Nanofibras de Gelatina/Policaprolactona mejoradas con Sulfato de Condroitina: Andamio antitrombogénico con afinidad endotelial superior para ingeniería tisular vascular

Resumen

Las nanofibras poliméricas electrohiladas han ganado mucha atención en ingeniería tisular de vasos sanguíneos. Sin embargo, los materiales nanofibrosos convencionales con deficiencias de endotelización lenta y trombosis no son efectivos para promover la reparación y regeneración de tejido vascular. Aquí, se desarrollaron nanofibras compuestas biomiméticas de gelatina (Gt)/policaprolactona (PCL) incorporando diferentes cantidades de sulfato de condroitina (CS) mediante tecnología de electrohilado para investigar sus efectos en antitrombogenicidad y afinidad de células endoteliales. Las concentraciones variables de CS en nanofibras PG afectan la morfología y diámetro de la fibra. Las nanofibras CS/Gt/PCL tienen porosidad adecuada (~ 80%) y absorción de solución PBS (hasta 650%). La introducción de CS en nanofibras Gt/PCL mejora enormemente sus propiedades anticoagulantes, prolonga su tiempo de coagulación y facilita respuestas celulares. Particularmente, nanofibras 10%CS/Gt/PCL muestran adhesión, elongación y proliferación celular favorables. Así, las nanofibras Gt/PCL conteniendo cierta cantidad de CS podrían ser excelentes candidatos como andamio prometedor de ingeniería tisular en reparación y regeneración vascular.

Introducción

El desarrollo de materiales nanofibrosos ha suscitado mucha atención como andamios biomiméticos en reparación y regeneración tisular debido a sus características (bio)fisicoquímicas únicas, incluyendo su estructura de fibra ultrafina similar a matriz extracelular (MEC), excelentes propiedades mecánicas, gran área superficial específica y alta porosidad con interconectividad [1, 2]. Se ha demostrado que las estructuras nanofibrosas juegan un papel clave en la mediación de respuestas celulares, como adhesión celular, morfología (p. ej., extensión, alineación, elongación, etc.), disposición, migración, proliferación, fenotipo y diferenciación mediante guía de contacto [3,4,5]. Mientras numerosas estrategias de nanofabricación (p. ej., nanoskiving, síntesis por molde, separación de fase, etc.) han proporcionado tecnología disponible para fabricar materiales nanofibrosos, el electrohilado es uno de los métodos más efectivos para fabricar nanofibras de diferentes materiales (metales, cerámica, polímero, materiales compuestos, etc.) a escala industrial [6,7,8].

Además de señales (bio)físicas, la selección de biomateriales adecuados puede afectar significativamente actividades celulares así como reparación y regeneración tisular [9]. Algunas características clave, como biocompatibilidad, biorreabsorbibilidad, propiedades mecánicas y biofunción, deben considerarse [9, 10]. Comparado con compuestos natural/natural y sintético/sintético, los materiales nanofibrosos compuestos consistiendo en polímeros naturales y sintéticos han recibido más atención debido a la combinación de las excelentes características biológicas de polímeros naturales y la resistencia mecánica de polímeros sintéticos [9]. Entre ellos, la combinación gelatina (Gt)/policaprolactona (PCL) es uno de los sistemas híbridos natural-sintético más representativamente investigados y ampliamente usado en ingeniería tisular vascular sanguínea [11,12,13,14]. Sin embargo, las nanofibras compuestas Gt/PCL aún tienen algunas limitaciones, como endotelización lenta y trombosis. Recientemente, el sulfato de condroitina (CS) es un polisacárido sulfatado que contiene glicosaminoglicano y galactosamina, que ha demostrado poseer alta adhesión a células endoteliales (CE), interacción débil con proteínas y plaquetas, así como repulsión electrostática de componentes sanguíneos cargados negativamente [15,16,17]. Además, CS podría inhibir apoptosis celular y facilitar la curación de heridas vasculares [18, 19]. Por tanto, las nanofibras electrohiladas Gt/PCL (PG) incorporando CS serían excelentes candidatos como andamio de ingeniería tisular bioinstructivo para reparación y regeneración vascular.

