Las nanopartículas de hidroxiapatita mejoran la osteogénesis de MSC mediante interacción con células endoteliales

Resumen

La nano-hidroxiapatita (nano-HA) ha atraído una atención sustancial en el campo de la medicina regenerativa. Las interacciones entre células endoteliales (CE) y células madre mesenquimales (CMM) son necesarias para la reconstrucción ósea, pero la manera en que nano-HA interactúa en este proceso permanece desconocida. En este estudio, investigamos la citotoxicidad y los efectos osteoinductores de nanopartículas de HA (HANP) en CMM usando un modelo de co-cultivo indirecto mediado por CE y destacamos los mecanismos subyacentes. Se encontró que a una dosis subcitotóxica, las HANP aumentaron la viabilidad y la expresión de genes osteoblásticos, así como nódulos mineralizados y producción de fosfatasa alcalina de CMM. Estos fenómenos dependieron de HIF-1α secretado por CE, que desencadenó la cascada de señalización ERK1/2. Además, se estableció un modelo matemático de linaje celular de dos etapas para analizar cuantitativamente el impacto de HIF-1α en la diferenciación osteogénica de CMM. Demostró que HIF-1α ejerció un efecto estimulador dependiente de la dosis en la tasa de diferenciación osteogénica de CMM hasta 1500 pg/mL, lo cual concordó con los resultados anteriores. Nuestros datos implicaron que las interacciones cooperativas entre HANP, CE y CMM probablemente sirven para estimular la regeneración ósea. Además, el modelo de linaje celular de dos etapas es un sistema in vitro útil para evaluar la influencia potencial de moléculas efectoras en la ingeniería de tejido óseo.

Introducción

La reconstrucción de defectos óseos causados por trauma, malformación congénita o resección quirúrgica plantea un gran desafío para la cirugía ortopédica [1]. La hidroxiapatita (HA), un cerámico bioactivo representativo, se había empleado como sustituto óseo [2]. Sin embargo, propiedades mecánicas y osteoinductivas indeseables restringen su aplicación clínica [3]. En años recientes, nano-HA ha demostrado bioactividad más óptima y mejores rendimientos mecánicos debido a sus características biomiméticas únicas y ha generado un interés significativo en campos biomédicos relacionados con la medicina regenerativa [4]. Cuando nano-HA se implanta en defectos óseos, múltiples células involucradas en la reparación ósea estarán expuestas a ella. Como tal, es necesario evaluar el comportamiento biológico de nano-HA. Varias líneas de evidencia han demostrado directamente que nanopartículas de HA (HANP) pueden ser captadas por células madre mesenquimales derivadas de jalea de Wharton del cordón umbilical humano (hWJ-MSC) y células osteoblásticas, resultando en una diferenciación osteogénica mejorada [5,6,7]. Dua et al. informaron previamente la capacidad de HANP para promover la integración de cartílago ingeniero en cartílago de novo [8]; por el contrario, HANP inhiben la capacidad angiogénica de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) [9]. En términos de salud humana, se justifica una comprensión más completa del impacto de HANP en la regeneración ósea, y las aplicaciones continuas de hueso artificial nano-ingenierado se suman a la urgencia de tales estudios.

La regeneración ósea está inevitablemente acompañada por la invasión de neovasos. Las CE son el revestimiento celular interno del sistema vascular que sirven para entregar sangre pasivamente y también juegan un papel en inducir, especificar y guiar la regeneración de órganos, así como mantener la homeostasis y el metabolismo [10, 11]. Las CMM son parte del nicho perivascular y poseen capacidades de autorrenovación y multi-diferenciación bajo la inducción de microambientes fisiológicos y bioquímicos particulares dentro de sus nichos residentes [12]. Tsai et al. encontraron que las CE pueden secretar endotelina-1 para dirigir CMM hacia diferenciación osteo- y condro-linaje [13]. Además, Saleh et al. usaron análisis de datos de microarrays para identificar proteínas secretadas por HUVEC y vías de señalización de comunicación relacionadas que interactúan con receptores unidos a membrana de CMM para mejorar la proliferación y diferenciación osteogénica [14]. En ingeniería de tejido óseo, HANP pueden entrar en contacto con neovasos y ser endocitadas por CE, lo que se ha demostrado que altera la función fisiológica de estas células [9, 15]. Esto también puede influir en las células osteoprogenitoras circundantes y afectar la reparación ósea al alterar la señalización parácrina. Sin embargo, mientras el impacto directo de HANP en CMM se ha explorado, aún falta una comprensión clara de si HANP pueden inducir indirectamente la diferenciación osteogénica de CMM a través de CE, lo cual es esencial para nuestra comprensión del efecto de HANP en la reparación ósea.

