respuesta altamente lineal se triplica en 3 muestras únicas y el gráfico lineal refleja lo observado con R² = 0.998. Estos análisis se repitieron en un promedio de estas mediciones, que tienen pequeñas desviaciones a cada temperatura. La sensibilidad térmica de los CDs, en todo el rango de temperatura, varió de 1.33 a 4.81% °C⁻¹, una mejora sobre sistemas de nanotermometría de puntos de carbono reportados previamente y otros nanomateriales de doble emisión como puntos cuánticos y compuestos de marcos orgánico-metálicos-colorantes. La resolución térmica de los CDs se calculó en 0.048 K⁻¹, indicando que es posible medir pequeños cambios térmicos.

Zhang et al. sintetizaron CDs con características de respuesta a temperatura en rango de 25–95 °C, con excelente sensibilidad y notable reversibilidad/recuperabilidad. Se prepararon compuestos CD/epoxi dopando uniformemente CDs en resina epoxi. Primero, 5 μg de CDs se disolvieron en 50 μL de trietilentetramina (TETA). Luego, 350 μL de resina epoxi se añadieron a la mezcla y se mezclaron completamente por agitación a alta velocidad. El compuesto resultante mostró respuesta de temperatura significativamente mejorada.

La resina epoxi es una resina termoendurecible común y se usa ampliamente para encapsular chips LED. La Fig. 9b muestra micrografías ópticas de discos compuestos CD/epoxi de aproximadamente 2 cm de diámetro y 8–10 mm de espesor. Los compuestos CD/epoxi curados son transparentes, y sus espectros de emisión de fluorescencia se muestran en la Fig. 9c. El pico de emisión del compuesto CD/epoxi se desplaza hacia el azul aproximadamente 10 nm comparado con el de la solución de CDs. Notablemente, la respuesta de temperatura del compuesto se mejora significativamente. En el rango de 25–95 °C, la intensidad de fluorescencia disminuye 35% con aumento de temperatura, más del doble que en estado de solución, y los resultados lineales son más estables. La ecuación lineal satisface I₀/I = 0.0074 [°C] + 0.80454 (R² = 0.99724), donde I₀ e I son la intensidad de fluorescencia del compuesto CD/epoxi antes y después del aumento de temperatura, y la longitud de onda de excitación es 360 nm. El desplazamiento azul del pico de emisión y la mejora de las características de respuesta a temperatura pueden deberse a cambios en la constante dieléctrica del entorno donde se ubican los CDs. El compuesto tiene un amplio rango de detección de temperatura, y su excelente sensibilidad y estabilidad lo hacen adecuado para uso como sensor de temperatura basado en nanomaterial fluorescente en variedad de entornos.

Mecanismo de detección térmica

Hasta ahora, no hay un mecanismo bien establecido para explicar el comportamiento de detección térmica de los puntos de carbono. Algunos reportes atribuyen el mecanismo a la activación térmica de canales no radiativos de estados de superficie (trampa/defecto). La imagen general es que los canales no radiativos no se activaban a bajas temperaturas, por lo que los electrones excitados podían emitir fotones radiativamente. Por el contrario, al aumentar la temperatura, más canales no radiativos se activaban, y los electrones excitados volvían al estado fundamental por procesos no radiativos, llevando a la disminución de intensidad de fluorescencia. El mecanismo de emisiones de CDs con calentamiento/enfriamiento se muestra en la Fig. 10.

Figura 10. Ilustración esquemática de CDs respondiendo a cambios de temperatura

Para comprender mejor la termodinámica de los procesos de emisión de CDs, Kalytchuk et al. correlacionaron las tasas de recombinación radiativa (τᵣ⁻¹) y no radiativa (τₙᵣ⁻¹) de una muestra de CD con su rendimiento cuántico PL. La tasa radiativa se determina del rendimiento cuántico PL (QY) y la tasa de recombinación medida τ⁻¹ como τᵣ⁻¹ = QY × τ⁻¹. La tasa de relajación no radiativa τₙᵣ⁻¹ se expresa como τₙᵣ⁻¹ = τ⁻¹ - τᵣ⁻¹. El QY PL de CDs a varias temperaturas se calculó a partir de su absorción dependiente de temperatura e intensidad PL integrada junto con el QY PL determinado a temperatura ambiente. Ambas tasas de recombinación radiativa y no radiativa derivadas de datos de medición PL resueltos en tiempo se grafican como funciones de temperatura en la Fig. 11. La tasa de recombinación radiativa es mayor que la no radiativa correspondiente hasta 70 °C y no varía apreciablemente a temperaturas entre 2 y 80 °C, permaneciendo en el rango de (0.74–0.82) × 10⁶ s⁻¹. En contraste, hay un aumento monótono pronunciado (casi 7 veces, de 0.16 × 10⁶ a 1.12 × 10⁶ s⁻¹) en la tasa de recombinación no radiativa al aumentar la temperatura de 2 a 80 °C. El cruce dependiente de temperatura de las tasas radiativa y no radiativa ocurre a 70 °C, temperatura en la cual el QY PL es 50%. Estos resultados sugieren que la activación de temperatura del quenching PL en sus CDs es causada principalmente por la activación de canales de relajación no radiativos.