En el presente trabajo, nanofibras compuestas biomiméticas PG conteniendo diferentes ratios de CS se desarrollaron mediante electrohilado en un solo paso. La morfología, característica química, porosidad y degradación de nanofibras compuestas CS/PG se detectaron por diferentes técnicas de caracterización. Se evaluó la anticoagulación de nanofibras compuestas PG/CS. Además, estas nanofibras compuestas con diferentes ratios de CS se sembraron con células endoteliales aórticas humanas (HAEC) para investigar sus efectos en respuestas celulares.

Materiales y métodos

Materiales

CS (tráquea bovina, tipo A, pureza: 95%) fue suministrado por Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China). PCL se obtuvo de Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (China). Gt (piel bovina, tipo B) se obtuvieron de Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd. (China). El kit de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) se compró de Leigen Biotechnology Co., Ltd (China). Ácido acético (pureza: 99,5%) se compró de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (China). Las células endoteliales aórticas humanas (HAEC) se obtuvieron del hospital afiliado de la Universidad de Qingdao (China). Medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), suero fetal bovino (SFB), tripsina-EDTA 0,25% se compraron de Biological Industries (Israel). Todos los reactivos se compraron de Sigma Aldrich (China) a menos que se indique lo contrario. El agua usada en todos los experimentos fue desionizada.

Electrohilado de nanofibras

PCL (10% p/v) se disolvió en ácido acético bajo agitación mecánica a temperatura ambiente durante 4 h. Gt (10% p/v) se disolvió en ácido acético al 90% con agitación constante durante 2 h. CS en diferentes concentraciones se añadió a la solución de Gt y se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 1 h para obtener soluciones homogéneas conteniendo 5, 10 y 15% p/p CS relativo a la concentración total de polímero. Luego, la solución PG se preparó mezclando las dos soluciones anteriores en proporción de peso 50/50 (p/p) bajo agitación durante 2 h, denominadas 5%CS@PG, 10%CS@PG y 15%CS@PG.

Las soluciones homogéneas preparadas se sometieron al proceso de electrohilado, equipado con jeringa de 1 mL con aguja 21 G y colector cubierto con papel aluminio. En este estudio, la distancia entre la placa colectora y la punta de la aguja se fijó en ~18 cm, el voltaje se estableció en 23 kV, y las soluciones poliméricas se bombearon a una tasa de 1 mL/h. Todas las soluciones se electrohilaban en un instrumento de electrohilado (Technology, Tk602TH, China) a temperatura ambiente y humedad controlada cuidadosamente (< 40%). Antes de cualquier experimento adicional, las muestras se pusieron en horno de secado al vacío durante al menos 72 h para eliminar cualquier solvente residual.

Microscopía electrónica de barrido (MEB) y microscopio electrónico de transmisión (MET)

La morfología de andamios nanofibrosos CS@PG se investigó por MEB (VEGAS, TESCAN, Checo) a voltaje de aceleración 20 kV a temperatura ambiente. El diámetro de nanofibras (n = 100) se midió además de imágenes MEB usando software de análisis de imágenes (Image J).

Las observaciones MET y análisis de espectroscopía de rayos X dispersiva en energía (EDX) se realizaron usando JEOL JEM-2100 plus (Japón).

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

FTIR se realizó con espectrómetro Nicolet iN10 FTIR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar grupos funcionales característicos de CS, nanofibra PG y nanofibras CS@PG. Los espectros de muestras se registraron en modo transmisión sobre rango de longitud de onda 4000-500 cm⁻¹ con resolución 2 cm⁻¹.