En este estudio, en un esfuerzo por obtener más conocimientos sobre los efectos biológicos de HANP en la interacción entre CE y CMM, se estableció un modelo de co-cultivo indirecto usando HUVEC y hWJ-MSC. Al utilizar este sistema, se evaluaron la citotoxicidad y los efectos osteoinductores de HANP en hWJ-MSC a través de señalización parácrina mediada por HUVEC. Para identificar factores clave que influyen en las interacciones HANP-CE-CMM, se evaluaron factores solubles en el sobrenadante de HUVEC que habían sido estimulados con HANP, con énfasis en los mecanismos relacionados a nivel genético y proteico. Los resultados demostraron que el factor inducible por hipoxia (HIF)-1α juega un papel crítico en estas interacciones.

Para observar y predecir cuantitativamente el impacto de HIF-1α en el proceso de osteogénesis, se estableció un modelo matemático que combina un linaje celular de dos etapas con HIF-1α. Aquí, al analizar los datos empíricos, el modelo de linaje celular de dos etapas se usó para predecir el número de CMM y el grado de diferenciación en cualquier punto temporal, basándose en la densidad de siembra celular inicial definida y la concentración de HIF-1α, y esto a su vez puede proporcionar sugerencias apropiadas para condiciones de cultivo iniciales y tiempos de incubación. Los resultados de este estudio ayudarán a arrojar luz sobre las interacciones entre sustitutos óseos nano-basados y sistemas biológicos, lo que puede servir para promover el desarrollo de biomateriales innovadores para uso en medicina regenerativa.

Materiales y Métodos

Preparación y Caracterización de Partículas

HANP de 20 nm (np20), 20*80 nm (np80) y partículas de HA de tamaño micro (m-HAP) con ≥ 99,0% pureza se compraron de Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China). El tamaño y forma de las partículas se observaron usando microscopía electrónica de transmisión (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, EE. UU.) y microscopía electrónica de barrido (SEM; LEO1530VP, Alemania). El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de partículas de HA (HAP) se determinaron mediante Zetasizer Nano ZS90 y Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido).

Preparación y Cultivo Celular

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Nanjing. HUVEC y hWJ-MSC se obtuvieron de cordones umbilicales humanos frescos, como se describió previamente, tras obtener consentimiento informado por escrito de los donantes [16, 17]. Brevemente, el cordón umbilical y la vena umbilical se enjuagaron con solución salina fosfatada (PBS) que contenía 1% penicilina y estreptomicina (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Austria). Luego, la vena umbilical se llenó con 0,1% colagenasa I (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) e incubó durante 15 min a 37 °C. Tras la recolección, los HUVEC se cultivaron en medio EC (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, EE. UU.).

Posteriormente, se removieron los vasos sanguíneos y la jalea de Wharton se cortó en trozos de 1 mm² y luego se colocó en frascos de cultivo de tejido de 25 cm² (Corning Incorporated, Corning, NY, EE. UU.). Estas células se incubaron en L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, EE. UU.) suplementado con 10% suero fetal bovino (GIBCO) y 1% PS.

hWJ-MSC se evaluaron para confirmar el fenotipo usando anticuerpos monoclonales hacia CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 y CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). HUVEC se evaluaron usando factor de von Willebrand (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai China). Se usaron HUVEC entre pasajes 3-7 y hWJ-MSC entre pasajes 3-5 en estos experimentos.

Las suspensiones de partículas a 1 mg/mL en PBS se diluyeron en L-DMEM a la concentración final. Como se muestra en la Fig. 1, los HUVEC se incubaron en la concentración indicada de HAP durante 18 h. El medio de cultivo se centrifugó a 15,000 rpm a 4 °C durante 15 min, y los sobrenadantes suplementados con 10% FBS se usaron como medio condicionado (CM) para hWJ-MSC para realizar los siguientes experimentos. El CM consistió en medio osteogénico suplementado con fluido de inducción osteogénica, que contenía 10 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL ácido L-ascórbico-2-fosfato y 0,1 μM dexametasona (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.). Además, 2-metoxiestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, EE. UU.) se usó como inhibidor específico de HIF-1α. En el grupo 2-MeOE2(+), hWJ-MSC se cultivaron con CM de HUVEC, que fueron pretratados con 5 μM 2-MeOE2 durante 40 min antes de la suplementación con HAP. PD98059 se usó como inhibidor específico de MEK. En el grupo PD98059, hWJ-MSC se cultivaron con CM que contenía 5 μM PD98059.

Determinación de Viabilidad y Número Celular

La viabilidad celular se evaluó usando Kit de Ensayo MTS (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). hWJ-MSC se dejaron adherir durante 24 h y luego se cultivaron con CM durante 24 y 72 h. La absorbancia de formazan se evaluó a 490 nm usando un lector de microplacas (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EE. UU.). La absorbancia también se convirtió a números celulares usando curvas de calibración estándar bajo las mismas condiciones.

Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa en Tiempo Real (RT-PCR)

El reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) se usó para aislar el ARN total de células hWJ-MSC incubadas en CM por el tiempo indicado. ADN complementario se transcribió a partir de 1,0 µg ARN usando un kit de síntesis de cDNA de primera hebra PrimeScript (TaKaRa, Tokyo, Japón) en un termociclador T3 (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Los niveles de expresión de los genes indicados se analizaron usando kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Basilea, Suiza) en un sistema de amplificación cuantitativa en tiempo real (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). La expresión relativa de ARNm del gen objetivo se normalizó a GAPDH y luego se determinó usando el método \(2^{{ - \Delta \Delta C_{t} }}\). Las secuencias de cebadores para los genes objetivo se listan en la Tabla 1.

