La F-actina media la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales en nanotubos TiO2 vía MKL1 y YAP/TAZ

Resumen

El titanio y aleaciones de titanio se usan ampliamente en implantes ortopédicos. Modificar la nanotopografía proporciona nueva estrategia para mejorar la osteointegración de sustratos de titanio. La polimerización de actina filamentosa (F-actina), como estructura de carga mecánica, se considera generalmente involucrada en migración celular, endocitosis, división celular y mantenimiento de forma celular. Si la F-actina está involucrada y cómo funciona en la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales (CMMs) inducida por nanotubos queda por dilucidar. En este estudio, fabricamos nanotubos TiO₂ en superficie de sustrato titanio por oxidación anódica y caracterizamos sus características por microscopía electrónica de barrido (SEM), análisis dispersivo energía rayos X (EDS) y microscopía fuerza atómica (AFM). Se realizaron tinción fosfatasa alcalina (ALP), Western blotting, qRT-PCR e inmunofluorescencia para explorar potencial osteogénico, nivel F-actina y expresión MKL1 y YAP/TAZ. Nuestros resultados mostraron que el diámetro interno y rugosidad de nanotubos TiO₂ aumentaron con aumento de voltaje oxidación anódica 30-70 V, mientras su altura fue consistentemente 2 μm. Además, mayor diámetro tubular, mayor capacidad de nanotubos TiO₂ para promover diferenciación osteogénica CMMs. Inhibir polimerización F-actina con Citocinasina D (Cyto D) inhibió diferenciación osteogénica CMMs y expresión de proteínas en complejos adhesión focal como vinculina (VCL) y quinasa adhesión focal (FAK). En contraste, tras tratamiento Jasplakinolida (Jasp), polimerización F-actina aumentó expresión RhoA y factores transcripción YAP/TAZ. Concluimos que nanotubos TiO₂ facilitaron diferenciación osteogénica CMMs, y esta capacidad se增强 con diámetro creciente nanotubos en rango (30-70 V). F-actina medió este proceso mediante MKL1 y YAP/TAZ.

Introducción

Titanio y aleaciones, por su excelente biocompatibilidad, resistencia corrosión y propiedades mecánicas, se usan ampliamente en aplicaciones clínicas como reemplazos articulares totales e implantes dentales [1-3]. Sin embargo, quedan retos como aflojamiento aséptico e infección [4, 5]. En años recientes, se han realizado estudios para mejorar osteointegración y propiedades antibacterianas. Por ejemplo, recubrimiento MoS₂/PDA-RGD en implantes titanio no solo promueve integración implante-hueso huésped sino inhibe crecimiento bacteriano eficientemente [6]. Además, la topografía superficial ha atraído más atención, y la modificación topográfica difiere de modificaciones químicas al cambiar solo estructura micro/nanoescala. La estimulación de señales químicas en células es inestable y citotóxica. En comparación, señales físicas seguras y controlables evitan efectos secundarios por moléculas químicas. Por tanto, modificación topográfica de superficie implantes y regulación osteointegración mediante estructura topográfica proporcionan nueva vía para resolver problema clínico de mala osteointegración tras implante prótesis.

En ingeniería tejido óseo y regeneración ósea, interacción célula-morfología se considera estrategia prometedora para control preciso función y diferenciación células semilla. Al mismo tiempo, el hueso tiene jerarquía elegante en rango nanómetro-micrón [7]. Por tanto, morfología superficial puede proporcionar nicho similar, imitando estructura ósea natural y promoviendo diferenciación osteogénica CMMs en superficie hueso huésped e implante. Morfologías superficiales pueden consistir en muchas estructuras: nanotubos, nanohilos, nanoporos, etc. En particular, arrays nanotubos han atraído amplio interés en muchos campos por características únicas: alta relación superficie-volumen, plasticidad biológica, alta capacidad adsorción. Por ejemplo, nuevo estudio muestra nanotubos nitruro boro (BNNT) constituyen material gas-sensible usable como sensor gas para monitorear operación transformadores detectando composición y contenido gases disueltos en aceite [8]. En biomedicina, topografía superficial también dirige comportamientos celulares: migración, adhesión, proliferación, diferenciación. Estudios recientes revelan que topografía nanoescala puede dirigir CMMs a diferenciarse en osteoblastos reforzando osteointegración temprana [9-12]. Incluso se reporta que modificación combinada micro/nanoescala causa diferenciación CMMs en células musculares lisas contráctiles [13]. Sin embargo, mecanismos moleculares cómo topografía superficial dirige destino celular quedan por dilucidar, importante para evaluación seguridad y diseño materiales.