Porosidad y absorción de solución fosfato-salina (PBS)

La porosidad de nanofibras se realizó usando método de desplazamiento líquido. Primero, el peso seco de nanofibras se pesó como W₁. Luego, cuatro grupos de nanofibras se sumergieron en etanol 2 h a 25 °C y pesaron como W₂. El etanol en la superficie de la muestra se eliminó con papel filtro, y los pesos de muestras se notaron como W₃. La porosidad de nanofibras se calculó por la fórmula:

Porosidad (%) = (W₃ - W₁) / (W₃ - W₂) × 100

Para la prueba de absorción de solución PBS, las nanofibras obtenidas se pesaron en estado seco y registraron como Wd. Luego, las nanofibras se remojaron en PBS 24 h a 25 °C y el peso en estado húmedo se registró como Ww tras eliminar el líquido excedente en la superficie de la muestra. La relación de hinchamiento se midió por la ecuación:

Absorción PBS (%) = (Ww - Wd) / Wd × 100

Todos los valores en los experimentos anteriores se expresan como media ± DE (n = 3).

Comportamiento de degradabilidad in vitro

Para determinar la resistencia de nanofibras obtenidas a lisozima, la degradabilidad de muestras se midió en tiempos programados (1, 4, 7, 10 y 14 días). El peso inicial de nanofibras se registró como W_i. Luego, las muestras se sumergieron en solución PBS (pH 7,4) conteniendo lisozima (500 µg/mL) e incubaron in vitro a 37 °C. En intervalos de degradación predeterminados, cada grupo de muestras se retiró y lavó con agua desionizada, y liofilizó para obtener peso final (W_f). La solución de lisozima se cambió tres veces por semana. La masa restante (%) de andamios nanofibrosos se estimó como se define en la fórmula:

Masa restante (%) = (1 - (W_i - W_f) / W_i) × 100%

Para evaluar el comportamiento de degradación de la muestra tras 7 días, la morfología de nanofibras se observó por MEB.

Análisis de hemocompatibilidad

Tiempos de coagulación

El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) se usó para evaluar la actividad de vías intrínseca y común de coagulación probando tiempos de coagulación de plasma pobre en plaquetas (PPP) tras incubación con nanofibras electrohiladas en cubreobjetos. Para esto, sangre anticoagulada (~10 mL) se recogió y centrifugó a 3000 rpm 20 min para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). Cada muestra se incubó con 200 µL PPP 10 min a 37 °C y analizó usando kit TTPa siguiendo instrucciones del fabricante (n = 3).

Prueba de hemólisis

La tasa de hemólisis se evaluó midiendo la concentración de hemoglobina liberada en la fase de solución de eritrocitos en sangre total diluida expuesta a nanofibras electrohiladas. Las muestras en cubreobjetos se colocaron individualmente en placas de 24 pocillos e inmersaron en 2 mL PBS a 37 °C 30 min. Los grupos control negativo contenían solo 2 mL PBS, mientras grupos control positivo comprendían 2 mL agua desionizada para inducir lisis máxima de eritrocitos (n = 3 cada grupo de prueba). Luego, 40 µL de sangre total fresca anticoagulada mencionada se añadió a cada pocillo e incubó 60 min a 37 °C, tras lo cual las suspensiones se retiraron a tubos de centrífuga y centrifugaron a 100× g 5 min. Los sobrenadantes se sometieron a medir absorbancia a 570 nm usando lector de microplacas (SynergyH1/H1M, BioTek, China).

Trombogenidad

El potencial trombogénico se evaluó in vitro tras incubación de muestras electrohiladas con plasma rico en plaquetas (PRP). PRP se preparó por centrifugación (1500 rpm, 20 min) y se descartó la mitad superior de plasma. Luego, las nanofibras en cubreobjetos se incubaron en 100 µL PRP a 37 °C 2 h y se enjuagaron suavemente con PBS tres veces para experimentos subsiguientes. Para evaluar la actividad plaquetaria tras incubación con PRP, las nanofibras electrohiladas se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% SFB 2 h y 24 h, y luego se utilizó kit CCK-8 para medir viabilidad trombocitaria en nanofibras. CCK-8 (20 µL) se añadió a 200 µL DMEM sin suero en placas 24 pocillos e incubó 1 h. Finalmente, las suspensiones se midieron por lector de microplacas a longitud de onda 450 nm.