Tinción Alizarin Red S (ARS) y Análisis Cuantitativo

hWJ-MSC se cultivaron en placas de 12 pocillos con medio osteogénico hasta 14 d, y luego la mineralización de la matriz extracelular se observó usando tinción ARS (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, China) después de. Brevemente, las muestras se fijaron con alcohol etílico absoluto durante 15 min y luego se tiñeron en 1% (p/v) ARS (pH, 4,2) a temperatura ambiente durante 5 min. Las células teñidas se lavaron dos veces con agua bidestilada y luego se fotografiaron. Para el análisis cuantitativo del proceso de mineralización, 300 μL de cloruro de cetilpiridinio monohidratado al 10% (p/v) (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) se añadieron a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 30 min. Un total de 90 μL de cada muestra se transfirió a una placa de 96 pocillos, y la absorbancia se midió luego a 405 nm en triplicado.

Tinción de Fosfatasa Alcalina (ALP) y Análisis Cuantitativo

Después de que hWJ-MSC se cultivaron en placas de 12 pocillos con medio osteogénico hasta 14 días, la tinción ALP se realizó usando un Kit de Desarrollo de Color de Fosfatasa Alcalina BCIP/NBT (Beyotime). Brevemente, hWJ-MSC se fijaron en 4% paraformaldehído. Luego, las muestras se tiñeron en una mezcla de tetrazolio nitro-azul y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato durante 4 h y se fotografiaron. Para cuantificar la síntesis de ALP, las células se lisaron en tampón de lisis RIPA helado (Beyotime) durante 30 min. Los lisados celulares se centrífugaron a 12,000 rpm a 4 °C durante 10 min, y los sobrenadantes se sometieron a análisis cuantitativo de ALP usando un kit de ensayo ALP (Beyotime). La absorbancia se midió en triplicado a 405 nm y se convirtió a actividad ALP usando una curva estándar.

Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA)

HUVEC se sembraron a 2 × 10⁵ células/pocillo. CM se recolectó de HUVEC cultivados con HAP durante 18 h (Archivo adicional 1), y el sobrenadante se sometió a análisis ELISA (Fig. 1). Un kit ELISA humano HIF-1α (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) se usó según las instrucciones del fabricante.

Inmunofluorescencia

HUVEC se sembraron en láminas en placas de 12 pocillos (7,6 × 10⁴ células/pocillo). Tras la exposición a CM durante 18 h, las células se fijaron en 4% paraformaldehído (Biosharp, Beijing, China) y se permeabilizaron con 0,1% Triton X‐100 (Beyotime) en PBS antes de la incubación con 1% anticuerpo anti-HIF-1α [EPR16897](ab179483, Abcam, Reino Unido) durante la noche a 4 ℃. Posteriormente, las células se incubaron con 1% CoraLite594—conjugado Goat Anti-Rabbit IgG(H + L) (Proteintech, EE. UU.) en la oscuridad durante 1 h. Luego, los núcleos se tiñeron con DAPI (Beyotime, Shanghai, China), que se añadió a las células y reaccionó durante 30 s. Las muestras se examinaron usando un microscopio confocal láser (Olympus, Japón). La intensidad de fluorescencia se cuantificó usando software de análisis ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, EE. UU.).

Análisis de Western Blot

hWJ-MSC se incubaron en CM durante 24 h (quinasa regulada por señal extracelular (ERK)1/2, p-ERK1/2) o en medio osteogénico durante 7 d (factor de transcripción relacionado con runt (RUNX)-2, colágeno tipo 1/colágeno 1 (COL I)). Luego, las células se lisaron en tampón de lisis RIPA durante 30 min. Los lisados celulares se centrífugaron, y los sobrenadantes se almacenaron a −20 °C para análisis. Después de SDS-PAGE al 12%, las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Los anticuerpos primarios usados fueron anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I y GAPDH (1:1,000, anticuerpos policlonales de conejo; Cell Signaling Technology, Boston, MA, EE. UU.). Tras remover anticuerpos no unidos, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios durante 1 h. La señal en las membranas se detectó usando un sistema de imagen de gel de quimioluminiscencia (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). La relación de p-ERK a ERK y RUNX-2/COL I a GAPDH se cuantificó usando software de análisis ImageJ v.1.4 (Bethesda).

Evaluación de Apoptosis Celular

hWJ-MSC se sembraron a una densidad de 10⁵ células por pocillo en placas de 6 pocillos. Las células adheridas se trataron con las concentraciones indicadas de HIF-1α por el tiempo indicado. Las células se recolectaron y marcaron con FITC-Annexin V y PI (Fcmacs, Nanjing, China) durante 15 min en la oscuridad. Todas las muestras se probaron usando un citómetro de flujo FACScan (BD Bioscience, San Jose, CA, EE. UU.). Los datos se analizaron usando FlowJo v10 (BD Biosciences).