Actina filamentosa (F-actina), o microfilamento, es uno de tres componentes principales citoesqueleto en células eucariotas. Compuesta por polímeros actina globular (G-actina), modificada por numerosas proteínas. F-actina tiene polaridad estructural porque todas subunidades microfilamento apuntan al mismo extremo. Extremo barbado dirigido a monómero adyacente diferente, mientras extremo puntiagudo posee subunidad actina con sitio unión ATP expuesto. ATP involucrado en transformación G-actina/F-actina. Proceso en equilibrio dinámico, con polimerización y despolimerización simultáneas, también llamado "treadmilling", visto en lamelipodios y filopodios [14]. Por tanto, dinámica actina juega papel importante en funciones: migración celular, división, mantenimiento forma. Sin embargo, F-actina no solo actúa como estructura física soporte carga mecánica sino también participa en otras conductas biológicas: transducción señal, expresión génica. Evidencia acumulada demuestra F-actina convierte señales físicas en químicas interactuando con otras proteínas [15-18]. Por ejemplo, reconstrucción biomecánica y geométrica promueve apoptosis células tumorales impidiendo superposición polimerización monómero actina a F-actina [15]. Pulsos ultrasonido mejoran osteogénesis CMMs humanas inhibiendo despolimerización F-actina [16]. Nuestro estudio previo mostró que tensión mecánica aumenta estabilidad F-actina [17]. Como estructura hueca nanotubos proporciona menos sitios adhesión células, reorganización citoesqueleto es inevitable para mantener equilibrio biomecánico. Consecuentemente, tenemos razón para creer F-actina probablemente medie diferenciación celular inducida por nanotopografía.

En este estudio, fabricamos nanotubos TiO₂, modificamos topografía por oxidación anódica, exploramos capacidad promover diferenciación osteogénica CMMs. Luego investigamos si F-actina juega papel crítico en mecanotransducción. Citocinasina D (Cyto D), que se une competitivamente extremo barbado F-actina impidiendo incorporación G-actina al filamento, se usó inhibir polimerización F-actina, y jasplakinolida (Jasp) para estabilizar ensamblaje actina. Además, queríamos dilucidar cómo F-actina convierte señales físicas en bioquímicas. Basado en resultados estudio previo, hipotetizamos que vía MAPK puede estar involucrada [17]. Factores transcripción como Yes-associated protein (YAP)/coactivador transcripcional con motivo unión PDZ (TAZ) y MKL1, considerados mecanosensores y mecanotransductores, también fueron sujetos estudio para cribar cómo F-actina influye destino célula madre, porque estudios otras áreas implicaban relación con F-actina [19-21]. En general, esperamos clarificar papel F-actina en diferenciación célula madre inducida por nanotubos, para guiar diseño materiales y evaluación bioseguridad implantes modificados nanotubos.

Materiales y Métodos

Fabricación Nanotubos TiO₂

Láminas titanio puro (99,9% pureza, 2 mm espesor; Shengshida, Hebei, China), usadas como sustrato, pulidas con papel carburo silicio N° 400 y 1500. Muestras lavadas secuencialmente acetona, alcohol anhidro, agua desionizada en limpiador ultrasónico, secadas temperatura ambiente 3 h. Para fabricar nanotopografía, muestras pretratadas fijadas como ánodo, usando pieza platino como cátodo contador en solución electrolítica acuosa 0,15 M NH₄F y 90% glicol por 1 h. Voltaje anodización constante 30, 40, 50, 60, 70 V. Tras oxidación anódica, cada muestra enjuagada agua desionizada 30 min, lavada alcohol anhidro ultrasónico 15 min. Finalmente, todas esterilizadas autoclave 120 °C 1 h y humedecidas medio cultivo antes uso.

Mecanismo reacción fabricación nanotubos no está claro, teoría principal teoría disolución realzada por campo. Formación arrays nanotubos resultado equilibrio dinámico bajo acción oxidación campo, disolución campo, disolución química (Fig. 1b). Proceso anodización: primer paso, capa barrera óxido forma en interfaz electrolito-metal:

Ti⁴⁺ + 2H₂O → TiO₂ + 4H⁺

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La F-actina media la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales en nanotubos TiO2 vía MKL1 y YAP/TAZ — Diagrama resumen estudio. a Diagrama flujo oxidación anódica e inducción diferenciación celular. b Sustrato titanio pretratado fijado como ánodo en solución electrolítica 0,15 M NH₄F 90% glicol voltaje constante 1 h. Nanotubos autoensamblados predichos formados uniformemente. Mecanismo reacción descrito en materiales y métodos. c Diagrama esquemático mecanismo diferenciación osteogénica células madre inducida nanotubos