Cultivo celular y viabilidad celular

Las células endoteliales aórticas humanas (HAEC) se cultivaron en DMEM suplementado con SFB (10%, v/v), y estreptomicina/penicilina (1%, v/v) en atmósfera 37 °C y 5% CO₂. El medio de cultivo se cambió tres veces por semana. Las células se aislaron generalmente por tripsina/EDTA 0,05% 3 min, centrifugaron a 1000 rpm, y suspendieron en medio fresco para realizar paso celular o siembra.

Antes de siembra celular, todos los materiales nanofibrosos en placa 24 pocillos se esterilizaron bajo irradiación UV 1 h e inmersaron en etanol 75% (v/v, %) 1 h. Luego, las nanofibras se enjuagaron cuatro veces con solución PBS y remojaron en DMEM 12 h en incubadora CO₂. Las células se sembraron a densidad 1 × 10⁴ células por pocillo en nanofibras y el medio se cambió cada día. Tras co-cultivo 24 h, las células se lavaron con solución PBS tres veces y luego se tiñeron con Kit Doble Tinción Calcein-AM/PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). PI se usó para teñir células muertas y Calcein-AM para células vivas.

Morfología celular en nanofibras

Para observar adhesión celular en nanofibras, la morfología de células se observó tras co-cultivo 24 h por Microscopio de Fluorescencia (Nikon A1 MP, Japón). Primero, las células se fijaron con paraformaldehído 4% a temperatura ambiente 30 min. Luego, solución Triton X-100 0,5% se usó 5 min para permeabilizar membrana celular. Finalmente, 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se usó para teñir núcleos celulares y rodamina-faloidina para teñir F-actina. Análisis cuantitativo (densidad celular, área monocelular, elongación celular) se realizó además con Image J.

Proliferación celular

La actividad de proliferación celular en nanofibras compuestas se realizó con Kit Ensayo CCK-8. Las HAEC se sembraron en nanofibras a densidad 8 × 10³ células/pocillo. El medio de cultivo se cambió cada dos días. Tras 1, 4, 7 días de co-cultivo, las células se lavaron con solución PBS para eliminar células no adheridas. Luego, 20 µL CCK-8 y medio completo a proporción volumen 1:10 se añadió a placa 24 pocillos 1 h en incubadora. La absorbancia se probó por Lector Elisa a 450 nm.

La tinción celular con DAPI y rodamina-faloidina se realizó con Microscopio de Fluorescencia para observar directamente cambios en recuentos celulares tras co-cultivo con diferentes nanofibras por dos y seis días.

Análisis estadístico

Todas las muestras en experimentos se procesaron en triplicado. Todos los datos se representan como medias ± desviaciones estándar (DE). El análisis estadístico de muestras se determinó por análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar diferencias con significancia asignada en p < 0,05.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de nanofibras CS@PG

La Fig. 1 muestra el diagrama esquemático del proceso de electrohilado para andamios nanofibrosos CS@PG y evaluación in vitro de anticoagulación y citocompatibilidad. Para desarrollar andamios tisulares vasculares ingenierizados para promover proliferación de células endoteliales, diferentes ratios de CS (5, 10 y 15% p/p) se incorporaron en soluciones PG (10%, v/v) para fabricar nanofibras compuestas mediante proceso de electrohilado.

