Nanofibras electrohiladas de condroitina sulfato / policaprolactona / gelatina con antitrombogenicidad y afinidad mejorada de células endoteliales como posible andamio para la ingeniería de tejidos de vasos sanguíneos

Resumen

Las nanofibras poliméricas electrohiladas han ganado mucha atención en la ingeniería de tejidos de vasos sanguíneos. Sin embargo, los materiales de nanofibras convencionales con las deficiencias de la endotelización lenta y la trombosis no son eficaces para promover la reparación y regeneración del tejido de los vasos sanguíneos. En este documento, se desarrollaron nanofibras compuestas de gelatina biomimética (Gt) / policaprolactona (PCL) que incorporan una cantidad diferente de sulfato de condroitina (CS) mediante tecnología de electrohilado para investigar sus efectos sobre la antitrombogenicidad y la afinidad de las células endoteliales. La variación de las concentraciones de CS en las nanofibras de PG afecta la morfología y el diámetro de las fibras. Las nanofibras CS / Gt / PCL tienen una porosidad adecuada (~ 80%) y una absorción de solución de PBS (hasta un 650%). La introducción de CS en nanofibras de Gt / PCL mejora en gran medida sus propiedades anticoagulantes, prolonga su tiempo de coagulación y facilita las respuestas celulares. Particularmente, las nanofibras de CS / Gt / PCL al 10% muestran una adhesión, alargamiento y proliferación celular favorables. Por lo tanto, las nanofibras de Gt / PCL que contienen una cierta cantidad de CS podrían ser excelentes candidatos como un andamio de ingeniería de tejidos prometedor en la reparación y regeneración de vasos sanguíneos.

Introducción

El desarrollo de materiales nanofibrosos ha atraído mucha atención como andamios biomiméticos en la reparación y regeneración de tejidos debido a sus características (bio) fisicoquímicas únicas, incluida su estructura de fibra ultrafina similar a la matriz extracelular (ECM), excelentes propiedades mecánicas, gran área de superficie específica y alta porosidad con interconectividad [1, 2]. Se ha demostrado que las estructuras nanofibrosas desempeñan un papel clave en la mediación de las respuestas celulares, como la adhesión celular, la morfología (p. Ej., Propagación, alineación, elongación, etc.), disposición, migración, proliferación, fenotipo y diferenciación mediante guía de contacto [3 , 4,5]. Si bien numerosas estrategias de nanofabricación (p. Ej., Nanoesquificación, síntesis de plantillas, separación de fases, etc.) han proporcionado una tecnología disponible para fabricar materiales nanofibrosos, el electrohilado es uno de los métodos más efectivos para fabricar nanofibras a partir de diferentes materiales (metales, cerámica, polímeros). , materiales compuestos, etc.) a escala industrial [6,7,8].

Además de las señales (bio) físicas, la selección de biomateriales adecuados puede afectar significativamente las actividades celulares, así como la reparación y regeneración de tejidos [9]. Se deben considerar algunas características clave, como la biocompatibilidad, la bioabsorbibilidad, las propiedades mecánicas y la función biológica [9, 10]. En comparación con los compuestos naturales / naturales y sintéticos / sintéticos, los materiales compuestos de nanofibras que consisten en polímeros naturales y sintéticos han recibido más atención debido a la combinación de las excelentes características biológicas de los polímeros naturales y la resistencia mecánica de los polímeros sintéticos [9]. Entre ellos, la combinación de gelatina (Gt) / policaprolactona (PCL) es uno de los sistemas híbridos naturales-sintéticos más representativamente investigados y se utiliza ampliamente en la ingeniería de tejidos vasculares sanguíneos [11,12,13,14]. Sin embargo, las nanofibras compuestas de Gt / PCL todavía tienen algunas limitaciones, como la endotelización lenta y la trombosis. Recientemente, el condroitín sulfato (CS) es un polisacárido sulfatado que contiene glicosaminoglicano y galactosamina, que se ha demostrado que posee una alta adhesión a las células endoteliales (CE), una interacción débil con las proteínas y las plaquetas, así como una repulsión electrostática de los componentes sanguíneos cargados negativamente [15 , 16,17]. Además, CS podría inhibir la apoptosis celular y facilitar la curación de heridas vasculares [18, 19]. Por lo tanto, las nanofibras electrohiladas de Gt / PCL (PG) que incorporan CS serían excelentes candidatas como andamio de ingeniería de tejidos bioinstructiva para la reparación y regeneración vascular sanguínea.