Luego grietas y rendijas estrechas aparecen en superficie por disolución realzada campo capa óxido. Difusión iones F⁻ en grietas aumenta velocidad disolución. Grietas agrandan y conectan con vecinas. Finalmente, velocidad formación y disolución capa óxido titanio alcanzan equilibrio dinámico, nanotubos ya no crecen:

TiO₂ + 6F⁻ + 4H⁺ → [TiF₆]^2- + 2H₂O

(2)

Caracterización Superficial

Muestras fabricadas diferentes voltajes (30, 40, 50, 60, 70 V) enjuagadas etanol y agua desionizada 15 min, secadas temperatura ambiente. Microscopía electrónica barrido (SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) caracterizó estructura superficial, midió diámetro interno y altura nanotubos tras recubrir muestra capa fina oro. Simultáneamente, análisis dispersivo energía rayos X (EDS) analizó composición elemental nanotubos. Microscopía fuerza atómica (AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, Bélgica) investigó morfología superficial y rugosidad muestras. Tres áreas diferentes seleccionadas cada muestra, mediciones repetidas tres veces.

Cultivo Celular

Ratas Sprague-Dawley (SD) macho 4 semanas compradas centro animales experimental Hospital Noveno Pueblo Shanghai (Shanghai, China). Células madre mesenquimales médula ósea rata (BMSCs) aisladas asépticamente fémures y tibias. BMSCs purificadas y expandidas en α-memoria esencial mínima (α-MEM; Hyclone, Logan, UT, USA) conteniendo 10% (v/v) suero fetal bovino (FBS) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 100 mg/mL estreptomicina (Gibco), 100 U/mL penicilina (Gibco), incubadas 37 °C atmósfera humidificada 95% aire 5% CO₂. Medio renovado cada 2 días, tripsinizadas y sub-cultivadas 80% confluencia. Todas células usadas entre pasos 3-5. Medio inducción osteogénica: medio crecimiento suplementado 100 nM dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, 50 mM ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).

Ensayo Proliferación Celular

Rodajas titanio modificadas nanotubos TiO₂ cortadas forma circular colocadas en pozos placa 24 pozos. BMSCs pasos 3-5 cultivadas en nanotubos TiO₂ densidad 3×10⁴ células/disco en medio crecimiento u osteogénico. Tras 2 días cultivo, citocinasina D (Cyto D, Sigma-Aldrich) y jasplakinolida (Jasp, Sigma-Aldrich), para disrumpir polimerización F-actina, añadidas medio cada día 3 días. Concentración final y tiempo trabajo Cyto D y Jasp: 5 μM, 1 h y 2 μM, 3 h respectivamente. Medio renovado tras incubación reactivos. Viabilidad y proliferación evaluadas kit Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japan) 12 h tras tratamiento Cyto D o Jasp. Células incubadas 10% (v/v) solución CCK8 2 h incubadora 37 °C 5% CO₂. Luego 100 μL mezcla reacción transferidos pozos placa 96 pozos, absorbancia (OD) colorante formazan medido 450 nm espectrofotómetro UV-visible Multiscan (Safire2; TECAN, Mannedorf, Suiza). Además, contamos números aproximados células contador automático (AMQAX1000, Life Technologies). Antes conteo, BMSCs desprendidas enzimáticamente nanotubos TiO₂ teñidas azul tripano (Sigma-Aldrich).

Tinción Fosfatasa Alcalina y Análisis Actividad ALP

BMSCs sembradas cinco rodajas TiO₂ nanotubos modificadas (30, 40, 50, 60, 70 V) densidad 3×10⁴ por pozo, cultivadas medio osteogénico. Reactivos añadidos como arriba. Tras 7 días incubación, BMSCs en nanotubos lavadas tres veces PBS, fijadas 4% paraformaldehído, incubadas solución trabajo ALP kit según instrucciones fabricante (Hongqiao, Shanghai, China). Resultados observados microscopio estéreo tras lavado PBS.

Para análisis actividad ALP, células lisadas buffer RIPA sin inhibidores proteasa/fosfatasa, lisados centrifugados ensayados kit ALP Assay (Beyotime Institute Biotechnology, Jiangsu, China) siguiendo protocolo. Actividad normalizada concentración proteica lisado correspondiente.

Inmunocitoquímica

Tras 3 días tratamiento Cyto D y Jasp, BMSCs fijadas 4% paraformaldehído 20 min temperatura ambiente, lavadas tres veces PBS. Células permeabilizadas 0,3% Triton-X 100 30 min, lavadas tres veces PBS, teñidas faloidina conjugada Rodamina 1 h temperatura ambiente oscuridad. Luego enjuagadas PBS, contrasteadas DAPI (Beyotime Institute Biotechnology) 10 min temperatura ambiente. Tras tres lavados PBS adicionales, muestras fijadas portaobjetos observadas microscopía confocal.

