El miR-133a exosomal de células madre de médula ósea mitiga fibrosis y EMT en miocarditis viral mediante supresión de MAML1

Resumen

La miocarditis es una enfermedad caracterizada por inflamación localizada o difusa del miocardio sin tratamiento eficiente. Este estudio exploró el mecanismo regulador del microRNA-133 (miR-133) secretado desde exosomas derivados de células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC-Exo) sobre fibrosis miocárdica y transición epitelio-mesénquima (EMT) en ratas con miocarditis viral (VMC) a través de la regulación de mastermind-like 1 (MAML1). Las BMSCs en ratas se aislaron y cultivaron para identificar su fenotipo inmunológico y capacidad osteogénica y adipogénica, y los BMSC-Exo se extrajeron e identificaron. Los exosomas se obtuvieron mediante ultracentrifugación, los cuales fueron identificados por microscopio electrónico de transmisión y análisis de western blot. Las ratas fueron inyectadas con virus Coxsackie B3 para preparación del modelo de VMC, y los cardiomiocitos se aislaron, cultivaron y agruparon de la misma manera que los experimentos con animales (NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo). Se realizaron experimentos in vivo e in vitro para determinar los roles del miR-133a exosomal y MAML1 en inflamación, apoptosis, EMT, fibrosis y viabilidad celular. La relación diana entre miR-133a y MAML1 se verificó mediante ensayo de gen reportero de luciferasa dual. Los BMSC-Exo aumentaron la expresión de miR-133a en ratas con VMC y mejoraron eficazmente la función cardíaca y la fibrosis miocárdica en ratas con VMC, aumentaron la viabilidad de cardiomiocitos e inhibieron el proceso de EMT. El miR-133a elevado en exosomas fortaleció las mejoras. El miR-133a silenciado revirtió eficazmente los efectos de los BMSC-Exo en ratas con VMC. El miR-133a tuvo como diana a MAML1. La inhibición de MAML1 mejoró la función cardíaca y la fibrosis miocárdica en ratas con VMC y pudo revertir el efecto de exosomas con miR-133a silenciado en ratas con VMC. Nuestro estudio sugiere que el miR-133a exosomal elevado suprime la fibrosis miocárdica y la EMT en ratas con VMC mediante la regulación negativa de MAML1, inhibiendo así la progresión de la miocarditis.

Introducción

La miocarditis se considera una enfermedad inflamatoria de las células musculares del corazón [1]. La miocarditis es obviamente más frecuente en hombres en contraste con mujeres [2]. La miocarditis viral (VMC) es un factor principal que conduce a cardiomiopatía dilatada (DCM) y muerte súbita en jóvenes [3]. El desempeño clínico de la miocarditis es variado, desde estados asintomáticos con signos y síntomas ambiguos hasta destrucción miocárdica grave por virus y células inmunes sufriendo shock cardiogénico y arritmias [1]. La miocarditis puede ser inducida por una variedad de elementos infecciosos, consistiendo en virus, bacterias, Chlamydia, rickettsia, hongos y protozoos, junto con inductores no infecciosos. Entre los cuales, la infección viral ha sido la causa más común, especialmente en niños [4]. El virus Coxsackie B3 (CVB3), como el virus más crucial que conduce a miocarditis, puede resultar en respuesta de estrés oxidativo y apoptosis en la patogénesis de VMC, pero no se ha reportado tratamiento especial de VMC aún [5]. Además, la patogénesis de VMC no está bien documentada, y un tratamiento clínico exacto también falta [3]. Por tanto, se necesitan urgentemente nuevos blancos para mejorar el pronóstico de la enfermedad.

Los microRNAs (miRNAs) son RNAs no codificantes endógenos que pueden regular la expresión de genes codificantes de proteínas [6]. El miR-133a, como uno de los miRNAs cardíaco-específicos, está implicado en el desarrollo del corazón y algunas enfermedades cardiovasculares, conteniendo infarto de miocardio (IM) [7]. Además, el miR-133a es el que se expresa aberrantemente en cardiomiopatía de Chagas crónica [8]. Además, el nivel de miR-133a en miocardio está conectado con inflamación, función ventricular izquierda y desenlace clínico en cardiomiopatía inflamatoria [9]. Los miRNAs se encontraron en exosomas derivados de células masto de ratón y humano [10]. Los exosomas, vesículas nanosizadas liberadas por la mayoría de tipos de células se encuentran en diferentes fluidos biológicos [11]. Los exosomas pueden transferir su carga a células receptoras, lo que se ha mostrado que cambia la composición bioquímica y vías de señalización de las células receptoras [12, 13]. La evidencia ha mostrado que los miRNAs exosomales cambiados están conectados con la patogénesis de miocarditis inducida por CVB3 [14]. Se ha abordado que el miR-125b-5p exosomal de células madre mesenquimales de médula ósea condicionadas por hipoxia reduce la apoptosis de cardiomiocitos y mejora la reparación cardíaca isquémica [15]. Además, el miR-25-3p exosomal de MSCs alivia el IM mediante la reducción de apoptosis de cardiomiocitos y respuesta inflamatoria [16]. De interés, el miR-133a cardíaco-expresado exosomal está conectado a la troponina cardíaca-troponina-I cardíaca [17]. Mastermind-like 1 (MAML1) fue un gen downstream cruzado de miR-133a en nuestro estudio que se ha reportado involucrado en lesión de isquemia/reperfusión (I/R) miocárdica [18]. También, un estudio reciente ha mencionado que el knockdown de MAML1 posee función anti-fibrótica en fibrosis hepática [19].