En el presente trabajo, se desarrollaron nanofibras compuestas de PG biomiméticas que contienen diferentes proporciones de CS mediante electrohilado en un solo paso. La morfología, la porosidad de las características químicas y la degradación de las nanofibras compuestas de CS / PG se detectaron mediante diferentes técnicas de caracterización. Se evaluó el anticoagulante de nanofibras compuestas PG / CS. Además, estas nanofibras compuestas con diferentes proporciones de CS se sembraron con células endoteliales aórticas humanas (HAEC) para investigar sus efectos sobre las respuestas celulares.

Materiales y métodos

Materiales

El CS (tráquea bovina, tipo A, pureza:95%) fue suministrado por Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China). El PCL se obtuvo de Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China). Gt (piel de bovino, tipo B) se obtuvieron de Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (China). El kit de tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) se adquirió de Leigen Biotechnology Co., Ltd (China). El ácido acético (pureza:99,5%) se adquirió de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China). Las células endoteliales aórticas humanas (HAEC) se obtuvieron del hospital afiliado de la Universidad de Qingdao (China). Medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12), suero fetal bovino (FBS), 0,25% de tripsina-EDTA se adquirieron en Biological Industries (Israel). Todos los reactivos se adquirieron de Sigma Aldrich (China) a menos que se indique lo contrario. El agua utilizada en todos los experimentos fue desionizada.

Electrohilado de nanofibras

Se disolvió PCL (10% p / v) en ácido acético con agitación mecánica a temperatura ambiente durante 4 h. Se disolvió Gt (10% p / v) en ácido acético al 90% con agitación constante durante 2 h. Se añadió CS en diferentes concentraciones a la solución de Gt y se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 1 h para obtener las soluciones homogéneas que contenían 5, 10 y 15% en peso de CS con respecto a la concentración total de polímero. Luego, se preparó la solución de PG mezclando las dos soluciones anteriores en una proporción en peso de 50/50 (p / p) con agitación durante 2 h, nombradas como 5% CS @ PG, 10% CS @ PG y 15% CS @ PG .

Las soluciones homogéneas preparadas se sometieron al proceso de electrohilado, equipado con una jeringa de 1 mL con aguja 21 G y un colector cubierto con papel de aluminio. En este estudio, la distancia entre la placa colectora y la punta de la aguja se fijó en alrededor de 18 cm, el voltaje se estableció en 23 kV y las soluciones poliméricas se bombearon a una velocidad de 1 ml / h. Todas las soluciones se electrohilaron en un instrumento de electrohilado (Technology, Tk602TH, China) a temperatura ambiente y humedad cuidadosamente controlada (<40%). Antes de cualquier otro experimento, las muestras se colocaron en un horno de secado al vacío durante 72 h como mínimo para eliminar cualquier resto de disolvente.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopio electrónico de transmisión (TEM)

La morfología de los andamios nanofibrosos CS @ PG se investigó mediante un SEM (VEGAS, TESCAN, checo) a un voltaje de aceleración de 20 kV a temperatura ambiente. El diámetro de las nanofibras ( n =100) se midió a partir de imágenes SEM utilizando un software de análisis de imágenes (Imagen J).

Las observaciones de TEM y los análisis de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) se llevaron a cabo utilizando un JEOL JEM-2100 plus (Japón).

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

La FTIR se llevó a cabo con un espectrómetro Nicolet iN10 FTIR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Para evaluar los grupos funcionales característicos de las nanofibras CS, PG y nanofibras CS @ PG. Los espectros de las muestras se registraron con el modo de transmisión en un rango de longitud de onda de 4000 a 500 cm ⁻¹ con una resolución de 2 cm ⁻¹ .