Figura 11. Tasas de recombinación radiativa (símbolos sólidos, color azul) y no radiativa (símbolos huecos, color rojo) para CDs graficadas contra temperatura para temperaturas de 2–80 °C

Guo et al. atribuyeron el quenching térmico de sus puntos de carbono preparados no solo a la activación del proceso de decaimiento no radiativo, sino también a la ocurrencia de atrapamiento no radiativo con aumento de temperatura. Midieron las vidas de decaimiento dependientes de temperatura de los CDs. El resultado muestra que la vida PL cae de 15.03 a 11.70 ns con temperatura aumentando de 283 a 343 K, lo que podría atribuirse a la ocurrencia de procesos de decaimiento no radiativo. Además, la dinámica de relajación PL de los CDs revela decaimiento multi-exponencial con aumento de temperatura, sugiriendo que los portadores fotoexcitados siguen procesos de relajación complicados. La ocurrencia de atrapamiento no radiativo aumentará con el aumento de temperatura, y esto podría analizarse cuantitativamente por el gráfico de Arrhenius de las intensidades PL integradas.

Otros grupos usaron técnicas microscópicas y espectroscópicas para entender el mecanismo de detección térmica de puntos de carbono.

Wang et al. usaron TEM y espectros UV-Vis para estudiar el comportamiento PL responsivo a temperatura de CDs preparados. Como se muestra en la Fig. 13a, los CDs no muestran cambio en los espectros UV-Vis al aumentar temperatura de 20 a 80 °C. Sin embargo, se encontró que el diámetro promedio de CDs aumentó de 2.6 ± 0.2 nm a temperatura ambiente a 4.4 ± 0.2 nm a 80 °C. Así, al aumentar la temperatura, ocurrió agregación de CDs preparados, lo que causó el quenching de fluorescencia obvio.

He et al. reportaron que el tamaño de partícula hidratado de sus CDs emerge como mayor con el aumento de temperatura, indicando que el aumento de temperatura da lugar a agregación de CDs, resultando eventualmente en quenching de fluorescencia. No obstante, con la disminución de temperatura, el tamaño de partícula hidratado de CDs comienza a disminuir, indicando que el enfriamiento tiene el potencial de causar despolimerización de CDs.

Otro grupo como Cui et al. también atribuyó el quenching de fluorescencia a la agregación de CDs. También intentaron aplicar CDs no dopados sintetizados usando solo ácido acrílico como precursor en sensores de temperatura. Desafortunadamente, los CDs no dopados poseían efectos de quenching más débiles bajo la misma elevación de temperatura que CDs dopados.

Yang et al. en su trabajo propusieron dos factores clave concernientes a la propiedad PL dependiente de temperatura de los N-CDs, incluyendo (i) grupos funcionales de superficie y (ii) interacción de enlaces de hidrógeno. Para examinar el efecto del primer factor, los grupos O-contenidos en superficie, se realizó otro experimento de control tratando N-CDs (4.0 mL) con un agente reductor fuerte NaBH₄ (1.0 mL, 0.1 mol L⁻¹) para remover especies C=O en superficie de puntos de carbono. Los N-CDs reducidos obtenidos se denotan como r-N-CDs. Comparados con N-CDs, los r-N-CDs exhiben intensidad de fluorescencia más débil. Además, la intensidad de fluorescencia de r-N-CDs solo disminuye 13% con temperatura aumentando de 20 a 80 °C, dando una sensibilidad de temperatura mucho menor, atribuida a la disminución de grupos O-contenidos.