Iluminados por estudios previos, se preguntó si el miR-133 derivado de exosomas de BMSCs podría mediar la miocarditis. Por tanto, este estudio se inició con la hipótesis de que el miR-133 transportado por exosoma derivado de BMSCs (BMSC-Exo) alivia la fibrosis miocárdica y la transición epitelio-mesénquima (EMT) en ratas con VMC a través de la regulación de MAML1.

Materiales y Métodos

Aprobación Ética

El estudio fue permitido por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Cuarto Hospital Afiliado de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Los animales fueron tratados humanamente.

Aislamiento de BMSCs

Los animales experimentales fueron ratas macho Sprague-Dawley (SD) maduras de grado específico libre de patógenos (SPF) (Centro de Animales Experimentales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Zhejiang, China). Las ratas fueron eutanasiaadas por inyección intraperitoneal con pentobarbital sódico y esterilizadas con alcohol 75%. El fémur y la tibia se sacaron en una mesa ultra-limpia, el músculo y tejidos conectivos se removieron, y la cavidad de médula se enjuagó repetidamente con medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) de baja glucosa. El líquido se centrifugó para recoger los precipitados que se re-suspendieron e incubaron por 24 h (el medio se cambió cada 2-3 d). Cuando crecieron a la fase logarítmica, las BMSCs se desprendieron con 0.25% tripsina (Gibco, Carlsbad, California, EE. UU.), centrifugaron y re-suspendieron en solución de cultivo MSC (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, China). La suspensión se pasó a una ratio de 1:2. La operación anterior se repitió, y las BMSCs de 4to paso se usaron para experimentos subsiguientes.

Identificación de BMSCs

Los antígenos de superficie de las BMSCs de 4to paso en crecimiento logarítmico fueron identificados por citometría de flujo. Las BMSCs se desprendieron con 0.25% tripsina (1 mL) conteniendo ácido etilendiaminotetraacético, centrifugaron, re-suspendieron con solución salina fosfatada (PBS) apropiada y centrifugaron a 151 g. Las BMSCs fueron luego re-suspendidas con PBS conteniendo 2% suero bovino fetal (FBS) fresco (Gibco) para hacer una suspensión de célula única. Anticuerpos monoclonales FITC-CD34, PE-CD29 y PE-CD44 (5 µL cada uno, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) se incubaron con la suspensión celular (100 µL), centrifugaron a 151 g, re-suspendieron con 500 µL PBS conteniendo 1% paraformaldehído y fijaron por 30 min. Los marcadores de fondo fueron identificados vía uso de anticuerpos monoclonales del control de homotipo.

Citometría de flujo: la suspensión de célula única fue fijada y centrifugada a 151 g. Luego las BMSCs se re-suspendieron con PBS conteniendo 1% paraformaldehído, se probaron en el citómetro de flujo MACS Quart y se analizaron por el software correspondiente.

Inducción de osteogénesis y adipogénesis de BMSCs

Las BMSCs en el 4to paso se sembraron en placas de 6 pozos con 200 células/mL. La solución de inducción de osteoblastos y solución de inducción adipogénica (Cyagen Biosciences Inc.) se añadieron a BMSCs de 60-70% confluencia. Las BMSCs en otros dos pozos no se añadieron con líquidos de inducción como controles. Las BMSCs se indujeron por 14 días y se fijaron con 4% paraformaldehído. Luego los osteoblastos y adipocitos diferenciados se implementaron con tinción de rojo alizarina y tinción de rojo aceite O (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, China), y se observaron bajo microscopio.

Aislamiento e identificación de exosomas

Las BMSCs en el 4to paso se cultivaron por 48 h para cosechar el sobrenadante que luego se centrifugó (800 g y 2000 g), filtró con membranas de filtro 0.22 µm y 100,000 MW, y centrifugó (100,000 g) para recoger los precipitados. Luego, los precipitados se re-suspendieron con PBS, centrifugaron a 100,000 g nuevamente para obtener precipitación de exosomas. La suspensión de BMSC-Exo en PBS fue sometida a detección de concentración por ácido bicinconínico (BCA) y detección de proteínas marcadoras de exosomas (CD63, CD81 y CD9) por análisis de western blot (Proteintech, Chicago, IL, EE. UU.).

Infección por adenovirus recombinante media modificación génica de miR-133a en BMSCs

Las BMSCs se pasaron durante la noche. El control normal (cantidad igual de PBS), el control negativo de miR-133a (NC), la sobre-expresión de miR-133a (Ad-miR-133a) y la baja expresión de miR-133a (Adas-miR-133a) (Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) se transfirieron a BMSCs de acuerdo con 100 multiplicidad de infección (MOI). Las BMSCs se cultivaron, y los exosomas correspondientes (NC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo y Adas-miR-133a^Exo) se obtuvieron mediante ultracentrifugación [20].