MEB se realizó para observar estructura de nanofibras electrohiladas CS@PG. Como se muestra en Fig. 2, las imágenes MEB de nanofibras PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG exhibieron arquitectura fibrosa densa, conteniendo fibras continuas, lisas y nanoescalares por técnica de electrohilado. Las nanofibras PG (Fig. 2a) mostraron muchas cuentas irregulares en nanofibras a través del proceso de electrohilado, teniendo diámetro promedio 406,01 ± 146,28 nm. Podría explicarse que 10% p/v de solución electrohilada exhibió baja viscosidad, resultando en formación de nanofibras inhomogéneas conteniendo cuentas [20]. Con el aumento de cantidad de CS en solución polimérica de 5 a 10% p/p, nanofibras homogéneas sin cuentas pudieron lograrse debido al aumento de viscosidad de solución (Fig. 2b, c). Correspondientemente, 5%CS@PG y 10%CS@PG mostraron diámetro promedio menor de 382,35 ± 152,99 nm y 300,29 ± 100,85 nm, respectivamente. Este resultado es principalmente porque el aumento de contenido CS correspondientemente mejoró la conductividad de solución de electrohilado [20]. Sin embargo, cuando la concentración polimérica subió a 15%, la viscosidad de la solución polimérica es demasiado alta para ser estirada en el campo eléctrico. A la misma tasa de flujo 1 mL/h que grupos previos, observamos que bajo voltaje aplicado 23 kV, apareció fenómeno de obstrucción de punta de aguja y el cono Taylor no pudo observarse. Por tanto, la tasa de flujo de solución electrohilada y el voltaje aplicado se ajustaron a 0,9 mL/h y 20 kV, respectivamente. Las nanofibras 15%CS@PG se produjeron con éxito con diámetro promedio 266,92 ± 105,43 nm.

Como se muestra en Fig. 3a, se encontró que CS se distribuía uniformemente en nanofibras 5%CS@PG y 10%CS@PG. Sin embargo, agregación CS se detectó en fibras 15%CS@PG. Como indica Fig. 3b, análisis elemental EDX se realizó para detectar contenido azufre de fibras preparadas. Como esperado, el contenido azufre aumentó con concentración aumentada CS en fibras obtenidas.

Análisis espectros FTIR

El análisis espectros FTIR se realizó para determinar picos de absorción característicos del grupo químico de andamios nanofibrosos preparados. El espectro FTIR de PG y CS se consideraron como grupo control para comparar con grupos nanofibra CS@PG. En espectro PG, bandas de absorción fuerte aparecidas en 3300 cm⁻¹ y 2935 cm⁻¹ pueden atribuirse a vibración estiramiento -NH₂ y -OH, y estiramiento asimétrico CH₂, respectivamente. Varios picos característicos aparecieron en 1652 cm⁻¹ (amida I) para vibración estiramiento C=O, 1542 cm⁻¹ (amida II) para vibración flexión N-H, 1441 cm⁻¹ para estiramiento CH₂, y 1267 cm⁻¹ (amida III) para vibración estiramiento C-N [21, 22]. El espectro CS mostró banda absorción característica en 1245 cm⁻¹, representando vibración estiramiento S=O en SO₄²⁻ cargado negativamente [23, 24].

Como se muestra en Fig. 4, los espectros FTIR de nanofibras 5%CS@PG, 10%CS@PG y 15%CS@PG mostraron picos característicos de PCL, Gt y CS juntos. Comparado con espectros grupo PG, grupos CS@PG mostraron banda característica CS en 1245 cm⁻¹, y la intensidad de banda CS aumentó por presencia CS en nanofibras. Este hallazgo confirmó la presencia de contenidos variables CS en nanofibras electrohiladas CS@PG.

Porosidad, relación hinchamiento y degradabilidad de nanofibras

La alta porosidad de la fibra indica que el material tiene excelente interconectividad, lo que conduce a difusión de oxígeno y nutrientes en poros y promueve infiltración celular [25, 26]. La Fig. 5a muestra la porosidad de películas nanofibrosas. La porosidad de nanofibras obtenidas conteniendo diferentes ratios CS fue aproximadamente hasta 80%. La alta arquitectura porosa obtenida por nanofibras electrohiladas puede imitar la MEC natural, proporcionando así microambiente 3D favorable para células [27]. Se ha reportado que andamios en ingeniería tisular con porosidad hasta 80% fue benéfico para transporte nutrientes y metabolitos.