El segundo factor, el efecto de enlaces de hidrógeno con el solvente en el comportamiento fluorescente de N-CDs fue explorado. La solución de N-CDs (1.0 mL) se depositó en papel filtro y se dejó secar al aire para obtener muestra sólida, que aún emite fluorescencia brillante. Sin embargo, no se observó cambio obvio de intensidad de fluorescencia de N-CDs sólidos con aumento de temperatura. También midieron la fluorescencia de N-CDs dispersos en etanol. La intensidad de fluorescencia de N-CDs en C₂H₅OH es menor que en agua y se observa poca variación de intensidad PL con temperatura aumentando de 20 a 80 °C. Por tanto, los fuertes enlaces de hidrógeno juegan un papel clave en la propiedad PL dependiente de temperatura de los N-CDs.

Sin embargo, nuestro grupo usó la misma estrategia experimental que el grupo Yang; en ambos casos, las emisiones de r-CDs y e-CDs se quenching linealmente con aumento de temperatura, de la misma manera que los resultados originales de sus CDs. Así, nuestros resultados descartaron los efectos sinérgicos de abundantes grupos funcionales oxigenados y enlaces de hidrógeno.

Bioimagen en células vivas (Imagen térmica)

En la literatura, solo unos pocos artículos exploraron las propiedades fluorescentes responsivas a temperatura de CDs en imagen biológica. Antes de tales experimentaciones, el análisis de citotoxicidad in vitro es crucial para CDs porque permite estimar la toxicidad de CDs en sujetos vivos. El análisis de citotoxicidad in vitro evalúa el efecto o influencia del nanomaterial en células cultivadas.

Yang et al. verificaron que los CDs podían usarse como termómetro efectivo en células vivas; células HeLa se lavaron con PBS tras tratamiento con CDs por 6 h. Fluorescencia azul brillante de CDs en células HeLa se observa a 25 °C. Con temperatura aumentando a 37 °C, la fluorescencia azul se vuelve más débil; la fluorescencia de N-CDs se recupera cuando la temperatura disminuye a 25 °C. Como termometría de imagen in vivo, las imágenes fluorescentes de ratones se recopilaron inmediatamente tras inyección con N-CDs a diferentes temperaturas. Estableciendo la intensidad de fluorescencia a 28 °C como referencia (I₀), I/I₀ del área donde se inyectaron CDs varía de 1.0 a 0.87 con aumento de temperatura de 28 a 34 °C. Con temperatura aumentando a 43 °C, I/I₀ declina a 0.52 y la fluorescencia se vuelve casi indetectable. E I/I₀ puede mejorarse reversiblemente de 0.66 a 1.0 con temperatura disminuyendo de 39 a 28 °C. Todos estos resultados indicaron que N-CD podría usarse como nanotermómetro efectivo in vitro e in vivo.

En un experimento exploratorio, Kalytchuk et al. probaron la capacidad de CDs para monitoreo de temperatura intracelular en células de cáncer cervical humano HeLa. La Figura 18 muestra las temperaturas intracelulares medidas de células HeLa incubadas con CDs (500 μg/mL). Las curvas de decaimiento PL de CDs a cada temperatura fueron altamente reproducibles y pudieron ajustarse con función monoexponencial a todas las temperaturas registradas. Pudieron confirmar que la señal PL en estas mediciones de vida media PL derivaba exclusivamente de los CDs para concentración de CD ≥ 100 μg/mL. La temperatura intracelular en cada medición se determinó a partir de la curva de calibración entre vidas media PL al aumentar temperatura de 2 a 80 °C. Las temperaturas determinadas de esta manera (T_meas) se grafican como funciones de la vida media PL en la Fig. 18b. Independientemente, la temperatura de la solución celular se determinó usando un termómetro de referencia calibrado. Las temperaturas reportadas por la sonda luminescente de CD y el detector de referencia están en buen acuerdo. Estos resultados muestran que la vida media PL de nanopartículas basadas en CDs puede usarse confiablemente para medir temperaturas intracelulares.

Para evaluar aún más el potencial de nanopartículas luminescentes basadas en CDs para monitoreo de temperatura a largo plazo en tiempo real, se registraron perfiles de decaimiento PL de células HeLa incubadas con CDs (500 μg/mL) cada 15 min por 24 h. Las vidas media PL extraídas de los valores de decaimiento PL medidos durante este período se graficaron como funciones del tiempo. Usando estos resultados, la variación de temperatura en el tiempo se calculó usando la curva de calibración. Además, la temperatura de la muestra en cada punto de medición se determinó usando un termómetro de referencia con reproducibilidad de temperatura de 60 mK. Hubo excelente acuerdo entre temperaturas medidas y de referencia. La alta precisión de mediciones de temperatura basadas en PL se demuestra además por análisis estadístico de las diferencias entre temperaturas medidas y reales (de referencia). Usando estos datos, la precisión absoluta promedio de detección de temperatura por el método presentado se calculó en 0.27 °C. Este experimento confirma el potencial de sondas térmicas basadas en CDs en sistemas biológicos.