Establecimiento del modelo de VMC en ratas y agrupamiento de animales experimentales

Ratas macho maduras de grado SPF SD se dividieron en 10 grupos, con ocho ratas cada una. El virus Coxsackie B3 (CVB3) fue proporcionado por el Instituto de Biotecnología Médica, Academia China de Ciencias Médicas (Beijing, China).

CVB3 (10 mg/kg) se inyectó intraperitonealmente en ratas mientras PBS o BMSC-Exo (100 µg) se inyectó a través de la vena cola. Ratas normales para controles se inyectaron con solución de cultivo de CVB3 y PBS. Ratas inyectadas con 10 mg/kg CVB3 fueron further inyectadas con PBS, MSC^exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo, si-NC o si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, China).

Las ratas fueron inyectadas continuamente por 7 días y se obtuvo sangre del globo ocular. La sangre se centrifugó y el suero se recogió, sub-empaquetó y almacenó a -20 °C. Después de que las ratas fueron eutanasiaadas, se tomaron especímenes de corazón, se fijaron con 10% formaldehído, se deshidrataron con alcohol gradiente, se clarificaron con xileno y se embebieron con parafina, seccionaron para observación histológica. Una parte de secciones se colocaron a -80 °C como materiales de experimentos de biología molecular.

Ecocardiografía

En el 7mo día después de la inyección del virus, las ratas fueron inyectadas intraperitonealmente con pentobarbital sódico 25 mg/kg. Después de anestesia completa, la derivación de miembros del electrocardiógrafo conectada con la aguja de electrodo se insertó subcutáneamente en los extremos de los miembros de las ratas, y se registró el electrocardiograma de derivación de miembros. Luego, las ratas se fijaron en posición supina ligeramente hacia la izquierda, el pecho se depiló, y la derivación II del electrocardiograma se conectó para obtener el espectro Doppler del pulso de flujo sanguíneo de la aorta en la sección de cuatro cámaras parasternal. Los indicadores incluyeron grosor de pared posterior ventricular izquierda (LVPW), diámetro telesistólico ventricular izquierdo (LVIDs), fracción de acortamiento (FS) y fracción de eyección ventricular izquierda (LVEF).

Tinción Hematoxilina-Eosina (HE)

Los tejidos se fijaron con 4% paraformaldehído, deshidrataron, clarificaron y embebieron con parafina. Luego las secciones de 4-µm se desenceraron, teñieron con hematoxilina (Servicebio, Wuhan, China), diferenciaron con 1% alcohol de ácido clorhídrico, volvieron a azul, y teñieron con eosina, deshidrataron, clarificaron con xileno, sellaron con goma neutra, y observaron bajo microscopio óptico (Olympus, Tokyo, Japón).

Tinción de Colágeno Masson

Las secciones de parafina se desenceraron, teñieron con hematoxilina menos de 2 min, teñieron con solución magenta Lichun, y enjuagaron rápidamente con solución de ácido acético glacial 0.5%. Luego las secciones se tiñeron con solución acuosa de fosfato de aluminio 1%, tiñeron de rojo oscuro a rojo brillante a rosa, y observaron bajo microscopio. Luego las secciones se tiñeron con azul anilina (Pulande), deshidrataron convencionalmente con xileno y sellaron. El software de análisis de imagen médica Image-Proplus 6.0 se usó para medir el área de tinción positiva de fibras colágenas, y fracción de volumen de colágeno (CVF) = área colágena/área total de campo. La ubicación y color de tinción de fibras colágenas se distinguieron (los cardiomiocitos eran rojos, y las fibras colágenas eran bandas azules o estructuras homogéneas en el espacio intercelular).

Tinción TUNEL

Las secciones de parafina se desenceraron, colocaron en tampón citrato y hornearon a 350 W por 10 min. Las secciones se añadieron con 50 µL solución TUNEL, unieron con 50 µL agente de conversión-peroxidasa, desarrollaron con DAB, y observaron bajo microscopio. Las secciones se pusieron en hematoxilina, sumergieron con etanol 95% I-II, unieron con etanol anhidro I-II, xileno I-II, y sellaron. Los resultados se analizaron bajo microscopio óptico.

Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA)

Factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interleucina (IL)-1β e IL-6 se detectaron por kits ELISA (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, China). La sangre del globo ocular se centrifugó a 604 g para recoger el suero superior. El sobrenadante obtenido por centrifugación del medio de cultivo celular se detectó en experimento celular. Hubo siete gradientes de concentración en el estándar de dilución de muestras. El pozo en blanco se unió con diluyente de muestra, y otro pozo se añadió con tetrametilbencidina (TMB), dos pozos duplicados se establecieron para cada concentración. Los pozos de muestra se unieron con 50 µL de diluyente de muestra y las muestras a su vez. Cada pozo reaccionó con 100 µL de anticuerpo primario (excepto pozo TMB) por 1 h, así como con 300 µL de 0.01 M salina tamponada con tris (TBS) y 100 µL solución de trabajo de Complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa (excepto pozo TMB). Luego cada pozo se añadió con 300 µL de 0.01 M TBS e incubó con 100 µL TMB. El valor de densidad óptica (OD) y la concentración de cada pozo se midieron inmediatamente y se dibujó la curva estándar.

Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcripción Inversa Cuantitativa (RT-qPCR)

La expresión de miR-133a, colágeno I, colágeno III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-cadherina y FSP-1 en tejidos miocárdicos y cardiomiocitos se detectó vía RT-qPCR. El RNA total se extrajo de cardiomiocitos o tejidos miocárdicos y se transcribió inversamente a cDNA vía kit de extracción de RNA (Takara, Dalian, China), y los primers RT-PCR se sintetizaron vía Invitrogen (Guangzhou, China), las secuencias se muestran en la Tabla 1. La expresión génica cuantitativa relativa se analizó usando gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o U6 como genes de control de carga según el método 2^−△△Ct.

Análisis de Western Blot

Las ratas fueron eutanasiaadas con anestesia. Los tejidos miocárdicos se congelaron y molieron en nitrógeno líquido. Luego inhibidores de proteasa fenilmetanosulfonilfluoruro solución stock se mezcló con tampón de lisis celular a una ratio de 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). Las muestras se lisiaron con solución mixta y las proteínas de las células se extrajeron. La concentración total de proteína se detectó con el kit BCA. Las muestras se mezclaron con tampón de carga 5× a 4:1, implementaron con baño de agua hirviendo por 10 min, enfriaron en hielo, y centrifugaron. La separación electroforética se realizó, y las proteínas se transfirieron a membrana de fluoruro de polivinilideno (Servicebio) con solución de transferencia eléctrica. Luego la membrana se bloqueó con 5% leche descremada en polvo, y se unió con anticuerpos primarios CD63, CD81 y CD9 (anticuerpos policlonales anti-rat conejo de Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, EE. UU., 1:1000) y GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, EE. UU., 1:1000). Luego la membrana se goteó con el anticuerpo secundario, IgG marcado con peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU., 1:1000), e inmersó en solución de reacción de quimioluminiscencia mejorada (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Con GAPDH como control de carga, las imágenes de impronta de proteínas se analizaron con software ImageJ2x.

Cultivo y paso de cardiomiocitos

Ratas SD de 3-5 días (Centro de Animales Experimentales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Zhejiang, China) se tomaron. La parte ventricular se enjuagó con solución Hank's Balanced Salt Solution preenfriada, se cortó en pedazos pequeños, y se desprendió con 0.25% tripsina. Los pedazos se añadieron con cantidad adecuada de medio completo 10% para terminación de desprendimiento y centrifugaron a 151 g. DMEM conteniendo 20% FBS se aplicó para re-suspensión celular. Los cardiomiocitos se purificaron por método de adherencia diferencial, y la tasa de supervivencia se observó vía tinción de azul tripano, los cardiomiocitos sobrevivientes se cultivaron. Después de 24 h, los cardiomiocitos se adhirieron a la pared y comenzaron a latir. Después de 72 h, las pseudopodias se expandieron.

Construcción del modelo de VMC de cardiomiocito

Los cardiomiocitos en el 4to paso en la fase de crecimiento logarítmico fueron seleccionados e infectados con MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo y Ad-miR-133a^Exo. La solución de virus CVB3 100 Tcid50 (100 µL) se añadió a las células para inducir un modelo celular de VMC. Al mismo tiempo, cantidad igual de solución de mantenimiento se añadió a las células para un control, y los exosomas correspondientes se unieron a los cardiomiocitos después de 1-h infección por 47-h cultivo.

Ensayo de Kit de Conteo Celular (CCK)-8

El kit de detección celular CCK-8 (Beyotime) se aplicó para detectar la tasa de supervivencia de cardiomiocitos. Cuando crecieron a fase logarítmica, las células se desprendieron con 0.25% tripsina, y se sembraron en placa de cultivo celular de 96 pozos a 2.5 × 10⁴ células/por pozo. Se unió con solución CCK-8 (10 µL/pozo), las células se cultivaron continuamente por 1-4 h, y el valor OD_{450 nm} se midió vía lector de microplacas.

Citometría de flujo

El método de doble tinción AnnexinV-APC/yoduro de propidio (PI) se aplicó para detectar apoptosis celular. Las células se centrifugaron, re-suspendieron con 250 µL Tampón de Unión (4 mL Tampón de Unión + 12 mL agua desionizada), y ajustaron a 1 × 10⁶ células/mL. La suspensión celular de 100 µL se añadió con 5 µL Annexin V-APC (BD Biosciences) y 5 µL solución PI (BD Biosciences), se cargaron en el citómetro de flujo, y se analizaron automáticamente por una computadora.

Ensayo de Gen Reportero de Luciferasa Dual

La secuencia de tipo salvaje (wt) o tipo mutante (mut) de la región 3'-no traducida (UTR) de MAML1 se clonó en vector pGL3-M (Promega, WI, EE. UU.), luego se generaron MAML1-3'-UTR-wt o MAML1-3'-UTR-mut. Los vectores, junto con mimético de miR-133a o NC, se co-transfirieron a cardiomiocitos vía Lipofectamine 2000. La actividad de luciferasa se probó 48 h después por el sistema de gen reportero de luciferasa dual (Promega) [21].