Western Blotting

Para evaluar expresión proteica, BMSCs cultivadas nanotubos TiO₂ cosechadas tripsina (Gibco). Células lavadas tres veces PBS, lisadas buffer RIPA suplementado cocktail inhibidor proteasa/fosfatasa 30 min hielo. Lisado recogido centrifugación 12.000×g 15 min 4 °C. Concentración proteínas totales sobrenadante medida kit ácido bicinconínico (BCA) (Beyotime) según instrucciones. Buffer carga añadido muestras proteicas, hervidas 95 °C 15 min. Para Western blotting, 10 μL preparación proteica cargada gel SDS-PAGE 12,5% (EpiZyme Inc., Cambridge, MA, USA) electroforesis 120 V 1 h, electro-transferida membrana polivinilidenodifluoruro (PVDF) 250 mA 2 h. Membranas bloqueadas 5-10% leche desnatada no grasa TBST 1 h agitador temperatura ambiente, incubadas anticuerpo primario diluido buffer dilución (Beyotime) 4 °C overnight. Luego, anticuerpo secundario conjugado fluorescente diluido buffer dilución añadido membranas tras tres lavados TBST 5 min, incubadas temperatura ambiente 1 h oscuridad. Bandas proteicas detectadas sistema imagen fluorescencia infrarroja dos colores (Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, USA). Particularmente, si bandas proteína referencia interna unificadas, membrana despojada y re-sondeada otro anticuerpo primario, mismo proceso. Usamos anticuerpo GAPDH referencia interna normalizar expresión proteica, otros anticuerpos primarios: anti-vinculina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-FAK (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-Runx2 (1:1000, Cell Signaling Technology), anti-RhoA (1:1000, Cell Signaling Technology), anti-F-actina (1:500, Abcam), anti-Osx (1:500, Abcam), anti-pYAP (1:1000, Cell Signaling Technology). Anticuerpos secundarios: anti-ratón IgG H&L cabra (IRDye® 680RD, 1:5000, Abcam) y anti-conejo IgG H&L cabra (IRDye® 680RD, 1:5000, Abcam).

PCR Cuantitativo Tiempo Real

PCR cuantitativo tiempo real día 7 evaluar expresión génica factor transcripción runt-relacionado 2 (Runx2), Osterix (Osx), Alp, osteocalcina (OCN), RhoA, YAP, TAZ, vinculina (VCL), quinasa adhesión focal (FAK), leucemia megacarioblástica 1 (MKL1) en células medio osteogénico nanotubos TiO₂. RNA total extraído células kit Total RNA (R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA). Concentración y pureza RNA determinadas densidad óptica longitud onda 260, solo muestras con ratios A260/280 y A260/230 >1,8 analizadas. RNA retro-transcrito cDNA kit qScript cDNA Synthesis (Takara, Shiga, Japan) según instrucciones. PCR tiempo real realizado SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara) sistema QuantStudio 6 Flex (Life Technologies). GAPDH gen housekeeping referencia interna. Datos analizados método comparativo Ct (2^-ΔΔCt) expresados cambios plegados vs control. Secuencias primers listadas Tabla 1.

Análisis Estadístico

Todos datos representativos al menos tres experimentos independientes triplicados salvo indicación. Datos expresados media ± desviación estándar (DE). Diferencias entre grupos evaluadas ANOVA unidireccional seguida prueba Student-Newman-Keuls post-hoc o prueba t Student. Valores P < 0,05 significativos.

Resultados

Caracterización Superficial

Para fabricar nanotopografía, nanotubos TiO₂ formados sustrato titanio puro por equipo oxidación anódica diferentes voltajes constantes (30, 40, 50, 60, 70 V) 1 h (Fig. 1). Array uniformemente distribuido nanotubos autoensamblados observado SEM. Vistas lateral y superior nanotubos Fig. 2a, b. Altura nanotubos todas muestras ~2 μm, diámetros internos ~74 nm (30 V), 92 nm (40 V), 112 nm (50 V), 128 nm (60 V), 148 nm (70 V) (Fig. 2c). Indicó altura relacionada tiempo oxidación anódica, diámetro interno relacionado voltaje. EDS analizó composición elemental nanotubos: solo O y Ti (Fig. 2d, e). AFM detectó estructuras nanotubulares y midió desviación media aritmética perfil nanotubos como rugosidad superficial (Ra) (Fig. 2f). Datos mostraron rugosidad superficial nanotubos aumentaba al aumentar diámetro (voltaje oxidación anódica) (Fig. 2g).