Macairan et al. mostraron que los CDs preparados pueden usarse para detección térmica dentro de células usando enfoques de intensidad y radiométrico. Células HeLa tratadas con CDs se permitieron equilibrar a 32, 37 y 42 °C. La excitación a 640 nm se usó para monitorear selectivamente la fluorescencia roja de CDs en las células. Los cambios térmicos podrían deberse a cambios en concentración intracelular o no correlacionar con cambio de intensidad. Por tanto, confiar simplemente en cambios de intensidad de fluorescencia lleva a detección térmica intracelular precisa.

En cambio, estas limitaciones se excluyen usando el enfoque radiométrico. Los CDs mantienen fluorescencia dual azul y roja en células tras excitación a 405 nm, como se observó previamente para dispersiones coloidales. La relación rojo-azul aumenta con temperatura creciente, con valores de 1.8 a 32 °C, 2.0 a 37 °C y 2.3 a 42 °C. La relación radiométrica de fluorescencia rojo-azul de CDs destaca la ventaja de detección de temperatura radiométrica en desarrollo de sondas nano-termométricas fluorescentes. La relación de emisión rojo-azul relativa permanece inalterada, independientemente de la cantidad de CDs captados por las células, que puede verse afectada por factores como confluencia y no es dependiente de concentración. Por último, los CDs han mostrado reversibilidad de fluorescencia respecto a cambios en temperatura intracelular. Tras incubación en células HeLa, se sometieron a un ciclo de calentamiento/enfriamiento de 32/42/32 °C. Esto enfatiza la robustez del nanotermómetro de CD propuesto y estos hallazgos demuestran aún más la reversibilidad de fluorescencia.

Microscopía confocal de barrido láser se usó para imagen térmica de células de cáncer de colon HT-29 usando CDs dopados con N, S e I, como se muestra en la Fig. 20. Los puntos fluorescentes fueron dependientes de temperatura, siendo el más intenso a 15 °C y el más débil a 35 °C. Interesantemente, los puntos fluorescentes fueron reversibles, y fueron muy fotoestables tras 20 min de excitación continua.

Li et al. prepararon un nanocompuesto compuesto de MnOx-CDs para usarse como fluoróforo nano termo-responsivo para entornos biológicos. Células HepG2 se incubaron con MnOx-CDs a diferentes temperaturas de cultivo. Como se ilustra por microscopía confocal de barrido láser (excitada a 405 nm), la luminiscencia azul de MnOx-CDs en células HepG2 es débil cuando la temperatura ambiental era 40 °C, y la luminiscencia azul de MnOx-CDs en células HepG2 mejora al disminuir temperatura a 30 °C e incluso a 20 °C. Debido a las propiedades termo-responsivas, los MnOx-CDs sintetizados pueden aplicarse fácilmente en campos biomédicos como bioimagen y terapia fototérmica en tratamiento de cáncer.

Conclusiones y perspectivas futuras

Los nanopuntos de carbono exhiben propiedades únicas para explotar en nanotermometría, como sensibilidad térmica, bajo costo y fotoestabilidad. La modificación superficial flexible y la preparación fácil allanarán el camino para establecer un enorme número de nanomateriales termosensibles para variedad de aplicaciones. Las tendencias generales en nanomateriales termosensibles apuntan a mejorar fotoestabilidad y resolución térmica usando materiales de bajo costo y seguros. Los CDs pueden clasificarse como nueva generación de termómetro que puede cumplir estos requisitos y usarse para aplicaciones de termometría biomédica, como monitoreo de temperatura durante tratamiento de hipertermia. Protocolos de preparación fáciles, biocompatibilidad y fácil funcionalización de CDs son criterios prometedores que hacen de los CDs materiales alternativos de nanotermómetros de próxima generación. Se requieren más esfuerzos para promover investigación básica en este campo. Las limitaciones deben superarse para producir nanotermómetros basados en puntos de carbono que mejoren la sensibilidad térmica y funcionen en un rango más amplio de temperatura. Una mejor comprensión del mecanismo de detección térmica de fluorescencia es otra cuestión clave para poder diseñar y manipular la estructura de CDs y mejorar la resolución térmica. Más experimentos y modelado teórico son necesarios para entender la correlación entre métodos de fabricación de CDs con su comportamiento térmico.