Ensayo de Inmunoprecipitación de RNA (RIP)

El kit RIP (Millipore, EE. UU.) se usó para detectar la unión de MAML1 y miR-133a. Las células se lisaron por tampón de radio-inmunoprecipitación (P0013B, Beyotime, Shanghai, China), centrifugaron a 1400 g e incubaron con anticuerpos para co-precipitar. Cuentas magnéticas (50 µL) se re-suspendieron en 100 µL Tampón de Lavado RIP e incubaron con 5 g anticuerpo anti-MAML1 (1 g/mL, ab155786) o IgG (1:100, ab172730). El complejo cuenta magnética-anticuerpo se re-suspendió en 900 µL Tampón de Lavado RIP, interactuó con 100 µL extracto celular, digirió con proteinasa K, y se detectó por RT-qPCR [22].

Análisis Estadístico

El software estadístico SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.) se aplicó para análisis de los datos. Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar. La prueba t se aplicó a comparaciones entre dos grupos. El análisis de varianza unidireccional (ANOVA) se usó para comparación entre grupos, y la prueba post hoc de Tukey para comparaciones pareadas. Los predictores se mantuvieron si eran significativos a un valor P de 0.05 o menor.

Resultados

Identificación de BMSCs y BMSC-Exo

Microscópicamente, las BMSCs eran fusiformes y redondeadas, y se adhirieron a la pared en un patrón de vórtice o radial (Fig. 1A). Después de tinción de rojo aceite O de inducción de adipogénesis, los gotitas lipídicas de las BMSCs de 4to paso eran rojas, y había gotitas lipídicas redondas de diferentes tamaños (Fig. 1B). Después de inducción de osteogénesis, las células expresando nódulos calcificados mostraron rojo después de tinción de rojo alizarina, y distribución desigual de nódulos calcificados y células superpuestas (Fig. 1C). La citometría de flujo manifestó que los marcadores MSC CD29 y CD44 (> 95%) se expresaron, pero el antígeno de superficie de célula madre hematopoyética CD34 (< 95%) no se expresó (Fig. 1D). Estos resultados manifestaron que las BMSCs eran de alta pureza y conformaban a estándares MSC de la Sociedad Internacional de Terapia Celular.

El microscopio electrónico de transmisión observó que los BMSC-Exos eran vesículas ovales con estructura membranosa periférica clara, diferentes tamaños, y un diámetro de 40-100 nm (Fig. 1E). El análisis de western blot demostró que los productos extraídos expresaron proteínas características de origen exosomal de CD9, CD63 y CD81 (Fig. 1F).

El miR-133a exosomal elevado mejora los síntomas de miocarditis

La transfección de BMSCs con adenovirus recombinante de miR-133a se observó (Fig. 2A). Un gran número de expresión de fluorescencia verde de NC, Ad-miR-133a y Adas-miR-133a se observaron bajo microscopio de fluorescencia invertido, indicando que el vector de adenovirus recombinante pudo transfectar eficazmente las BMSCs. Para probar la eficiencia de transfección de miR-133a, la expresión de miR-133a en BMSCs y sus exosomas se midió por RT-qPCR. Se descubrió que la up-regulación de miR-133a aumentó la expresión de miR-133a mientras la down-regulación de miR-133a disminuyó la expresión de miR-133a (Fig. 2B). Subsecuentemente, inyectamos exosomas conteniendo miR-133a en ratas. Bajo el microscopio de fluorescencia invertido, la expresión de fluorescencia verde se observó en ratas con VMC después del tratamiento de NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo o Adas-miR-133a^Exo, indicando que el vector de adenovirus recombinante infectó tejidos miocárdicos de ratas (Fig. 2C). El experimento de RT-qPCR también encontró que la expresión de miR-133a en ratas con VMC disminuyó aparentemente; la expresión de miR-133a se elevó obviamente en ratas con VMC inyectadas con Ad-miR-133a^Exo pero disminuyó en ratas con VMC inyectadas con Adas-miR-133a^Exo (Fig. 2D). En cuanto a las condiciones generales de las ratas, se observó que las condiciones generales de ratas control normales eran normales, y las características de VMC se expresaban aparentemente en ratas con VMC y ratas con VMC inyectadas con Adas-miR-133a^Exo, como pelo áspero y desordenado, disnea y poca dieta. En ratas con VMC tratadas con MSC^Exo, NC^Exo y Ad-miR-133a^Exo, estos signos mejoraron en diferentes grados. El peso de las ratas con VMC disminuyó continuamente desde 1 día después de la infección, y la inyección de MSC^Exo, NC^Exo o Ad-miR-133a^Exo aumentó el peso de las ratas. El peso de las ratas con VMC tratadas con Ad-miR-133a^Exo aumentó obviamente y el peso de las ratas con VMC inyectadas con Adas-miR-133a^Exo disminuyó claramente (Fig. 2E).

La observación de función miocárdica sugirió que (Fig. 2F), las ratas con VMC tuvieron LVPW y LVIDs aumentados, y FS y LVEF disminuidos. Después de la inyección de exosomas, LVPW y LVIDs disminuyeron, y FS y LVEF se elevaron obviamente en ratas con VMC. El tratamiento con Adas-miR-133a^Exo deterioró mientras Ad-miR-133a^Exo mejoró la función miocárdica en ratas con VMC.