Modelo de Linaje Celular de Dos Etapas

Considerando el enorme potencial de HAP y la dificultad en analizar el sistema de co-cultivo, se requería un modelo matemático que pudiera proporcionar análisis cuantitativo y predicción confiable para entender el papel de HIF-1α en la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC.

hWJ-MSC se cultivaron con 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 y 4000 pg/mL HIF-1α así como fluido de inducción osteogénica. Tras ajustar los datos a estas concentraciones, usamos las concentraciones de HIF-1α (producidas por HUVEC) en los grupos control, m-HAP, np80 y np20 (240, 300, 325 y 375 pg/mL, respectivamente) para probar las ecuaciones de ajuste usando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.). Para simplificar el modelo, consideramos que sus patrones de crecimiento similares a diferentes concentraciones de HIF-1α eran idénticos. El grado de diferenciación promedio se empleó para ajustar la ecuación grado de diferenciación-tiempo. La tasa de proliferación, tasa de apoptosis y grados de diferenciación osteogénica de hWJ-MSC en los diferentes grupos se detectaron en tiempos definidos.

Se estableció un modelo simplificado de linaje celular de dos etapas, similar a un modelo de linaje celular multi-etapas [18, 19], según los datos experimentales. C₀ y C₁ representan el número de células de hWJ-MSC y células terminales, respectivamente. C₀ y C₁ se gobiernan por:

$$\left\{ \begin{gathered} \frac{{{\text{d}}C_{0} }}{{{\text{d}}t}} = \left[ {\frac{{K - C_{0} - C_{1} }}{K}p - (p - 1)} \right]\upsilon_{0} C_{0} \hfill \\ \frac{{{\text{d}}C_{1} }}{{{\text{d}}t}} = \left( {2 - \frac{{K - C_{0} - C_{1} }}{K}p - p} \right)\upsilon_{0} C_{0} - AC_{1} \hfill \\ \end{gathered} \right.$$

Aquí, p, afectado por HIF-1α y tiempo, representa la probabilidad de replicación de hWJ-MSC. Correspondientemente, d = 1 − p es la tasa de diferenciación que puede obtenerse ajustando los datos estimados y experimentales de número celular. El parámetro v₀ cuantifica qué tan rápido se dividen las células en cada etapa de linaje (en particular, v = ln2/c, donde c es la duración de un ciclo celular). La tasa de apoptosis de las células terminales se simboliza por A. Para simplificar, descuidamos que la tasa de apoptosis variará ligeramente con el tiempo, y por lo tanto, A = 4,5% es una constante. K denota la capacidad ambiental porque las células no podrían proliferar ilimitadamente [20]. HIF-1α aumenta la tasa de diferenciación de hWJ-MSC, llevando a una tasa de diferenciación modelada por:

$$\begin{aligned} d & = \frac{{d_{0} }}{{1 + (r*H)^{m} }} \\ p & = 1 - d \\ \end{aligned}$$

Aquí, H representa la concentración de HIF-1α; d₀ denota la tasa de diferenciación a 0 pg/mL HIF-1α; r representa la intensidad de regulación (aquí, representando la intensidad de regulación de HIF-1α en CMM); y m corresponde al coeficiente de Hill [21], escilicet la relación entre la tasa de diferenciación de CMM y la concentración de HIF-1α.

Análisis Estadístico

Todos los datos que cumplen requisitos de normalidad y homocedasticidad se expresan como media ± desviación estándar (SD) de tres o más experimentos independientes. Software SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.) se usó para realizar análisis estadísticos mediante ANOVA de un factor o ANONA de dos factores. Un valor P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. El análisis estadístico se presenta usando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Resultados

Caracterización de HAP

Como se muestra en la Fig. 2, HAP se prepararon con tamaño y forma particulares. Los diámetros de np20 con forma casi esférica fueron 20 nm en promedio, y np80 fue tipo varilla con una longitud promedio de 80 nm y ancho de 20 nm. Los m-HAP también fueron casi esféricos en forma y aproximadamente 12 μm de diámetro. Todas las partículas tuvieron una carga superficial negativa en L-DMEM. Se ha sugerido que los valores negativos de potencial zeta tienen un efecto favorable significativo en la adherencia y proliferación de células óseas, así como en la unión ósea directa y formación de hueso nuevo [22, 23]. Las partículas, observadas en L-DMEM, tienen tendencia a agregarse en sistemas acuosos. Su tamaño hidrodinámico también se probó, lo cual también podría ser un factor importante que afecta sus comportamientos biológicos.

Toxicidad Indirecta de HAP hacia hWJ-MSC

Para evaluar la toxicidad indirecta de HAP en hWJ-MSC, la viabilidad celular se midió mediante ensayos MTS. CM con 50 µg/mL HANP pudo estimular significativamente la viabilidad de hWJ-MSC después de 24 h y 72 h y especialmente a 24 h. Sin embargo, CM con 100 µg/mL HANP disminuyó la viabilidad celular en 15-20% comparado con el control después de 72 h. Además, CM con 25 µg/mL np20, pero no np80, estimuló la viabilidad celular después de 24 h. Estos fenómenos confirmaron que 50 µg/mL HANP eran una concentración subcitotóxica que se usó en todos los experimentos subsiguientes (Fig. 3).