Porosidad y absorción de solución salina tamponada con fosfato (PBS)

La porosidad de las nanofibras se realizó mediante el método de desplazamiento de líquido. En primer lugar, el peso seco de las nanofibras se pesó como W ₁ . Luego, se sumergieron cuatro grupos de nanofibras en etanol durante 2 ha 25 ° C y se pesaron como W ₂ . El etanol de la superficie de la muestra se eliminó con papel de filtro y los pesos de las muestras se anotaron como W ₃ . La porosidad de las nanofibras se calculó mediante la siguiente fórmula:

$$ {\ text {Porosity}} \ left (\% \ right) =\ left ({W_ {3} - W_ {1}} \ right) / \ left ({W_ {3} - W_ {2}} \ right) \ times 100 $$

Para la prueba de absorción de la solución de PBS, las nanofibras obtenidas se pesaron en estado seco y se registraron como Wd. Luego, las nanofibras se empaparon en PBS durante 24 ha 25 ° C y el peso en estado húmedo se registró como Ww después de eliminar el exceso de líquido en la superficie de la muestra. La relación de hinchamiento se puede medir mediante la siguiente ecuación:

$$ {\ text {PBS}} \; {\ text {absorción}} \ left (\% \ right) =\ left ({W _ {{\ text {W}}} - W _ {{\ text {d} }}} \ right) / W _ {{\ text {d}}} \ times 100 $$

Todos los valores de los experimentos anteriores se expresan como la media ± DE ( n =3).

Comportamiento de degradabilidad in vitro

Para determinar la resistencia de las nanofibras obtenidas a la lisozima, se midió la degradabilidad de las muestras en un tiempo programado (1, 4, 7, 10 y 14 días). El peso inicial de las nanofibras se registró como W _i . Luego, las muestras se sumergieron en solución de PBS (pH 7,4) que contenía lisozima (500 μg / mL) y se incubaron in vitro a 37 ° C. En los intervalos de degradación predeterminados, cada grupo de muestras se extrajo y se lavó con agua desionizada y se liofilizó para obtener el peso final ( W _f ). La solución de lisozima se cambió tres veces por semana. La masa restante (%) de los andamios nanofibrosos se estimó según se define en la siguiente fórmula:

$$ {\ text {Mass}} \; {\ text {restante}} \ left (\% \ right) =\ left ({1 - \ frac {{w_ {i} - w_ {f}}} {{ w_ {i}}}} \ right) \ times 100 \% $$

Para evaluar el comportamiento de degradación de la muestra a los 7 días, se observó mediante SEM la morfología de las nanofibras.

Análisis de compatibilidad sanguínea

Tiempos de coagulación

El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) se utilizó para evaluar la actividad de las vías intrínsecas y comunes de la coagulación mediante la prueba de los tiempos de coagulación del plasma pobre en plaquetas (PPP) después de la incubación con nanofibras electrohiladas en cubreobjetos. Para ello, se recogió sangre anticoagulada (aproximadamente 10 mL) y se centrifugó a 3000 rpm durante 20 min para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). Cada muestra se incubó con 200 μL de PPP durante 10 min a 37 ° C y se analizó con el kit APTT siguiendo las instrucciones del fabricante ( n =3).

Prueba de hemólisis

La tasa de hemólisis se evaluó midiendo la concentración de hemoglobina liberada en la fase de solución de los eritrocitos en sangre entera diluida expuesta a las nanofibras electrohiladas. Las muestras de los cubreobjetos se colocaron individualmente en placas de 24 pocillos y se sumergieron en 2 ml de PBS a 37 ° C durante 30 min. Los grupos de control negativo contenían solo 2 ml de PBS, mientras que los grupos de control positivo estaban compuestos por 2 ml de agua desionizada con el objetivo de inducir la lisis máxima de eritrocitos ( n =3 para cada grupo de prueba). Luego, se agregaron 40 μL de sangre entera fresca anticoagulada antes mencionada en cada pocillo y se incubaron durante 60 min a 37 ° C, después de lo cual las suspensiones se retiraron en tubos de centrífuga y se centrifugaron a 100 × g durante 5 min. Los sobrenadantes se sometieron a medir la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas (SynergyH1 / H1M, BioTek, China).

Trombogenicidad

El potencial trombogénico se evaluó in vitro después de la incubación de muestras electrohiladas con plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP se preparó mediante centrifugación (1500 rpm, 20 min) y se desechó la mitad superior del plasma. Luego, las nanofibras en cubreobjetos se incubaron en 100 μL de PRP a 37 ° C durante 2 horas y se enjuagaron suavemente con PBS tres veces para experimentos posteriores. Para evaluar la actividad plaquetaria después de incubarse con PRP, las nanofibras electrohiladas se mantuvieron en el DMEM suplementado con FBS al 10% durante 2 hy 24 h, y luego se utilizó un kit de ensayo CCK-8 para medir la viabilidad de los trombocitos en las nanofibras. Se añadió CCK-8 (20 μl) a 200 μl de medio DMEM sin suero en placas de 24 pocillos y se incubó durante 1 h. Finalmente, las suspensiones se midieron con un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.