El miR-133a exosomal up-regulado inhibe la inflamación en tejidos miocárdicos de ratas con VMC

La tinción HE manifestó que las fibras miocárdicas en ratas control normales estaban estrechamente arregladas y no había infiltración de células inflamatorias en el mesénquima. Los cardiomiocitos en las ratas con VMC estaban desorganizados y el mesénquima fue infiltrado por un gran número de células inflamatorias. Los cardiomiocitos en ratas con VMC inyectadas con MSC^Exo o NC^Exo estaban ordenadamente arreglados, con una pequeña cantidad de células inflamatorias infiltrando en el mesénquima. Los cardiomiocitos en ratas con VMC después del tratamiento con Adas-miR-133a^Exo estaban desordenadamente arreglados, y las células inflamatorias en el mesénquima se infiltraron. Los cardiomiocitos en ratas con VMC tratadas con Ad-miR-133a^Exo estaban ordenadamente arreglados sin infiltración obvia de células inflamatorias (Fig. 3A).

ELISA indicó que (Fig. 3B, C) los factores inflamatorios (TNF-α, IL-1β e IL-6) aumentaron obviamente en ratas con VMC. Las ratas con VMC inyectadas con Ad-miR-133a^Exo tuvieron niveles reducidos de factores inflamatorios. El tratamiento con Adas-miR-133a^Exo causó factores inflamatorios elevados en ratas con VMC.

El miR-133a exosomal elevado disminuye la CVF en tejidos miocárdicos de ratas con VMC

La tinción Masson reveló que las fibras miocárdicas en ratas normales estaban estrechamente arregladas, con casi ninguna fibra colágena azul. Después de la inyección de CVB3, los cardiomiocitos estaban hipertrofiados, con hiperplasia de tejido conectivo y un gran número de fibras colágenas azules, y la CVF se elevó obviamente. Tratadas con exosomas, las fibras miocárdicas estaban ordenadamente arregladas, la hiperplasia de tejido conectivo intercelular disminuyó, las fibras colágenas azules y la CVF disminuyeron claramente. El espacio intercelular miocárdico de ratas con VMC inyectadas con Adas-miR-133a^Exo se ensanchó, las células se agrandaron obviamente, las fibras colágenas azules y la CVF aumentaron claramente; el espacio intercelular disminuyó, la distribución de fibras colágenas azules y la CVF disminuyeron de ratas con VMC con tratamiento Ad-miR-133a^Exo (Fig. 4A, B).

El miR-133a exosomal incrementado reduce la expresión de Colágeno I, Colágeno III, TGF-β1 y CTGF en tejidos miocárdicos de ratas con VMC

El colágeno I y colágeno III son los componentes principales del colágeno, que se distribuyen principalmente en uniones celulares y membranas celulares, sustancia intercelular y citoplasma. TGF-β1 y CTGF son las proteínas distintivas de fibrosis. Los hallazgos de RT-qPCR demostraron que los niveles de expresión de mRNA de colágeno I, colágeno III, TGF-β1 y CTGF aumentaron en ratas con VMC, pero disminuyeron después del tratamiento con exosomas. Las ratas con VMC tratadas con Ad-miR-133a^Exo tuvieron niveles disminuidos de expresión de mRNA de colágeno I, colágeno III, TGF-β1 y CTGF mientras que las ratas con VMC después del tratamiento con Adas-miR-133a^Exo mostraron la situación opuesta (Fig. 5A-C).

El miR-133a exosomal up-regulado inhibe la apoptosis de cardiomiocitos en tejidos miocárdicos de ratas con VMC

La tinción TUNEL mostró que los cardiomiocitos apoptóticos eran negruzcos o marrón amarillentos con condensación nuclear. El número de células apoptóticas aumentó en ratas con VMC lo cual sería atenuado por tratamiento con exosomas. Las ratas con VMC inyectadas con Ad-miR-133a^Exo tuvieron número reducido de células apoptóticas y aquellas inyectadas con Adas-miR-133a^Exo tuvieron número aumentado de células apoptóticas (Fig. 6A, B).

El miR-133a exosomal elevado deprime la EMT en tejidos miocárdicos de ratas con VMC

E-cadherina, α-SMA y FSP-1 son indicadores clave de EMT. Los resultados de RT-qPCR demostraron que los niveles de expresión de mRNA de α-SMA y FSP-1 se elevaron y el nivel de expresión de mRNA de E-cadherina disminuyó en ratas con VMC. Además, los niveles de expresión de mRNA de α-SMA y FSP-1 se redujeron y el nivel de expresión de mRNA de E-cadherina aumentó en ratas con VMC después del tratamiento con exosomas. Los niveles de expresión de mRNA de α-SMA y FSP-1 se elevaron y el nivel de expresión de mRNA de E-cadherina disminuyó en ratas con VMC tratadas con Adas-miR-133a^Exo, mientras la expresión de estos indicadores fue opuesta en ratas con VMC inyectadas con Ad-miR-133a^Exo (Fig. 7A, B).