Efecto Osteoinductivo Indirecto de HAP en hWJ-MSC

Para identificar los efectos osteoinductores indirectos de HANP en hWJ-MSC, la expresión de genes osteogénicos se evaluó mediante análisis RT-PCR cuantitativo. El nivel de transcripción para factor de transcripción relacionado con runt 2 (RUNX-2) en los grupos HANP, especialmente np20, exhibió un aumento notable del Día 7 al Día 21 (Fig. 4a). La expresión génica de colágeno tipo I (Col I) en el grupo np20 demostró una mejora del Día 7 al Día 21, mientras que el grupo np80 demostró un aumento sostenido del Día 7 al Día 14 (Fig. 4b). El ARNm de osteocalcina (OCN) se reguló claramente al alza en los grupos HANP en el Día 14, indicando una tasa acelerada de osteogénesis (Fig. 4c). Los niveles de ARNm de fosfatasa alcalina (ALP) aumentaron obviamente en los grupos HANP (Fig. 4d), indicando la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC. Sin embargo, el grupo m-HAP presentó cambios limitados respecto a los niveles de estos tres genes osteogénicos comparado con el grupo control (Fig. 4). Además, la expresión de marcadores de pluripotencia, NANOG, OCT3/4 y SOX2, disminuyó en los grupos HANP comparados con el control (Fig. 4e-g), implicando que hWJ-MSC en los grupos HANP se habían diferenciado, especialmente en el grupo np20. Resultados similares se obtuvieron por análisis de Western blot (Fig. 5c, d), indicando que el grupo np20 podría mejorar indirectamente la expresión de RUNX-2 y COL I en hWJ-MSC.

Para observar visualmente el efecto osteoinductivo indirecto de HANP en hWJ-MSC, las células se incubaron con el medio osteogénico indicado durante 14 d, seguido de tinción ARS y ALP. Como se muestra en la Fig. 5a, b, se observó un número aumentado de nódulos mineralizados y mayor actividad ALP de hWJ-MSC en los grupos HANP comparados con los grupos m-HAP y control. Además, m-HAP, similar al control, demostró efectos limitados en la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC.

HAP Activaron Señalización ERK1/2 en hWJ-MSC Co-cultivados Indirectamente con HUVEC

Para investigar los efectos en la función parácrina de HUVEC por HAP, ensayos de inmunofluorescencia y ELISA se usaron para identificar la posible proteína que promueve la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC. Como se muestra en la Fig. 6a-c, la producción intracelular y extracelular de HIF-1α fue facilitada significativamente por HANP (especialmente np20), mientras que hubo un efecto limitado de m-HAP en su producción.

Para entender más precisamente la vía de señalización de diferenciación de hWJ-MSC activada por HIF-1α, examinamos los reguladores clave de la vía ERK1/2 mediante análisis de Western blot. Como se muestra en la Fig. 6d, e, mientras los niveles de proteína de ERK1/2 total permanecieron inalterados, los niveles de p-ERK1/2 aumentaron distintamente en hWJ-MSC cultivados con HANP, y esto fue especialmente cierto en el grupo np20. Sin embargo, m-HAP tuvo poco efecto en los niveles de p-ERK1/2 en hWJ-MSC, similar a su efecto en la producción de HIF-1α en HUVEC. Importantemente, los niveles aumentados de p-ERK1/2 en hWJ-MSC activados por HIF-1α pudieron ser bloqueados por 2-MeOE2, un inhibidor específico de HIF-1α, indicando que HIF-1α funcionó aguas arriba de la vía de señalización ERK1/2 en hWJ-MSC.

HIF-1α Promovió la Diferenciación Osteogénica de hWJ-MSC a través de la Vía ERK1/2

Para determinar si HIF-1α era necesario para la estimulación observada de la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC, se aplicó un inhibidor específico de HIF-1α (2-MeOE2) a estos cultivos celulares. Como se muestra en la Fig. 7, la deposición de matriz mineralizada y la actividad ALP del grupo hWJ-MSC tratado con 2-MeOE2 (+) cultivado en medio osteogénico se debilitaron, indicando que HIF-1α era indispensable para la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC. Basados en estos resultados, exploramos further el papel de la vía ERK1/2 en la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC activada por HIF-1α. La deposición de matriz mineralizada y la actividad ALP en hWJ-MSC cultivados con medio osteogénico se suprimieron tras la administración de PD98059, un inhibidor específico de MEK.