La relación absorción PBS de andamios nanofibrosos CS@PG se comparó para evaluar efecto CS en captación PBS de películas. Como indica Fig. 5b, la relación absorción PBS de andamio PG fue 586,34 ± 49,44%, y nanofibras 5%CS@PG y 10%CS@PG fueron 492,86 ± 21,99% y 510,04 ± 69,55%, respectivamente. La relación absorción PBS de grupos 15%CS@PG (665,07 ± 59,81%) fue significativamente mayor que 5%CS@PG y 10%CS@PG. Este resultado indicó que el contenido aumentado CS en nanofibras compuestas podría mejorar propiedad captación PBS de películas, lo que podría deberse a alta hidrofilicidad en moléculas CS conteniendo grupos hidrofílicos (carboxilo e hidroxilo) [28].

Los datos de experimento degradabilidad in vitro se muestran en Fig. 5c, y se encontró que con aumento ratio CS, la tasa degradación de andamios nanofibrosos CS@PG también aumentó. Esto podría atribuirse a presencia grupos SO₄²⁻ [29]. Como demuestra Fig. 5c, la tasa degradación de la mayoría andamios comenzó a aumentar tras 7 días, y resultados degradación día 14 fueron 8,45%, 11,39%, 13,97% y 15,10% para PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG y 15%CS@PG andamios nanofibrosos, respectivamente. Las imágenes MEB de andamios nanofibrosos (Fig. 5d) mostraron ligero hinchamiento tras sumergir en solución PBS 7 días. Las imágenes MEB indican que las nanofibras desarrolladas fueron lo bastante estables para evitar degradación y expansión serias hasta 7 días, afectando así respuesta celular in vivo o in vitro.

Evaluación hemocompatibilidad

TTPa es método simple y fiable para detectar sangre o plasma vía mecanismo coagulación intrínseco. TTPa se probó para medir influencia nanofibras electrohiladas en posible retraso coagulación sanguínea. Tiempo coagulación detectado por TTPa mostró disminución estadísticamente significativa tiempos coagulación entre control PG y nanofibras 5%CS@PG y 10%CS@PG. En contraste, TTPa prolongado se encontró tras incubación nanofibras 15%CS@PG con PPP, indicando su característica anticoagulante mejorada. Como presenta Fig. 6a, el impacto coagulación sanguínea dependía del diámetro muestras nanofibra. El menor tiempo coagulación TTPa se encontró tras interacción con nanofibras 5%CS@PG y el mayor TTPa con nanofibras electrohiladas 10%CS@PG, similarmente al grado hemólisis. El tiempo coagulación se prolongó con aumento ratio CS.

Según ASTM F756-00 (2000), la tasa hemólisis de biomateriales requiere ser < 5% [30]. El grado hemólisis en este estudio se realizó usando ensayo colorimétrico hemoglobina liberada eritrocitos y puede calcularse por ecuación: Hemólisis (%) = (DO_sam - DO_neg)/(DO_pos - DO_neg) × 100%. Como indica Fig. 6b, todas las muestras fueron no hemolíticas y no resultaron en hemólisis marcada (tasa hemólisis < 5%).

Los datos experimento viabilidad plaquetaria se muestran en Fig. 6c. Tras 2 h, la actividad metabólica trombocitos adheridos fue la más alta con valores máximos alcanzados tras interacción PRP con nanofibras, particularmente nanofibras PG. Curiosamente, tras 24 h, la actividad plaquetaria redujo en todas las muestras. Este resultado podría deberse a activación rápida trombocitos por estructura nanofibras, resultando en consumo rápido y liberación factores crecimiento comparado con activación plaquetaria estable y a largo plazo al contacto con superficie lisa [31]. La vida normal trombocitos es aproximadamente 8-10 días, y se acortará al empezar activar plaquetas.

Tinción células viva/muerta

La influencia CS en citocompatibilidad nanofibras se exploró por viabilidad celular, morfología adhesiva y proliferación HAEC evaluación en nanofibras 6 días. Las células adheridas se evaluaron usando Kit Doble Tinción Calcein-AM/PI, tinción DAPI y kit ensayo CCK-8.