Nanotubos TiO₂ Inducen Diferenciación Osteogénica CMMs

Tras 7 días osteoinducción, tinción ALP evaluó diferenciación osteogénica CMMs. Resultados mostraron CMMs en nanotubos TiO₂ mayor actividad ALP que células sustrato titanio liso (control) (Fig. 3a). Análisis estadístico área tinción demostró capacidad nanotubos inducir diferenciación osteogénica significativamente mejorada vs control. Observamos tendencia: dentro rango diámetro experimento, mayor diámetro nanotubos TiO₂, mayor capacidad inducir diferenciación osteogénica (Fig. 3b). Grupo 70 V usado experimentos subsiguientes para mostrar mejor resultados. Analizamos expresión génica osteogénica días 3 y 7. CMMs en nanotubos TiO₂ 3 y 7 días mostraron promoción significativa expresión genes osteogénicos (RUNX2, ALP, OCN, OSX) vs control (Fig. 3d-g). Western blot confirmó expresión proteica RUNX2 y OSX aumentó tras 7 días osteoinducción (Fig. 3c). Interesantemente, F-actina se upreguló en grupo nanotubos TiO₂. Por tanto, nanotubos TiO₂ dirigieron CMMs hacia diferenciación osteoblasta, relacionado diámetro nanotubos. Resultados también sugirieron involucramiento F-actina.

F-actina Media Diferenciación Osteoblasta CMMs en Nanotubos TiO₂

Para explorar si F-actina involucrada en diferenciación inducida nanotopografía, usamos dos reactivos: jasplakinolida (Jasp) y citocinasina D (Cyto D), regular polimerización F-actina positiva y negativamente. Fotomicrografías confocales tinción Rodamina-Faloidina mostraron F-actina grupo Cyto D casi despolimerizada, estructuras fibrosas rara vez vistas, mientras Jasp estabilizó y polimerizó F-actina, verificado por estructuras haz más distintas y brillantes que control (Fig. 5a). Además, Western blot confirmó expresión proteica F-actina afectada, probando Cyto D y Jasp actuaron como esperado (Fig. 5b). Ensayo proliferación mostró Cyto D inhibió significativamente proliferación, mientras Jasp promovió crecimiento (Fig. 4a). Resultados conteo celular concordaron (Fig. 4b).

Evaluamos capacidad CMMs diferenciarse osteoblastos investigar si F-actina medió proceso. Detectamos ALP marcador temprano osteogénesis. Comparado control, Cyto D redujo expresión ALP y actividad, mientras Jasp upreguló (Fig. 4c, d). Consistente, Jasp aumentó niveles proteicos RUNX2 y OSX, Cyto D efecto opuesto (Fig. 4c). De acuerdo, niveles ARNm genes osteo-específicos (RUNX2, ALP, OCN, OSX) mostraron misma tendencia tras tratamiento (Fig. 4e-h). Estos datos indicaron F-actina jugó papel importante en diferenciación osteogénica CMMs inducida nanotubos TiO₂. Promover despolimerización F-actina inhibió diferenciación osteoblasta inducida nanotopografía, mientras estabilización y polimerización F-actina mejoró diferenciación osteoblasta.

F-actina Regula Diferenciación Osteoblasta CMMs en Nanotubos TiO₂ mediante MKL1 y YAP/TAZ

Para diseccionar mecanismo subyacente involucrando F-actina en regulación destino CMMs, investigamos proteínas/moléculas que interactúan directamente F-actina o afectan polimerización. Primero, identificamos cómo nanotopografía afectó equilibrio F-actina/G-actina. Nanotubos TiO₂ como señal física difieren señales químicas permeables membrana y deben usar componentes membrana celular transmitir estímulos células. Evidencia indica complejo adhesión focal, incluyendo integrina, talina, quinasa adhesión focal (FAK), vinculina (VCL), tensina, otras proteínas, funciona como portador señal, informando células condición matriz extracelular (MEC) afectando comportamiento biológico [22, 23]. Más importante, F-actina se une integrinas a través complejos adhesión focal, formando enlaces mecánicos entre haces actina intracelulares y MEC [24]. Analizamos expresión componentes complejo adhesión focal. Resultados mostraron expresión proteica y ARNm VCL y FAK consistentes con cambio F-actina, indicando complejo adhesión focal involucrado en diferenciación osteogénica CMMs inducida nanotubos TiO₂ (Figs. 5b, 6a, b). Además, RhoA, pequeña GTPasa familia Rho GTPasas, upregulada grupo Jasp e inhibida Cyto D (Figs. 5b, 6a, b). RhoA importante molécula transducción señal upstream vía MAPK, regulada por FAK [25, 26]. Función principal RhoA promover polimerización y estabilidad fibras estrés (F-actina) y ensamblaje complejo adhesión focal [27]. Juntos, datos sugirieron nanotubos TiO₂ influyen polimerización F-actina mediante complejo adhesión focal y RhoA.