Modelos de Linaje Celular de Dos Etapas

Para revelar cuantitativamente la conexión intrínseca entre la concentración de HIF y la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC, 0-4000 pg/mL de HIF-1α se usó para tratar ocho grupos de hWJ-MSC. Un modelo matemático de linaje celular de dos etapas se usó para analizar las tasas de proliferación, apoptosis y diferenciación osteogénica de estos hWJ-MSC tratados con diferentes concentraciones de HIF-1α. Como se muestra en la Fig. 8a, los datos de ajuste se emplearon para obtener la fórmula simulada (\(\frac{d}{{d_{0} }} = \frac{1}{{0.14H^{2} - 0.43H + 1}}\)) y curva (curva azul), mostrando que la tasa de diferenciación primero aumentó y luego disminuyó con el aumento de la concentración de HIF. Más específicamente, la tasa de diferenciación alcanzó un pico a 1500 pg/mL HIF-1α.

Según nuestro estudio, las concentraciones de HIF-1α producidas por HUVEC en los grupos control, m-HAP, np80 y np20 fueron 240, 300, 325 y 375 pg/mL, respectivamente. El cuadrado negro representa la tasa de diferenciación promovida por 240, 300, 325 y 375 pg/mL HIF-1α, y esto coincide bien con la curva simulada. Además, los grados de diferenciación de hWJ-MSC (actividad ALP relativa) tratados con diferentes concentraciones de HIF-1α aumentaron similarmente con el tiempo. Por lo tanto, para simplificar el modelo, consideramos que sus patrones de crecimiento son similares o incluso idénticos. Encontramos que el aumento en la actividad ALP del Día 0 al Día 7 fue proporcional al número de osteoblastos, y las células osteoblastas alcanzaron su pico en el período de meseta. Por lo tanto, tras ajustar la actividad ALP con la curva de número relativo de osteoblastos (número de células osteoblastas / número máximo de células osteoblastas), se predijo el máximo de actividad ALP y se adquirió la actividad ALP relativa (actividad ALP / máximo de actividad ALP), representando el grado de diferenciación (Fig. 8b). Combinando estos dos estudios, se obtuvo la superficie tridimensional del grado de diferenciación evolucionando con el tiempo y HIF-1α (Fig. 8c).

Para estimar el tiempo de cultivo óptimo, fue necesario simular números celulares. Tras dilucidar la tasa de diferenciación bajo diferentes concentraciones de HIF-1α, simulamos el tamaño de cada población. La simulación utilizó una densidad de siembra inicial de 1500 células por pocillo (en una placa de 96 pocillos) usando diferentes concentraciones de HIF-1α. Como se muestra en la Fig. 8d-f, los datos experimentales (cuadrado negro) coinciden bien con los números totales de células simulados (curva azul), que es la suma del número de hWJ-MSC y osteoblastos, y esto respalda la capacidad de este modelo para predecir el número de hWJ-MSC y osteoblastos en cualquier punto temporal. Además, el número de células osteoblastas se acercó al período de meseta a 21, 18 y 15 días con 0, 375 y 1500 pg/mL HIF-1α, respectivamente. Este modelo proporciona el tiempo de cultivo óptimo para guiar la ingeniería de tejidos, y también proporciona evidencia directa de que HIF-1α acelera la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC.

Discusión

Con los avances recientes en nanobiomateriales, los sustitutos óseos artificiales nano-basados han sido un área de intensa investigación. La evidencia acumulada sugiere que hay interacciones complejas entre células y nanobiomateriales debido a su capacidad para penetrar membranas celulares y aumentar tiempos de retención interna [24, 25]. Un estudio previo reveló que nanoláminas de colágeno/alginato pueden adsorberse en la membrana de CMM para activar cascadas de señalización intracelular y promover la diferenciación osteogénica [26]. Experimentos elegantes de Wu y sus colegas demostraron claramente que nanotubos de TiO₂ pueden mejorar la vascularización y diferenciación osteogénica facilitando efectos parácrinos y uniones celulares a través de interacciones CE-CMM [27]. Para el propósito de desarrollar candidatos excelentes para ingeniería de tejido óseo, es necesario clarificar el diálogo directo entre sustitutos óseos nano-basados y células implicadas en la reparación ósea, así como sus interacciones indirectas. Sin embargo, nuestra comprensión actual de esto sigue siendo limitada. En el presente estudio, utilizamos un modelo de co-cultivo indirecto para dilucidar further los efectos biológicos de HANP en CMM respecto a las interacciones indirectas mediadas por CE.

La citotoxicidad es un tema primario para evaluar la biocompatibilidad de cualquier nanobiomaterial. Aunque nuestro estudio previo encontró que HANP no influyeron directamente en la viabilidad o apoptosis de hWJ-MSC, aún pueden ejercer diferentes impactos a través de la mediación de otras células [28]. Así, fue necesario evaluar los efectos citotóxicos de HANP en hWJ-MSC mediados por HUVEC. Curiosamente, tras incubación en CM durante 24 h y 72 h, la viabilidad de hWJ-MSC se mantuvo e incluso se elevó en los grupos 0-50 µg/mL HANP, especialmente en el grupo np20, indicando la existencia de moléculas efectoras en el CM. Cuando la concentración de HANP alcanzó 100 µg/mL, se volvieron citotóxicas para hWJ-MSC. Sin embargo, 0-100 µg/mL m-HAP no tuvieron influencia en la viabilidad de hWJ-MSC (Fig. 3). Jiang et al. han mostrado que nanopartículas ingenieradas de un tamaño particular pueden tener rutas y cinéticas endocíticas distintas asociadas con señalización downstream alterada involucrada en la regulación de funciones de células objetivo [29]. En nuestro estudio previo, mostramos que np20 y np80 fueron endocitadas por HUVEC, y esto fue seguido por cambios morfológicos y la aparición de vacuolas grandes, indicando el estado activado de HUVEC. Además, np20, con su velocidad de captación más rápida y acumulación aumentada, podría resultar en una activación más fuerte de HUVEC, posiblemente resultando en mayor viabilidad de hWJ-MSC vía señalización parácrina. Por el contrario, pocas m-HAP pueden ser endocitadas por HUVEC, y esto podría explicar su influencia limitada en el metabolismo de hWJ-MSC [9].