Cultivo celular y viabilidad celular

Se cultivaron células endoteliales aórticas humanas (HAEC) en DMEM suplementado con FBS (10%, v / v) y estreptomicina / penicilina (1%, v / v) en una atmósfera de 37 ° C y 5% de CO2. . El medio de cultivo se reemplazó tres veces por semana. Las células se aislaron generalmente con tripsina al 0,05% / EDTA durante 3 min, se centrifugaron a 1000 rpm y se suspendieron en el medio fresco para realizar el paso celular o la siembra celular.

Antes de la siembra celular, todos los materiales nanofibrosos en una placa de 24 pocillos se esterilizaron con irradiación UV durante 1 hora y se sumergieron en etanol al 75% (v / v,%) durante 1 hora. Luego, las nanofibras se enjuagaron cuatro veces con solución de PBS y se remojaron en DMEM durante 12 h en CO ₂ incubadora. Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10 ⁴ células por pocillo en nanofibras y el medio se reemplazó todos los días. Después de co-cultivar 24 h, las células se lavaron con solución de PBS tres veces y luego se tiñeron con un kit de tinción doble de Calceína-AM / PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Se utilizó PI para teñir las células muertas y se tiñó con Calceína-AM para las células vivas.

Morfología celular en las nanofibras

Para observar la adhesión celular sobre las nanofibras, se observó la morfología de las células después de cocultivadas 24 h mediante microscopio de fluorescencia (Nikon A1 MP, Japón). En primer lugar, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, se utilizó una solución de Triton X-100 al 0,5% durante 5 min para permeabilizar la membrana celular. Finalmente, se usó 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos celulares y se usó rodamina-faloidina para teñir la F-actina. El análisis cuantitativo (densidad celular, área de una sola celda, alargamiento celular) se realizó adicionalmente con Image J.

Proliferación celular

La actividad de proliferación celular sobre las nanofibras compuestas se llevó a cabo con un kit de ensayo CCK-8. Las HAEC se sembraron en nanofibras a una densidad de 8 × 10 ³ células / pocillo. El medio de cultivo se cambió cada dos días. Después de 1, 4, 7 días de co-cultivo, las células se lavaron con una solución de PBS para eliminar las células no adherentes. Luego, se agregaron 20 μL de CCK-8 y el medio completo en una proporción de volumen de 1:10 en la placa de 24 pocillos durante 1 h en la incubadora. La absorbancia fue probada por Elisa Reader a 450 nm.

La tinción celular con DAPI y rodamina-faloidina se realizó con microscopio de fluorescencia para observar directamente los cambios en los recuentos de células después de co-cultivar con diferentes nanofibras durante dos días y seis días.

Análisis estadístico

Todas las muestras de los experimentos se procesaron por triplicado. Todos los datos se representan como medias ± desviaciones estándar (DE). El análisis estadístico de las muestras se determinó mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar las diferencias con la significancia asignada en p <0.05.

Resultado y discusión

Preparación y caracterización de nanofibras CS @ PG

La Figura 1 muestra el diagrama esquemático del proceso de electrohilado para armazones nanofibrosos CS @ PG y la evaluación in vitro de la anticoagulación y la citocompatibilidad. Para desarrollar andamios de tejido vascular diseñados para promover la proliferación de células endoteliales, se incorporaron diferentes proporciones de CS (5, 10 y 15% en peso) en soluciones de PG (10%, v / v) para fabricar nanofibras compuestas mediante un proceso de electrohilado.