Pero cómo F-actina regula destino celular? La mayoría estudios demostraron F-actina involucrada migración, división, endocitosis, especialmente invasión células tumorales [28-30]. Pocos sugirieron F-actina también regula diferenciación, y menos su mecanismo molecular específico [31, 32]. Buscamos artículos mencionando cambios F-actina y encontramos YAP/TAZ, dos coactivadores transcripcionales estrechamente relacionados vía señalización Hippo, que se desplazan entre citoplasma y núcleo, pueden servir como mecanotransductores regulando diferenciación CMMs [33-35]. Además, MKL1, regulador clave diferenciación células musculares lisas, que interactúa factor transcripción factor respuesta sérica, puede unir G-actina y circular entre citoplasma y núcleo [21, 36]. Nuestros resultados identificaron involucramiento YAP/TAZ y MKL1 en diferenciación osteoblasta inducida nanotubos mediada F-actina (Figs. 5b, 6d-f). Interesantemente, expresión proteica YAP fosforilada mostró tendencia opuesta, indicando no solo expresión YAP cambió, sino fosforilación YAP también cambió por Cyto D y Jasp (Fig. 5b). Resultado consistente con reporte que fosforilación YAP/TAZ secuestra citoplasma [35].

En resumen, resultados demostraron preliminarmente F-actina regula diferenciación osteoblasta CMMs nanotubos TiO₂ mediante MKL1 y YAP/TAZ (Fig. 7).

Discusión

Titanio y aleaciones son materiales metálicos más usados implantes ortopédicos clínicos por buenas propiedades titanio [3]. Sin embargo, aflojamiento aséptico sigue problema urgente, clave probablemente en mejorar integración implante-hueso huésped. Estudios previos mostraron recubrimiento y modificación superficie o inmovilización moléculas biofuncionales benefician osteointegración [37]. Recientemente, topografía superficial implantes atrajo atención investigadores gracias a estudios respuesta célula señales físicas [9-11, 13, 38]. En este estudio, demostramos capacidad nanotubos promover diferenciación osteogénica CMMs, capacidad mejorada con diámetro interno creciente nanotubos (30-70 V). Esto guiará diámetro nanotubos superficie implantes.

Como estructura topográfica, nanotubos primero cambian propiedades físicas material: capacidad adsorción, conductividad eléctrica/térmica. Estas propiedades determinan aplicación campo industrial. Por ejemplo, transformadores alto voltaje necesitan material aislamiento, usualmente aceite transformador o gas aislamiento. Cuando aislamiento falla por sobrecalentamiento y descarga parcial, ocurrirá accidente descarga grave. Por tanto, necesario método efectivo detectar concentración y tipos gases disueltos o componentes descomposición gas aislamiento transformador para monitorear estado operativo [8, 39-41]. Enfoque tradicional buscar materiales buena adsorción gas elementos transición, ricos electrones d, como Pd(111) [39]. Hoy, nanotubos ampliamente estudiados por buenas propiedades adsorción gas. He et al. encontraron CuO-BNNT adecuado adsorción C₂H₂ por adsorción más fuerte [8]. Mientras, TiO₂ puede ser material gas-sensible. Gui et al. encontraron Co-dopado TiO₂ mejoró capacidad adsorción gas y exhibió superior capacidad adsorción y cambio conductividad hacia C₂H₄ [40]. Consistente, grafeno dopado Mn exhibió conductividad mejorada y capacidad superior detección C₂H₂ y CO vs grafeno prístino [41]. Investigación arriba indica nanotubos TiO₂ preparados en experimento tienen aplicación potencial monitoreo estado operativo transformador. Sin embargo, capacidad adsorción y conductividad eléctrica nanotubos a gases necesita estudio adicional, especialmente si propiedades mejoran tras dopaje elementos transición (ej. Mn).

Además cambiar propiedades físicas superficie, morfología nanoescala afecta comportamiento biológico células adheridas. Células primero adhieren superficie material, luego migran, proliferan, diferencian. Comparado superficie plana, estructura hueca nanotubos proporciona menos sitios adhesión células. Para que células adhieran establemente superficie nanotubo y mantengan equilibrio biomecánico intracelular, complejo adhesión focal comienza ensamblar y madurar, F-actina se vuelve fuerte y estable.