Para explorar further el potencial efecto osteoinductivo de HUVEC activadas, se usó una dosis subcitotóxica de 50 µg/mL HAP en estudios subsiguientes. El CM recolectado de HUVEC activadas promovió la deposición de calcio extracelular, actividad ALP y expresión de proteínas osteogénicas en hWJ-MSC, así como la expresión de ARNm de genes osteogénicos (Figs. 4, 5). Runx2, un factor de transcripción esencial involucrado en especificar el linaje osteoblástico [30], mostró una mejora sustancial en el grupo np20, indicando un fuerte efecto osteoinductivo en hWJ-MSC (Fig. 4a y Fig. 5c, d). El grupo np20 demostró una mejora de 1,5 veces en la expresión de COLI en el Día 7 (Figs. 4b, 5c, d) y un aumento doble en el Día 14, lo que implicaba la presencia de osteoblastos diferenciados adicionales en los grupos tratados con HANP (Fig. 4b) [30]. OCN es un marcador óseo de etapa madura [31], y este gen mostró un aumento significativo en los grupos HANP en el Día 14 (Fig. 4c), indicando que np20 y np80 pueden acelerar la maduración ósea comparado con m-HAP. ALP es un marcador temprano de diferenciación osteoblástica, y aumentó obviamente con el tiempo de cultivo en cada grupo, especialmente el grupo np20, revelando que ocurrió transformación adicional de CMM a osteoblastos (Fig. 4d). Marcadores de pluripotencia, NANOG, OCT3/4 y SOX2 implican la capacidad de diferenciación [32]. Como se muestra en la Fig. 4e-g, la expresión disminuida en los genes de los grupos HANP implicaba que la mayoría de hWJ-MSC en grupos HAP se habían transformado en osteoblastos.

Nuestros datos demostraron que la endocitosis de HANP por HUVEC se asoció con una diferenciación osteogénica mejorada de hWJ-MSC. Sin embargo, la causa de este resultado actualmente no está clara. En términos de la función parácrina de HUVEC, nos centramos en proteínas solubles inductivas de diferenciación en el sobrenadante de HUVEC activadas. La señalización HIF-1α es esencial en el acoplamiento de osificación y angiogénesis durante la regeneración ósea [33, 34]. Heikal et al. reportaron que CE lesionadas secretan más HIF-1α incluso bajo condiciones de normoxia [35]. También se ha mostrado que la exposición a HANP inhibe la capacidad angiogénica de HUVEC [9]. Así, medimos las concentraciones de HIF-1α en el CM, y los resultados mostraron que el contenido de HIF-1α aumentó en los grupos de tratamiento HANP comparados con los grupos m-HAP y control (Fig. 6a). Para identificar el papel de HIF-1α en la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC, usamos 2-MeOE2, que es un inhibidor específico de HIF-1α. La concentración disminuida de HIF-1α paralizó la deposición de matriz mineralizada y la actividad ALP en estas hWJ-MSC, indicando que HANP pueden promover la producción de HIF-1α de HUVEC para facilitar la osteogénesis de hWJ-MSC (Fig. 7).

Para aplicar adecuadamente HANP para uso en ingeniería de tejido óseo, es necesario obtener más conocimientos sobre los mecanismos por los cuales HANP promueven la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC mediadas por HUVEC. La vía ERK1/2 está aguas abajo de HIF-1α [36] y es fundamental para la diferenciación de CMM [37]. En este trabajo, las concentraciones de HIF-1α en el CM coinciden bien con los niveles de p-ERK1/2 en hWJ-MSC (Fig. 6b, c). Cuando se aplicó 2-MeOE2, la expresión de p-ERK1/2 en hWJ-MSC no logró activarse, indicando que HIF-1α funcionó aguas arriba de la señalización ERK1/2. Para abordar directamente el papel de la señalización ERK1/2 en la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC, se usó PD98059, un inhibidor específico de MEK. La supresión de la señalización ERK1/2 resultó en la diferenciación osteogénica más baja de hWJ-MSC. Una posible razón para esto es que la vía ERK1/2 juega un papel clave tanto en la señalización HIF-1α como en las vías de señalización de apoptosis y proliferación, lo que podría ser responsable de los cambios observados en la diferenciación osteogénica en estas células [38, 39]. Además, esto también podría estar relacionado con la presencia de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). VEGF es uno de los efectores downstream de la señalización HIF-1α [33], y también puede promover la diferenciación osteogénica de CMM vía activación de la vía ERK1/2 [37]. Nuestro estudio previo encontró que np20 indujo la producción de VEGF en HUVEC [9]; por lo tanto, es posible que la supresión de la vía ERK1/2 pueda resultar en inhibición de VEGF, lo que llevaría a la disminución de la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC. Según los resultados experimentales disponibles, podemos resumir lo siguiente. HANP pueden procesar de manera más óptima efectos osteoinductores directos [5] e indirectos mejores que m-HAP. Comparados con injertos óseos autólogos y aloinjertos, hay una fuente extensa de HANP sin daño secundario e inmunogenicidad potencial. Sin embargo, comparados con m-HAP, HANP pueden suprimir la capacidad angiogénica de HUVEC [9] y exhiben citotoxicidad leve tanto de manera tiempo- como dosis-dependiente.