Se realizó SEM para observar la estructura de nanofibras electrohiladas CS @ PG. Como se muestra en la Fig.2, las imágenes SEM de nanofibras PG, 5% CS @ PG, 10% CS @ PG, 15% CS @ PG exhibieron la arquitectura fibrosa densa, que contiene fibras continuas, lisas y nanoescaladas mediante la técnica de electrohilado. . Las nanofibras PG (Fig. 2a) mostraron muchas perlas irregulares en las nanofibras a través del proceso de electrohilado, con un diámetro medio de 406,01 ± 146,28 nm. Se podría explicar que el 10% p / v de la solución electrohilada exhibió una baja viscosidad, lo que resultó en la formación de nanofibras no homogéneas que contienen perlas [20]. Con el aumento de la cantidad de CS en la solución polimérica del 5 al 10% en peso, se pudieron lograr nanofibras homogéneas sin perlas debido al aumento de la viscosidad de la solución (Fig. 2b, c). En consecuencia, 5% CS @ PG y 10% CS @ PG mostraron un diámetro medio más pequeño de 382,35 ± 152,99 nm y 300,29 ± 100,85 nm, respectivamente. Este resultado se debe principalmente a que el aumento del contenido de CS mejoró en consecuencia la conductividad de la solución de electrohilado [20]. Sin embargo, cuando la concentración de polímero fue de hasta el 15%, la viscosidad de la solución de polímero es demasiado alta para estirarla en el campo eléctrico. Al mismo caudal de 1 mL / h que los grupos anteriores, observamos que bajo el voltaje aplicado de 23 kV, apareció el fenómeno de obstrucción de la punta de la aguja y no se pudo observar el cono de Taylor. Por lo tanto, el caudal de la solución electrohilada y el voltaje aplicado se ajustaron a 0,9 ml / hy 20 kV, respectivamente. Las nanofibras de CS @ PG al 15% se produjeron con éxito con un diámetro medio de 266,92 ± 105,43 nm.

Como se muestra en la Fig. 3a, se encontró que CS se distribuyó uniformemente en las nanofibras CS @ PG al 5% y al 10% CS @ PG. Sin embargo, se detectó agregación de CS en las fibras de CS @ PG al 15%. Como se indica en la Fig. 3b, se realizó un análisis elemental de EDX para detectar el contenido de azufre de las fibras preparadas. Como era de esperar, el contenido de azufre aumentó con una mayor concentración de CS en las fibras obtenidas.

Análisis de espectros FTIR

Se llevó a cabo un análisis de espectros FTIR para determinar los picos de absorción característicos del grupo químico de los armazones nanofibrosos preparados. El espectro FTIR de PG y CS se consideró como el grupo de control para comparar con los grupos de nanofibras CS @ PG. En el espectro de PG, fuertes bandas de absorción que aparecieron a 3300 cm ⁻¹ y 2935 cm ⁻¹ se puede atribuir al –NH ₂ y –OH estiramiento de vibración, y CH ₂ estiramiento asimétrico, respectivamente. Aparecieron varios picos de absorción característicos a 1652 cm ⁻¹ (amida I) para vibración de estiramiento C =O, 1542 cm ⁻¹ (amida II) para vibración de flexión N – H, 1441 cm ⁻¹ para CH ₂ estiramiento y 1267 cm ⁻¹ (amida III) para la vibración de estiramiento C – N [21, 22]. El espectro de CS realizó una banda de absorción característica a 1245 cm ⁻¹ , que representa la vibración de estiramiento S =O en SO ₄ cargado negativamente ²⁻ [23, 24].

Como se muestra en la Fig. 4, los espectros FTIR de nanofibras de 5% CS @ PG, 10% CS @ PG y 15% CS @ PG mostraron picos característicos de PCL, Gt y CS juntos. En comparación con los espectros del grupo PG, los grupos CS @ PG mostraron la banda característica de CS a 1245 cm ⁻¹ , y la intensidad de la banda CS aumentó por la presencia de CS en las nanofibras. Este hallazgo confirmó la presencia de diferentes contenidos de CS en las nanofibras electrohiladas CS @ PG.

Porosidad, índice de hinchamiento y degradabilidad de las nanofibras

La alta porosidad de la fibra indica que el material tiene una excelente interconectividad, lo que favorece la difusión de oxígeno y nutrientes en los poros y promueve la infiltración celular [25, 26]. La Figura 5a muestra la porosidad de las películas nanofibrosas. La porosidad de las nanofibras obtenidas que contienen diferentes proporciones de CS fue de aproximadamente hasta el 80%. La arquitectura de alta porosidad obtenida por las nanofibras electrohiladas puede imitar la ECM natural, proporcionando así un microambiente 3D favorable para las células [27]. Se ha informado que los andamios en la ingeniería de tejidos con una porosidad de hasta el 80% fueron beneficiosos para el transporte de nutrientes y metabolitos.