El miR-133a exosomal elevado deprime la inflamación de cardiomiocitos en VMC

Como resultado, la microscopía de fluorescencia capturó expresión fluorescente verde en ratas con VMC tratadas con NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo o Adas-miR-133a^Exo, indicando que el vector de adenovirus recombinante infectó cardiomiocitos de ratas (Fig. 8A). RT-qPCR y ELISA descubrieron que (Fig. 8B, D) la expresión de miR-133a se redujo y los factores inflamatorios (TNF-α, IL-1β e IL-6) aumentaron en ratas con VMC, lo cual sería revertido por tratamiento con exosomas. Las ratas con VMC tratadas con Ad-miR-133a^Exo tuvieron up-regulación de miR-133a y disminuyeron factores inflamatorios en ratas con VMC, mientras aquellas tratadas con Adas-miR-133a^Exo presentaron miR-133a disminuida y niveles aumentados de factores inflamatorios en ratas con VMC.

El miR-133a exosomal elevado promueve la viabilidad celular y reprime la apoptosis de cardiomiocitos en VMC

La apoptosis y la viabilidad celular se detectaron vía doble tinción AnnexinV-APC/PI y ensayo CCK-8. Los resultados revelaron que hubo un aumento obvio en la tasa de apoptosis, una disminución en la viabilidad celular de cardiomiocitos en ratas con VMC. El tratamiento con exosomas redujo la tasa de apoptosis y mejoró la viabilidad de cardiomiocitos. Adas-miR-133a^Exo aumentó la tasa de apoptosis y alteró la viabilidad de cardiomiocitos en ratas con VMC. El tratamiento con Ad-miR-133a^Exo funcionó con efectos opuestos en cardiomiocitos de ratas con VMC (Fig. 9A-C).

El miR-133a tiene como diana a MAML1

Se ha reportado que el miRNA-193b up-regulado reduce el daño miocárdico I/R al tener como diana a MAML1 [18]. Basándonos en eso, criamos genes downstream de miR-133a a través de sitios web de bioinformática PITA, miRanda, PicTar, microT y miRmap, y seleccionamos MAML1 como diana de miR-133a (Fig. 10A). Construimos MAML1-wt o MAML1-mut, y co-transfectamos cardiomiocitos con mimético de miR-133a o NC. Los resultados mostraron que el mimético de miR-133a redujo la actividad de luciferasa de MAML1-wt (Fig. 10B). El experimento RIP verificó además la relación diana entre miR-133a y MAML1 (Fig. 10C). La detección de RT-qPCR y Western blot de expresión de MAML1 mostró que la expresión de MAML1 disminuyó en cardiomiocitos transfecados con mimético de miR-133a (Fig. 10D, E).

La inhibición de MAML1 tiene efecto protector en ratas con miocarditis y revierte el efecto de exosomas con miR-133a inhibido en ratas con VMC

Para estudiar más el efecto de MAML1 regulado por miR-133a en ratas con VMC, inyectamos adenovirus si-MAML1 o si-NC en ratas con VMC o ratas con VMC que habían sido tratadas con exosomas con miR-133a silenciado. El éxito de la inyección se validó por RT-qPCR y Western blot (Fig. 11A, B). Los resultados manifestaron que la inyección de si-MAML1, el peso de ratas con VMC aumentó (Fig. 11C), la función cardíaca mejoró (Fig. 11D-G), la patología de tejido miocárdico y fibrosis se atenuaron (Fig. 12A-C), la inflamación sérica (Fig. 12D, E) y la apoptosis de cardiomiocitos (Fig. 13A-G) se inhibieron. Además, los efectos deletéreos de exosomas con miR-133a silenciado en ratas con VMC se revirtieron después de la inyección de si-MAML1.

Discusión

La miocarditis es una enfermedad cardíaca inflamatoria que resulta en DCM e insuficiencia cardíaca y es inducida más frecuentemente por infecciones virales como CVB3 [2]. Un estudio ha revelado que el miR-133 alivia la apoptosis de cardiomiocitos y el remodelado eléctrico en ratones con VMC [23]. Además, los miRNAs exosomales cambiados también se encuentran vinculados con la patogénesis de miocarditis inducida por CVB3 [14]. Los exosomas derivados de células progenitoras cardíacas alivian la apoptosis inducida por CVB3 mediante la restricción de la proliferación de CVB3 en VMC [24]. Este estudio exploró el mecanismo regulador del miR-133 derivado de exosomas de BMSCs sobre fibrosis miocárdica y EMT en ratas con VMC (Archivo adicional 1: Fig. 1).

El estudio encontró que la expresión de miR-133a disminuyó en VMC. Como se demostró antes, la expresión de miR-133a disminuye en IM [7]. Un estudio también ha sugerido que la expresión relativa de miR-133 en corazones de ratones con VMC es obviamente disminuida en contraste con los controles [23]. Hay algunas conexiones de miRNAs con exosomas. La expresión diferencial de exosomas y de miRNAs exosomales en enfermedad ha sido considerada como biomarcadores de enfermedad con desempeño de diagnóstico clínico no invasivo junto con sus potenciales terapéuticos [25]. Lin et al. han encontrado que el miR-133 es especialmente clasificado en exosomas derivados de células progenitoras endoteliales humanas causadas por hipoxia/reoxigenación (H/R) para aumentar la angiogénesis de fibroblastos y EMT [26]. Otro estudio ha revelado que las MSCs exhiben una comunicación con células parenquimatosas cerebrales y pueden modular el crecimiento de neuritas por transferencia de miR-133b a células neurales vía exosomas [27].