F-actina, polímero lineal microfilamento monómeros G-actina, uno tres componentes principales citoesqueleto. Como estructura carga mecánica, F-actina generalmente creída involucrada división, migración, endocitosis, invasión células tumorales [28-30], pero estudios recientes mostraron también afecta diferenciación [31-33, 36]. Por ejemplo, despolimerización citoesqueleto actina por simvastatina induce diferenciación condrocitos [31], despolimerización actina mejora diferenciación adipogénica células estromales humanas [32]. Nuestros resultados revelaron que, vs control, CMMs en nanotubos tenían mayores niveles F-actina y estructura fibrosa más obvia. Mientras, promoción polimerización F-actina por Jasp mejoró diferenciación osteogénica, mientras despolimerización F-actina inhibió diferenciación osteogénica, sugiriendo F-actina media diferenciación osteoblasta CMMs inducida nanotubos TiO₂.

F-actina regulada por Rho GTPasas, miembros superfamilia Ras [23, 42], Rho induce reorganización actina al menos dos efectores, ROCK y Dia. ROCK activado uniéndose Rho-GTP, entonces cadena ligera miosina (MLC), sustrato ROCK, juega papel importante ensamblaje F-actina. ROCK inhibe actividad fosfatasa MLC, aumentando fosforilación MLC, estimulando actividad ATPasa miosina II y promoviendo ensamblaje F-actina. Además, ROCK también blanco quinasa LIM (LIMK). LIMK fosforilado inactiva cofilina fosforilación, que desensambla F-actina estado activo. Otro efector Dia, miembro familia proteínas homología formina (FH) con dos dominios FH. Dominios contienen motivos ricos prolina unen proteína unión G-actina, profilina. Interacción contribuye polimerización actina y organización F-actina [42]. Detectamos RhoA, una Rho GTPasa, expresión consistente nivel F-actina. Sin embargo, no pudimos describir claramente cómo nanotubos regulan expresión RhoA, porque muchos otros reguladores: señalización integrina, otros receptores adhesión, receptores acoplados proteína G (GPCRs), factores solubles LPA, señalización receptor tirosina quinasa, etc. [43].

Sabiendo F-actina regulada RhoA, preguntamos papel adhesión focal en proceso, porque complejos adhesión focal, conteniendo integrinas, talina, vinculina, paxilina, quinasa adhesión focal (FAK), se forman y maduran cuando células adhieren superficie nanotubos. Integrinas heterodímeros transmembrana acoplan MEC otras proteínas adhesión focal facilitando adhesión celular. No solo actúan como ganchos sino transmiten señales críticas naturaleza entorno, que junto otras señales como EGFR, impulsan célula tomar decisiones comportamientos biológicos. Señales transmitidas F-actina, directamente conectada complejos adhesión focal. Por un lado, morfología nanoescala causa ensamblaje y maduración complejo adhesión focal. Por otro, quinasas como FAK y familia Src reclutan moléculas como CRK auto-regular ensamblaje y maduración complejos adhesión focal [44-46]. Nuestros resultados demostraron formación y maduración complejos adhesión focal deteriorada por despolimerización F-actina, sugiriendo retroalimentación complejos adhesión focal a ensamblaje actina según reportes.

No debe ignorarse que proteínas complejos adhesión focal tienen función transducción señal [47]. Es decir, nanotubos pueden regular directamente expresión génica cascadas señal, y F-actina solo participa o afectada por proceso. Por instancia, complejo doble quinasa FAK/Src regula Rho GTPasas como RhoA. Esto muestra nanotubos regulan RhoA mediante integrinas y complejo FAK/Src. Además Src, proteína quinasa tirosina no receptora, activa Ras (pequeña GTPasa) fosforilando FAK residuo tirosina 925 [47, 48]. Ras activa numerosas vías bioquímicas, incluyendo MAPK bien estudiada y PI3K/AKT/mTOR. En MAPK, Ras activa c-Raf, seguido quinasa proteína activada mitógeno (MAP2K) y luego MAPK1/2, también ERK. ERK a su vez activa factores transcripción como factor respuesta sérica (SRF) y c-Myc involucrados regulación crecimiento y diferenciación [49]. Además, Runx2, factor transcripción clave diferenciación osteogénica, también regulado por ERK [50], y estudio previo confirmó tensión mecánica promueve diferenciación osteogénica BMSCs vía FAK-Erk1/2-Runx2 [17]. Por tanto, no descartamos ERK juegue papel diferenciación osteogénica inducida nanotubos, más estudio necesario.

¿Cuál exactamente papel F-actina induciendo diferenciación nanotubos, porque su cambio afecta diferenciación? Una posibilidad: cambio ensamblaje F-actina regula inversamente nivel FAK induciendo diferenciación osteogénica vía FAK-Erk1/2-Runx2 descrito, porque en resultados, complejos adhesión focal y polimerización actina mostraron mismas tendencias cambio, indicando actúan como conjunto respuesta entorno extracelular. Otras posibilidades existen, artículos muestran MKL1 y YAP/TAZ actúan downstream equilibrio dinámico actina [20, 51-54]. Ambos se desplazan citoplasma-núcleo, pueden ayudar transducir señales citoesqueleto a núcleo.