La relación de absorción de PBS de los armazones nanofibrosos CS @ PG se comparó para evaluar el efecto de CS sobre la absorción de PBS de las películas. Como se indica en la Fig. 5b, la relación de absorción de PBS del armazón de PG fue 586,34 ± 49,44%, y las nanofibras de CS @ PG al 5% y CS @ PG al 10% fueron 492,86 ± 21,99% y 510,04 ± 69,55%, respectivamente. La relación de absorción de PBS de grupos de CS al 15% @ PG (665,07 ± 59,81%) fue significativamente mayor que la de CS al 5% @ PG y CS @ PG al 10%. Este resultado indicó que el aumento del contenido de CS en las nanofibras compuestas podría mejorar la propiedad de absorción de PBS de las películas, lo que podría deberse a la alta hidrofilia en las moléculas de CS que contienen grupos hidrófilos (carboxilo e hidroxilo) [28].

Los datos del experimento de degradabilidad in vitro se representaron en la Fig. 5c, y se encontró que con el aumento de la proporción de CS, también se incrementó la tasa de degradación de los armazones nanofibrosos de CS @ PG. Esto podría atribuirse a la presencia de SO ₄ ²⁻ grupos [29]. Como se demuestra en la Fig.5c, la tasa de degradación de la mayoría de los andamios comenzó a aumentar después de 7 días, y los resultados de degradación en el día 14 fueron 8.45%, 11.39%, 13.97% y 15.10% para PG, 5% CS @ PG, 10 Andamios nanofibrosos% CS @ PG y 15% CS @ PG, respectivamente. Las imágenes SEM de los armazones nanofibrosos (Fig. 5d) mostraron una ligera hinchazón después de sumergirlos en una solución de PBS durante 7 días. Las imágenes SEM indican que las nanofibras desarrolladas eran lo suficientemente estables como para evitar una degradación y expansión graves durante hasta 7 días, lo que afecta la respuesta celular in vivo o in vitro.

Evaluación de hemocompatibilidad

APTT es un método simple y confiable para detectar la sangre o el plasma a través del mecanismo de coagulación intrínseco. Se probó el APTT para medir la influencia de las nanofibras electrohiladas en el posible retraso de la coagulación sanguínea. El tiempo de coagulación detectado por APTT mostró una disminución estadísticamente significativa de los tiempos de coagulación entre las nanofibras de control PG y 5% CS @ PG y 10% CS @ PG. En contraste, se encontró APTT prolongado después de la incubación de nanofibras de CS @ PG al 15% con PPP, lo que indica su característica anticoagulante mejorada. Como se presenta en la Fig. 6a, el impacto de la coagulación de la sangre dependía del diámetro de las muestras de nanofibras. El menor tiempo de coagulación de APTT se encontró después de la interacción con 5% CS @ PG nanofibrous y el más alto APTT con electrohilado 10% CS @ PG, de manera similar al grado de hemólisis. El tiempo de coagulación se prolongó con el aumento de la relación CS.

Según la ASTM F756-00 (2000), se requiere que la tasa de hemólisis de los biomateriales sea <5% [30]. El grado de hemólisis en este estudio se realizó mediante un ensayo colorimétrico de la hemoglobina liberada de los eritrocitos y se puede calcular mediante la ecuación:Hemólisis (%) =(DO _sam - OD _neg ) / (OD _pos - OD _neg ) × 100%. Como se indica en la Fig. 6b, todas las muestras no fueron hemolíticas y no dieron como resultado ninguna hemólisis marcada (la tasa de hemólisis es inferior al 5%).

Los datos del experimento de viabilidad plaquetaria se muestran en la Fig. 6c. Después de 2 h, la actividad metabólica de los trombocitos unidos fue la más alta con valores máximos alcanzados después de la interacción de PRP con nanofibras, particularmente nanofibras de PG. Curiosamente, después de 24 h, la actividad plaquetaria se redujo en todas las muestras. Este resultado podría deberse a la rápida activación de los trombocitos por la estructura de las nanofibras, lo que resulta en un rápido consumo y liberación de factores de crecimiento en comparación con la activación plaquetaria estable y a largo plazo al entrar en contacto con la superficie lisa [31]. La vida útil normal de los trombocitos es de aproximadamente 8 a 10 días y se acortará a medida que las plaquetas comiencen a activarse.

Tinción de células vivas / muertas

La influencia de CS sobre la citocompatibilidad de las nanofibras se exploró mediante la evaluación de la viabilidad celular, la morfología del adhesivo y la proliferación de HAEC en nanofibras durante 6 días. Las células adheridas se evaluaron mediante el kit de tinción doble de Calceína-AM / PI, tinción DAPI y kit de ensayo CCK-8.