El hallazgo principal de este trabajo manifestó que el miR-133a exosomal up-regulado promovió la viabilidad celular, inhibió inflamación, apoptosis, EMT y fibrosis en ratas con VMC. Estos se ajustan bien con una investigación anterior que el silencio de miR-133a revierte la inhibición de proliferación de células de osteosarcoma MG63 inducida por polisacáridos de Astrágalo, junto con promoción de apoptosis celular [28]. Otro estudio ha revelado que el miR-133a sobre-expresado suprime angiogénesis, apoptosis, fibrosis e inflamación, mientras acelera el remodelado cardíaco terapéutico en enfermedades miocárdicas isquémicas [29]. Similar a nuestro estudio, Li et al. han declarado que el miR-133 inhibe la apoptosis de cardiomiocitos regulando la expresión de genes relacionados con apoptosis en corazones de ratones con VMC [23]. El miR-133a sobre-expresado se ha reportado que deprime la apoptosis inducida por hipoxia y fortalece la supervivencia de cardiomiocitos [30]. Mientras tanto, el miR-30a y miR-181d exosomales séricos up-regulados pueden tener potenciales para ser aplicados como biomarcadores para diagnóstico de VMC [14].

Otro hallazgo en nuestro estudio fue que el miR-133a exosomal up-regulado disminuyó la CVF, redujo la expresión de colágeno I y colágeno III en ratas con VMC. Un artículo ha elucidado que el factor de crecimiento de fibroblasto-18 liberado de una membrana de colágeno causa actividad osteoblástica participando en miR-133a down-regulado [31]. En vitro la sobre-expresión de miR-133a deprime la hipertrofia de cardiomiocitos y reduce la expresión de colágeno [32], como se evidenció en otro estudio. La CVF iguala la ratio de área de colágeno a la suma de área miocárdica y área de colágeno, y el valor medio muestra la CVF de la sección [33]. Este hallazgo también es reportado por Wang et al. que el modelo de ratones con VMC se construye exitosamente por infección de CVB3, manifestando expresión de CVF aparentemente mayor en contraste con el grupo control [34]. Además, el hallazgo es consistente con el de Ferreira et al. que demuestra que el miR-133a puede tomar un papel mayor en la modulación de expresión génica en patogénesis de cardiomiopatía de Chagas crónica, con enlace potencial como herramientas diagnósticas y pronósticas [8]. Además, la evidencia ha mostrado que el knockdown de MAML1 puede reducir la hipertrofia de cardiomiocitos pre-tratados [35]. En nuestro estudio, encontramos que MAML1 era el gen diana de miR-133a y la inhibición de MAML1 revirtió los efectos de exosomas con miR-133a silenciado en ratas con VMC. En lesión de isquemia-reperfusión miocárdica, la down-regulación de MAML1 mediada por miR-193b podría en parte reducir el infarto y enzimas miocárdicas, así como atenuar la apoptosis de cardiomiocitos [18]. También hay un reporte sugiriendo que la deficiencia de MAML1 podría aliviar la fibrogénesis hepática [19].

Conclusión

En conclusión, este presente estudio ofrece evidencia de que el miR-133a está down-regulado en ratas con VMC, y el miR-133a exosomal elevado mejora la función cardíaca y restringe la fibrosis miocárdica y la EMT en ratas con VMC, así como mejora la viabilidad y reprime la apoptosis de cardiomiocitos en VMC a través de tener como diana a MAML1. Nuestro estudio también sugiere que la inhibición de MAML1 tiene un efecto protector en ratas con miocarditis y revierte el efecto de exosomas con miR-133a inhibido en ratas con VMC. La identificación del miR-133a exosomal en fibrosis miocárdica y EMT de miocarditis puede potencialmente ampliar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la miocarditis y también tener valor clínico como un nuevo blanco molecular. Más investigaciones deben emprenderse para hacer avances en el tratamiento de esta enfermedad.

Abreviaturas

miR-133:

MicroRNA-133

BMSC-Exo:

Exosoma derivado de células madre mesenquimales de médula ósea

EMT:

Transición epitelio-mesénquima

VMC:

Miocarditis viral

CVF:

Fracción de volumen de colágeno

DCM:

Cardiomiopatía dilatada

CVB3:

Virus Coxsackie B3

miRNAs:

MicroRNAs

MI:

Infarto de miocardio

SPF:

Específico libre de patógenos

SD:

Sprague-Dawley

DMEM:

Medio Dulbecco's Modified Eagle

PBS:

Solución salina fosfatada

FBS:

Suero bovino fetal

NC:

Control negativo

MOI:

Multiplicidad de infección

LVPW:

Grosor de pared posterior ventricular izquierda

LVIDs:

Diámetro telesistólico ventricular izquierdo

LVEF:

Fracción de eyección ventricular izquierda

HE:

Hematoxilina-eosina

TUNEL:

Etiquetado de extremo nick de trifosfato de desoxiuridina biotina mediado por transferasa terminal desoxinucleotidil

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

TMB:

Tetrametilbencidina

TBS:

Salina tamponada con tris

ABC:

Complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa

OD:

Densidad óptica

RT-qPCR:

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa

GAPDH:

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

CTGF:

Factor de crecimiento de tejido conectivo

CCK:

Kit de conteo celular

PI:

Yoduro de propidio

ANOVA:

Análisis de varianza