Recientemente, evidencia creciente ha demostrado la importancia de HIF-1α en la regeneración ósea. Sin embargo, pocos estudios han podido predecir cuantitativamente la tasa de diferenciación de CMM bajo condiciones iniciales específicas, como la concentración de HIF-1α. Tomando en cuenta proliferación celular, apoptosis y diferenciación osteogénica, presentamos un modelo matemático que combina un linaje celular de dos etapas con HIF-1α que está altamente correlacionado con nuestros datos experimentales. Al ajustar la tasa de diferenciación de hWJ-MSC en 0-4000 pg/mL HIF-1α, adquirimos las ecuaciones para describir la tasa de diferenciación, concentración de HIF-1α y tiempo. Como se muestra en la Fig. 8d, este modelo puede representar el mapa de número celular bajo diferentes concentraciones de HIF-1α, de modo que es posible explorar la dinámica intrínseca del sistema de dos etapas [40]. Además, este modelo valida matemáticamente el efecto de HIF-1α en la diferenciación osteogénica de hWJ-MSC. Además, basado en un modelo de linaje celular multi-etapas y modelo logístico, nuestro modelo es lo suficientemente estable para permitir predicciones a largo plazo sin caer en la trampa de explosión poblacional ilimitada [41].

Al usar los datos experimentales existentes, tanto el número celular como la tasa de diferenciación pueden predecirse con una densidad de siembra celular inicial definida y concentración de HIF-1α. Como tal, el tiempo de incubación óptimo también se obtiene. Consecuentemente, podemos predecir la concentración óptima de HIF-1α y determinar el tiempo más óptimo para osteogénesis, lo cual es importante para ingeniería de tejidos eficiente. Un modelo de linaje celular de dos etapas es aplicable para predecir la proliferación y diferenciación de células madre, que tienen dos linajes celulares. Sobre esta base, el modelo fundado en las condiciones iniciales y datos experimentales existentes puede establecerse para identificar las condiciones de cultivo óptimas in vitro, lo que asistirá en optimizar la reparación ósea in vivo.

Conclusión

En este estudio, exploramos los efectos biológicos específicos de HANP en hWJ-MSC mediados por HUVEC. Comparados con m-HAP, tanto np20 como np80 mostraron citotoxicidad leve tanto de manera tiempo- como dosis-dependiente. Importantemente, el tamaño de HANP pareció no tener impacto significativo en esta citotoxicidad. Nuestros datos también mostraron que HANP, especialmente np20, fueron capaces de facilitar HUVEC para secretar niveles aumentados de HIF-1α, que se correlacionó directamente con la diferenciación osteogénica mejorada de hWJ-MSC a través de la activación de la vía ERK1/2 (Fig. 9). Más notablemente, los resultados del modelo de linaje celular de dos etapas sugirieron que HIF-1α ejerció un efecto estimulador dependiente de la dosis en la tasa de diferenciación osteogénica de hWJ-MSC. Además, la concentración óptima de HIF-1α y el tiempo de incubación se estimaron basados en las condiciones iniciales usando un modelo in vitro, lo cual podría ser invaluable en el futuro para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Colectivamente, estas observaciones proporcionan evidencia de que HANP pueden mejorar la regeneración ósea modulando interacciones célula-célula.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos usados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente bajo solicitud razonable.

Abreviaturas

HA:

Hidroxiapatita

HANP:

Nanopartículas de HA

hWJ-MSC:

Células madre mesenquimales derivadas de jalea de Wharton del cordón umbilical humano

HUVEC:

Célula endotelial de vena umbilical humana

m-HAP:

Partículas de HAP de tamaño micro

PBS:

Solución salina fosfatada

ECM:

Medio EC

2-MeOE2:

2-Metoxiestradiol

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

RUNX-2:

Factor de transcripción relacionado con runt 2

Col I:

Colágeno tipo I

OCN:

Osteocalcina

ALP:

Fosfatasa alcalina

SOX 2:

SRY-related HMG-box 2

ERK:

Quinasas reguladas por señal extracelular

VEGF:

Factor de crecimiento endotelial vascular