La Figura 7a-e mostró las imágenes de fluorescencia de HAECs vivas y muertas unidas a las diferentes nanofibras. Se utilizaron calceína-AM (verde) y PI (rojo) para teñir las células vivas y las células muertas, respectivamente. Se pudo observar que las células vivas se adhirieron a las nanofibras compuestas de CS @ PG, lo que indicó que las nanofibras que contenían diferentes proporciones de CS no tenían toxicidad para las HAEC. Se examinó un análisis cuantitativo adicional del número de células vivas / muertas en las nanofibras mediante la Imagen J (Fig. 7f). En comparación con la proporción de células vivas y muertas en nanofibras de PG, los otros tres grupos de PG que contienen diferentes proporciones de CS, especialmente los grupos 10% CS @ PG y 15% CS @ PG exhibieron un mayor porcentaje de células vivas, y el porcentaje se incrementó con el aumento de la concentración de CS. Este resultado mostró que la presencia de CS en las nanofibras era ventajosa para mantener la viabilidad celular [32].

Comportamiento de adhesión celular en nanofibras

Los andamios nanofibrosos con buena biocompatibilidad se consideran el requisito principal para la generación de vasos sanguíneos. PCL con buena biodegradabilidad y Gt natural con excelente biocompatibilidad se utilizaron ampliamente en ingeniería de tejidos con diferentes estructuras, incluidos hidrogeles, nanofibras electrohiladas y andamios tridimensionales [21, 33, 34]. La morfología de las HAEC en las nanofibras compuestas y la interacción célula-materiales a las 24 h se observó mediante microscopio de fluorescencia. La densidad celular 10% CS @ PG y 15% CS @ PG fue estadísticamente significativa que PG y 5% CS @ PG, indicó que la adición de CS a un nivel más alto promueve la adhesión celular. Como se muestra en la Fig. 8c, el área unicelular de CS @ PG al 5% y CS @ PG al 15% era mayor que la de los otros grupos de nanofibras. Sin embargo, el alargamiento celular de CS @ PG al 10% fue significativamente mayor que PG, CS @ PG al 5% y CS @ PG al 15% (Fig. 8d). Este resultado podría explicarse que la adición de CS al 10% de concentración puede facilitar la propagación de HAEC. Se descubrió que las HAEC podían adherirse, extenderse y crecer bien en las nanofibras compuestas, especialmente 10% CS @ PG y 15% CS @ PG. Por lo tanto, estos dos materiales de nanofibras pueden considerarse un material vascular candidato seguro y prometedor en la aplicación clínica.

Proliferación celular

El crecimiento celular y la viabilidad en nanofibras CS @ PG se investigaron in vitro mediante microscopio de fluorescencia y prueba CCK-8 (Fig. 9a-c). El andamio PG electrohilado se seleccionó como control positivo. The results of the CCK-8 assay for different nanofibrous films are displayed in Fig. 9c. In 2, 4, 6 days of cells culturing, the cell number increased with the culture time for all groups. On day 6, the OD value of 10%CS@PG nanofibers was significantly higher than that of the PG scaffold. The cell proliferation comparison of 5%CS@PG, 10%CS@PG, and 15%CS@PG indicated that the cell proliferation rate was increased as the CS presence in composite nanofibers in a certain range. However, the cell proliferation capability was also influenced by the surface morphology of nanofibrous materials. Since the 15%CS@PG nanofiber exhibited strong viscosity due to the higher CS ratio in electrospinning polymeric solution, cell proliferation might be affected.

Conclusions

In summary, biomimetic CS@PG composite nanofibers were successfully fabricated using electrospinning technology. Changed fiber morphology and diameter were obtained by varying CS concentrations in PG nanofibers. The CS@PG nanofibers possessed appropriate porosity (~ 80%) and PBS solution absorption (up to 650%). The incorporation of CS in PG nanofibers significantly improved their anticoagulant properties, prolonged their coagulation time, and enhanced cellular responses. Particularly, 10%CS@PG nanofibers exhibited favorable cell adhesion, elongation, and proliferation. Therefore, the PG composite nanofibers incorporated with a certain amount of CS inhibited antithrombogenicity and enhanced endothelial cell responses, which could be developed as a promising tissue-engineering scaffold in blood vessel repair and regeneration.

Disponibilidad de datos y materiales

All data generated or analyzed during this study are included within this article.

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