MKL1, también factor transcripción relacionado miocardina A, sensible cambios niveles G-actina citoplasmática. Cuando niveles G-actina monomérica citoplasmática aumentan, G-actina monomérica une MKL1 impidiendo unión SRF y activación transcripción. Genes diana SRF incluyen actinas como actina músculo liso (SMA) y otras proteínas unión actina, genes inmediatos tempranos c-fos, egr1. Estudios recientes demostraron cambiar actividad SRF regula adipogénesis activando factor transcripción adipogénesis receptor proliferador activado peroxisoma γ (PPARγ), y regula formación ósea vía señalización IGF-1 y Runx2 [55, 56].

YAP y TAZ coactivadores transcripcionales vía señalización Hippo, identificada importante vía reguladora restringe proliferación celular, controlando tamaño órgano y morfogénesis [20]. Genes supresores tumorales grandes 1 y 2 (LATS1/2) fosforilan, creando sitio unión proteínas 14-3-3, cuya unión impide importación nuclear [53, 54]. Consecuentemente, formas fosforiladas YAP/TAZ secuestradas citoplasma, impidiendo expresión genes como Ctgf, Areg. Además, estudios mostraron YAP/TAZ interactúan T-box 5 (TBX5), RUNX2, p73 regular expresión génica [57-59]. Además, adhesión célula proteínas matriz demostró desencadenar localización nuclear YAP vía eje integrina/FAK/Src. En nuestro estudio, resultados sugirieron esta vía posiblemente involucrada diferenciación inducida nanotubos. Más estudio mediadores downstream eje integrina/FAK/Src necesario clarificar mecanismo específico.

Por otro lado, más estudios ilustran F-actina interactúa señalización Hippo, inhibiendo fosforilación YAP [54, 60], consistente con resultados experimentales: promover polimerización F-actina reduce expresión YAP fosforilada. Hipotetizamos ATP involucrado transformación G-actina/F-actina también juega papel importante fosforilación YAP, por estudiar.

Entendiendo mecanismos moleculares posibles, intentamos explicar fenómenos experimentales. Resultados revelaron: mayor diámetro nanotubos, mayor capacidad promover diferenciación osteogénica. Consiste con investigación previa [61, 62]. Razón: mayor diámetro, menos sitios adhesión proporcionan a células, mayor ensamblaje y maduración complejos adhesión focal. Junto, fibras estrés F-actina mayor fuerza y estabilidad. Estas estructuras mejoran señalización promueve diferenciación osteogénica. Previsiblemente, efecto reducido significativamente cuando nanotubos demasiado grandes diámetro, dificultando adhesión células [12]. Similarmente, altura inconsistente nanotubos resulta cambio sitio adhesión y reorganización citoesqueleto, afectando diferenciación. Intrigantemente, incluso materiales superficie plana sin modificación nanotubos inducen cambios diferenciación. Estudios demostraron formación adhesión focal y organización fibras estrés reguladas por rigidez sustrato [63-65], YAP/TAZ también papel importante. Por tanto, eje integrinas-FA (adhesiones focales)-F-actina juega papel transducción señales físicas a químicas intracelulares.

En resumen, resultados demostraron F-actina regula diferenciación osteoblasta CMMs nanotubos TiO₂ mediante MKL1 y YAP/TAZ, cuyos genes diana explican parcialmente proliferación y diferenciación CMMs. Sabemos no hay cambio único red señal y cualquier cambio regulado por numerosas moléculas y proteínas. Un comportamiento biológico debe ser resultado regulación serie vías señalización. Nanotubos inducen diferenciación celular desencadenando red compleja señales: integrinas, proteínas complejos adhesión focal, FAK, Src, Rho GTPasa, vía MAPK, vía Hippo, otras vías reportadas. Al menos tan importante, muchos ciclos señal en red y señal downstream puede regular upstream vía retroalimentación. En estudio, encontramos vinculina y FAK reguladas hacia atrás por ensamblaje F-actina, aumentando incertidumbre función molecular. Más detalles mecanismo molecular esperan estudio.

Conclusiones

Nuestros resultados mostraron nanotubos TiO₂ promovieron diferenciación osteogénica CMMs, capacidad mejorada con diámetro creciente nanotubos en rango (30-70 V). F-actina medió diferenciación celular inducida nanotubos mediante MKL1 y YAP/TAZ, proporcionando nueva perspectiva estudio diferenciación celular.