La Fig. 7a-e muestra imágenes fluorescencia células HAEC vivas y muertas adheridas a diferentes nanofibras. Calcein-AM (verde) y PI (rojo) se usaron para teñir células vivas y muertas, respectivamente. Se observó que células vivas se adherían en nanofibras compuestas CS@PG, indicando que nanofibras conteniendo diferentes ratios CS no tenían toxicidad para HAEC. Análisis cuantitativo adicional número células viva/muerta en nanofibras se examinó por Image J (Fig. 7f). Comparado con proporción células vivas/muertas en nanofibras PG, los otros tres grupos PG conteniendo diferentes ratios CS, especialmente grupos 10%CS@PG y 15%CS@PG exhibieron mayor porcentaje células vivas, y el porcentaje aumentó con aumento concentración CS. Este resultado mostró que la presencia CS en nanofibras fue ventajosa para mantener viabilidad celular [32].

Comportamiento adhesión celular en nanofibras

Andamios nanofibrosos con buena biocompatibilidad se consideran requisito primario para generación vasos sanguíneos. PCL con buena biodegradabilidad y Gt natural con excelente biocompatibilidad se usaron ampliamente en ingeniería tisular con diferentes estructuras, incluyendo hidrogeles, nanofibras electrohiladas y andamios tridimensionales [21, 33, 34]. La morfología HAEC en nanofibras compuestas e interacción célula-material a 24 h se observó por microscopio fluorescencia. La densidad celular 10%CS@PG y 15%CS@PG fue estadísticamente significativa que PG y 5%CS@PG, indicando que adición CS a nivel superior promueve adhesión celular. Como muestra Fig. 8c, el área monocelular 5%CS@PG y 15%CS@PG fue mayor que otros grupos nanofibras. Sin embargo, la elongación celular 10%CS@PG fue significativamente mayor que PG, 5%CS@PG y 15%CS@PG (Fig. 8d). Este resultado podría explicarse que adición CS a concentración 10% facilita extensión HAEC. Se encontró que HAEC podían adherir, extender y crecer bien en nanofibras compuestas, especialmente 10%CS@PG y 15%CS@PG. Así, estos dos materiales nanofibra pueden considerarse candidatos vasculares seguros y prometedores en aplicación clínica.

Proliferación celular

El crecimiento y viabilidad celular en nanofibras CS@PG se investigaron in vitro por microscopio fluorescencia y prueba CCK-8 (Fig. 9a-c). El andamio electrohilado PG se seleccionó como control positivo. Los resultados del ensayo CCK-8 para diferentes películas nanofibrosas se muestran en Fig. 9c. En 2, 4, 6 días cultivo celular, el número celular aumentó con tiempo cultivo para todos los grupos. En día 6, el valor DO de nanofibras 10%CS@PG fue significativamente mayor que andamio PG. La comparación proliferación celular 5%CS@PG, 10%CS@PG y 15%CS@PG indicó que la tasa proliferación celular aumentó conforme presencia CS en nanofibras compuestas en cierto rango. Sin embargo, la capacidad proliferación celular también fue influenciada por morfología superficial materiales nanofibrosos. Dado que nanofibra 15%CS@PG exhibió fuerte viscosidad debido a mayor ratio CS en solución polimérica electrohilado, la proliferación celular podría verse afectada.

Conclusiones

En resumen, nanofibras compuestas biomiméticas CS@PG se fabricaron con éxito usando tecnología electrohilado. Se obtuvieron morfología y diámetro fibra cambiados variando concentraciones CS en nanofibras PG. Las nanofibras CS@PG poseían porosidad adecuada (~ 80%) y absorción solución PBS (hasta 650%). La incorporación CS en nanofibras PG mejoró significativamente sus propiedades anticoagulantes, prolongó tiempo coagulación y mejoró respuestas celulares. Particularmente, nanofibras 10%CS@PG exhibieron adhesión, elongación y proliferación celular favorables. Por tanto, las nanofibras compuestas PG incorporadas con cierta cantidad CS inhibieron antitrombogenicidad y mejoraron respuestas células endoteliales, que podrían desarrollarse como andamio prometedor ingeniería tisular en reparación y regeneración vascular.

Disponibilidad datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo.