Potencial de activación antiproliferativa y de apoptosis de nanopartículas de lípidos dirigidos a base de paclitaxel con internalización celular mejorada por receptores de transferrina:un estudio en células leucémicas

Métodos

Materiales

Compritol 888 ATO (comportamiento de glicerol) fue proporcionado amablemente por Gattefosse (China). El colesterol, el ácido oleico y el paclitaxel se adquirieron en Sigma-Aldrich, China. La transferrina humana (Tf) se adquirió en Sigma-Aldrich, China. Todos los demás productos químicos eran de grado reactivo y se utilizaron como tales.

Preparación de nanopartículas lipídicas sólidas conjugadas con transferrina cargadas con paclitaxel

El conjugado de transferrina-PEG-ácido oleico (Tf-PEG-OA) se sintetizó basándose en la interacción del enlace amida [18]. Brevemente, se disolvieron ácido oleico, NHS y DCC en una relación molar de 1:2:2 en disolvente orgánico y se agitaron durante 16 h. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente. Por separado, se disolvió NH2-PEG-COOH en DMSO y se añadió trietilamina y se dejó reaccionar hasta 12 h en atmósfera inerte. El PEG-OA así formado se recogió mediante diálisis y proceso de liofilización. Ahora, se disolvieron PEG-OA, DCC y NHS en una relación molar de 1:2:2 en DMSO y se añadió transferrina (junto con TEA) a la mezcla de reacción y la reacción se llevó a cabo en atmósfera inerte durante 12 h. La formulación que contiene Tf-PEG-OA así formada se dializó durante 48 horas y luego se liofilizó y se almacenó bajo el procesamiento adicional de experimentos.

El SLN se preparó mediante el método de evaporación de disolvente [19]. Brevemente, se disolvieron PTX, Compritol 888 ATO, colesterol y Tf-PEG-OA en una mezcla orgánica que consistía en etanol / cloroformo (1:5) y se agitó durante 30 min. La solución orgánica resultante se añadió lentamente en una fase acuosa que contenía alcohol polivinílico al 1% y se homogeneizó inmediatamente usando un homogeneizador T25 (IKA, Bangalore, India) a 12.000 rpm. A continuación, la solución se sonicó con sonda durante 3 min. La dispersión se agitó durante 12 h hasta que se evaporaron todos los disolventes orgánicos. El fármaco libre no atrapado se separó de las nanopartículas cargadas con fármaco con agua tres veces usando un filtro centrífugo Amicon Ultra-4 (Millipore Corporation, Bedford, EE. UU.). La eficiencia de atrapamiento (EE) y la eficiencia de carga (LE) se determinaron mediante el método de HPLC. La nanopartícula cargada con fármaco era metanol y se agitó durante 30 min y se diluyó con un volumen igual de agua. La cantidad de fármaco cargada se calculó inyectando en la columna de HPLC. La nanopartícula de lípidos cargada con el fármaco se almacenó a 4 ° C hasta su uso posterior.

Caracterización física de nanopartículas

El tamaño de partícula y la distribución de diferentes nanopartículas se evaluaron mediante el método de dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando Zetasizer ZS Nano Malvern Instruments, Reino Unido. Las partículas se diluyeron con agua destilada y se utilizaron para el análisis. El estudio se realizó a temperatura ambiente por triplicado.

La morfología de las nanopartículas se observó mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM) utilizando JEM-2000EX (JEOL, Japón). Las nanopartículas se tiñeron con ácido fosfotungístico y se dejaron reposar durante 15 min. A continuación, se escurrieron las partículas del agua y se secaron en luz infrarroja durante 5 min. Se obtuvieron imágenes de las partículas usando TEM.

Estudio de liberación de fármacos in vitro

Las características de liberación de fármaco in vitro de dos nanopartículas se estudiaron mediante el método de diálisis. Brevemente, se empaquetó 1 ml de dispersiones de nanopartículas en una bolsa de membrana de diálisis (MWCO:3500) con ambos extremos de la membrana sellados correctamente. El experimento de liberación se inició colocando la bolsa de diálisis sellada en los extremos en 10 ml de medio de liberación en un agitador automático a una velocidad de 100 rpm. En un momento específico, se recogió 1 ml de muestra y se analizó la liberación del fármaco usando HPLC. Sistema de HPLC Perkin Elmer (Norwalk, EE. UU.) Equipado con una bomba (serie 200), desgasificador de vacío en línea (serie 200), muestreador automático (serie 200), horno de columna (serie 200), un detector UV / VIS (serie 200) ) se utilizó. Se utilizó una columna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) protegida con cartucho protector de precolumna RP18 (30 × 4,6 mm, 10 μm; Norwalk, EE. UU.). Se aplicó un gradiente lineal; 0 min, acetonitrilo al 10%; 30 min, acetonitrilo al 90% y analizado a 214 nm.

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad del fármaco libre y las nanopartículas cargadas con fármaco se evaluó mediante el ensayo de bromuro de 4,5- (dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil-tetrazolio (MTT). Las células HL-60 a una densidad de siembra de 8000 células por pocillo se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. A continuación, las células se trataron con fármaco libre y formulaciones cargadas con fármaco a diferentes concentraciones y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C en CO ₂ humidificado. (5%) incubadora. A continuación, las células se trataron con 10 µl de solución de MTT (5 mg / ml) durante 4 h. A continuación, las células se expusieron a DMSO y se incubaron durante 20 min. A continuación, se estudió la absorbancia de los cristales de formazán utilizando un lector de microplacas (Multiskan GO, EE. UU.) A 570 nm. La cantidad de absorbancia de formazán es directamente proporcional a la cantidad de células viables presentes en cada pocillo.

Captación celular de nanopartículas

La eficacia de direccionamiento de las nanopartículas hacia las células leucémicas se evaluó mediante el experimento de captación celular a nivel in vitro. Brevemente, las células HL-60 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de siembra de 3 × 10 ⁵ células por pocillo. Las células se incubaron durante 24 h antes del tratamiento. Para observar la fluorescencia y el seguimiento de las nanopartículas, se cargó la nanopartícula con rodamina B como tinte fluorescente. La nanopartícula cargada con tinte se expuso a las células cancerosas y se incubó durante 3 h. A continuación, las células se lavaron y se montaron en un portaobjetos de vidrio. Luego, las células se observaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, Nikon, Japón).

Ensayo Hoechst 33342

El ensayo de apoptosis cualitativo se realizó usando tinción Hoechst 33342. Brevemente, las células HL-60 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de siembra de 3 × 10 ⁵ células por pocillo. Las células se incubaron durante 24 h antes del tratamiento. Las células se trataron con las respectivas formulaciones y se incubaron durante 24 h. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% durante 10 min. Luego, se observó la apoptosis en las células utilizando un microscopio fluorescente.

Ensayo de apoptosis basado en citómetro de flujo

La apoptosis cuantitativa se evaluó mediante citómetro de flujo mediante tinción con Anexina V y PI. Brevemente, las células HL-60 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de siembra de 3 × 10 ⁵ células por pocillo. Las células se incubaron durante 24 h antes del tratamiento. A continuación, las células se trataron con fármaco libre y formulaciones cargadas de fármaco a diferentes concentraciones y se incubaron adicionalmente durante 24 ha 37ºC en una incubadora de CO2 humidificado (5%). Al día siguiente, las células se lavaron adecuadamente y las células se extrajeron con cuidado. Las células se centrifugaron y el sedimento se trató con 2,5 µl de Anexina V y 2,5 µl de PI, respectivamente, y se incubó durante 15 min. Luego, el volumen se completó hasta 1 ml y la clasificación de las células se realizó utilizando un citómetro de flujo (BD FACS, Biosciences, EE. UU.).

Ensayo de formación de colonias

Las 1000 células / pocillo se sembraron en una placa de 6 pocillos con un volumen de medio ajustado a 2 ml. Se permitió que las células formaran una colonia durante 2 días. Las células se trataron con diferentes formulaciones con una dosis de PTX equivalente a 0,1 µg / ml y se incubaron durante 10 días. Las placas se lavan con PBS y se fijan en metanol y se tiñen con hematoxilina y se lavan y se secan al aire. La densidad de la colonia se contó utilizando un gabinete de luz MultimageTM (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) con la ayuda del software AlphaEaseFCTM.

Análisis estadístico

La importancia de las diferencias se evaluó mediante la t de Student de dos colas pruebas o ANOVA unidireccional. Se consideró que las diferencias eran significativas a un nivel de p <0.05.

Resultados y discusión

La leucemia es un cáncer de sangre típico que se caracteriza por la duplicación y proliferación numerosas de glóbulos blancos. En este estudio, hemos desarrollado una nanopartícula multifuncional que consta de nanopartículas lipídicas sólidas decoradas con transferrina encapsuladas con paclitaxel. Para incorporar la transferrina al SLN, hemos sintetizado un conjugado de Tf-PEG-ácido oleico mediante la conjugación de PEG y ácido oleico que luego se conjugó con la transferrina (Fig. 1). El PEG-ácido oleico-Tf se usa para múltiples propósitos en la preparación de partículas. La presencia de ligando de Tf en la superficie de la partícula mejorará la especificidad diana de las partículas hacia las células cancerosas sobreexpresadas por el receptor. La presencia de PEG en la superficie exterior proporcionará el equilibrio estérico tan necesario que conferirá estabilidad a las partículas individuales. Hemos agregado esta nota al manuscrito.

Presentación esquemática de la preparación de nanopartículas lipídicas sólidas decoradas con transferrina cargadas con PTX

Caracterización fisicoquímica de nanopartículas

La nanopartícula cargada con fármaco se preparó mediante el método de evaporación de disolvente seguido de homogeneización. El tamaño de partícula promedio de las nanopartículas de lípidos cargadas con PTX (PLN) fue ~ 140 nm mientras que el tamaño de partícula final de las nanopartículas de lípidos cargadas con PTX decoradas con transferrina (TPLN) fue ~ 160 nm (Fig. 2a). El ligero aumento en el tamaño de las partículas se atribuyó a la conjugación de transferrina a la superficie de la nanopartícula. Se ha informado que las características de las partículas incluyen el tamaño y la carga, que son factores importantes para su desempeño sistémico. El tamaño y la carga juegan un papel importante en la absorción celular y el efecto tóxico en las células. Se informa que un tamaño de partícula de menos de 200 nm como se observa en el presente estudio es más favorable para la focalización del cáncer, ya que permitirá la acumulación específica de las partículas en el tejido canceroso debido al efecto mejorado de permeación y retención (EPR) [ 9, 20, 21]. De manera similar, la carga superficial de la nanopartícula determina la interacción de la partícula de estabilidad coloidal con la superficie celular. La carga superficial media de TPLN fue - 22,5 ± 1,56 mV, lo que indica su potencial para dirigirse al cáncer. La morfología de la partícula fue a su vez estudiada por TEM (Fig. 2b). Las partículas tenían una forma perfectamente esférica y estaban distribuidas uniformemente en la rejilla TEM. La distribución uniforme de las partículas indica el éxito de la metodología de preparación.

un Distribución del tamaño de partícula de TPLN medida por análisis de dispersión dinámica de luz (DLS). b Medición de la forma de las partículas mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM). Los experimentos de DLS se realizaron por triplicado ( n =3)

Carga de fármaco y liberación de fármaco in vitro

Se observó que la eficiencia de atrapamiento de PTX en nanopartículas era del 92,5 ± 1,35% con una eficiencia de carga activa del 8,6% w / w . Las características de liberación de fármacos in vitro de PLN y TPLN se estudiaron mediante el método de diálisis. El PLN y el TPLN mostraron una liberación sostenida de fármaco del sistema portador, lo que indica su idoneidad para aplicaciones dirigidas al cáncer. Por ejemplo, ~ 30% del fármaco liberado de ambas nanopartículas al final del período de estudio de 24 h (Fig. 3). De manera similar, la liberación del fármaco se mantuvo hasta el final de las 75 h, observándose una liberación promedio de alrededor de ~ 65%. Cabe señalar que TPLN mostró una liberación mucho más sostenida de fármacos en comparación con PLN. La liberación ligeramente menor de fármaco se atribuyó principalmente a la conjugación del ligando de transferrina a la superficie de la nanopartícula. El alto peso molecular de la transferrina podría inhibir en gran medida la liberación del fármaco. En general, la liberación sostenida y prolongada del fármaco desde la nanopartícula indica que el fármaco se dispersa bien con la matriz lipídica, lo que evita la liberación por ráfaga inicial o el patrón de liberación bifásica. En general, una liberación controlada del fármaco del sistema portador podría potenciar el tratamiento del cáncer.

Características de liberación de fármaco in vitro de PTX de PLN y TPLN de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La liberación del fármaco se estudió mediante el método de diálisis y el fármaco se cuantificó mediante el método HPLC. La medición se realizó n =3

Captación celular de las nanopartículas

El potencial de direccionamiento de las nanopartículas hacia la célula cancerosa de leucemia se probó mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Las nanopartículas se expusieron a las células cancerosas y se incubaron durante 3 h. La rodamina B se utilizó como tinte fluorescente para rastrear la distribución de nanopartículas en las células cancerosas. Como se muestra en la Fig. 4, la intensidad de la fluorescencia roja fue relativamente menor en PLN en comparación con la de TPLN. Los resultados mostraron claramente la fluorescencia notablemente más alta en el citoplasma celular en comparación con la del PLN, lo que indica el potencial de direccionamiento superior del TPLN a las células cancerosas. Una intensidad fluorescente notablemente más alta se atribuyó principalmente a la conjugación de transferrina a la superficie de la nanopartícula. La Tf se unió preferiblemente a los receptores de Tf sobreexpresados ​​en las células cancerosas y dio como resultado una mayor acumulación de nanopartículas en las células cancerosas [22].

Análisis de captación celular de TPLN y PLN utilizando microscopio de barrido láser confocal (CLSM) a 37 ° C. Se utilizó rodamina B como colorante fluorescente y se incubó durante 3 h. El análisis de captación celular se realizó después de incubar las nanopartículas durante 3 h a 37 ° C en una incubadora. La barra de escala es de 20 μm

Ensayo de citotoxicidad in vitro

El efecto citotóxico in vitro de PTX, PLN y TPLN libres en células HL-60 se evaluó mediante ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 5, todas las formulaciones exhibieron un efecto citotóxico dependiente de la dosis típico en las células cancerosas de leucemia. Se puede ver que aunque PTX mostró un efecto dependiente de la dosis, sin embargo, PLN mostró un efecto citotóxico relativamente más alto que podría deberse a una mayor captación intracelular y liberación sostenida del fármaco de las nanopartículas. Para ser específicos, TPLN mostró un efecto citotóxico significativamente mayor en las células cancerosas en comparación con el PLN, lo que indica la eficacia de dirección superior del sistema de nanopartículas decoradas con Tf. El valor de CI50 de TPLN fue de 0,45 μg / ml en comparación con 2,8 μg / ml de PLN. Una disminución de seis veces en el valor de CI50 se atribuyó principalmente a la mayor captación intracelular de TPLN en las células cancerosas sobreexpresadas por el receptor de Tf. Un mayor potencial de suministro de TPLN en comparación con PLN y la liberación sostenida del fármaco al objetivo nuclear podría ser la principal razón que contribuya al mayor efecto citotóxico en las células cancerosas. Los nanoportadores decorados con Tf se han explorado como un objetivo para administrar medicamentos contra el cáncer en las células cancerosas, disminuyendo así la concentración efectiva del medicamento administrado y superando los factores relacionados con la resistencia a múltiples medicamentos (MDR) [23].

Análisis de citotoxicidad del fármaco libre y nanopartículas cargadas con fármaco mediante ensayo MTT. Después de tratar las células con diferentes concentraciones de fármacos e incubarlas durante 24 h, las células se analizaron mediante ensayo MTT y utilizando un lector de placas. La medición se realizó n =6. * p <0.05 es la diferencia estadística entre TPLN y PTX

Ensayo de apoptosis Hoechst 33342

El potencial citotóxico de las nanopartículas se evaluó adicionalmente mediante el ensayo de apoptosis Hoechst 33342. Las células después del tratamiento con la formulación respectiva se tiñeron con Hoechst 33342 y se incubaron durante 15 min. Como se ve en la Fig. 6, las células de control no tratadas eran esféricas con características típicas de las células sanas. Sin embargo, las células tratadas con PTX mostraron irregularidades en la forma de las células. En el grupo tratado con PLN se pudo observar una apoptosis y un daño celular típico que podría deberse al aumento de la captación en las células cancerosas. TPLN indujo una apoptosis muy notable de las células cancerosas y muchas de las células se distorsionaron con una gran presencia de la formación de cuerpos apoptóticos. La notable escisión celular y la inducción de la apoptosis fue consistente con las patentes de viabilidad celular descritas en el párrafo anterior.

Ensayo de apoptosis basado en Hoechst 33342. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 y la apoptosis se analizó mediante microscopio de fluorescencia. Las células se incubaron con las respectivas formulaciones durante 24 h. La barra de escala es de 50 μm

Ensayo de apoptosis basado en citómetro de flujo

El análisis cuantitativo del ensayo de apoptosis se realizó mediante citómetro de flujo después de la tinción con Anexina V y kit de tinción PI. Las células se trataron con las respectivas formulaciones y se incubaron durante 24 h. A continuación, las células se tiñeron con Anexina V y PI. Como se muestra en la Fig. 7, las células de control no tratadas eran viables con más del 99% de células presentes en la cámara viable. El tratamiento con PTX redujo la proporción de células viables al 90% con alrededor del 9% de la apoptosis. El PLN mostró alrededor de ~ 10% de células de apoptosis con ~ 7% de células necróticas. Es importante destacar que TPLN mostró un significativo ( p <0.05) reducción en la proporción de células viables a ~ 65% con alrededor de ~ 30% de células de apoptosis (apoptosis temprana y tardía). El notable potencial de apoptosis de TPLN se atribuyó a la captación celular mediada por receptores y a una mayor acumulación de fármaco anticanceroso en las células cancerosas que podría mejorar el efecto anticanceroso en las células tumorales [24, 25].

Ensayo de apoptosis basado en citómetro de flujo. Las células se trataron con la formulación respectiva y después de 24 h, las células se tiñeron con Anexina V y PI durante 15. Las células se clasificaron luego usando un citómetro de flujo. Las células se incubaron con las respectivas formulaciones durante 24 h. La medición se realizó n =3. * p <0.05 es la diferencia estadística entre TPLN y PTX

Ensayo de formación de colonias

La capacidad de formación de colonias en presencia de la formulación respectiva se ensayó mediante el ensayo de formación de colonias Fig. 8. Como se muestra, PTX y PLN poseen un ligero potencial para inhibir la capacidad de formación de colonias de las células cancerosas. Es importante destacar que el TPLN mostró una capacidad notable para controlar la capacidad de formación de colonias de las células cancerosas. TPLN mostró ~ 20% de formación de colonias en comparación con ~ 70% de formación de colonias para PTX, lo que indica el efecto anticanceroso superior de TPLN. El mantenimiento de la leucemia mieloide aguda depende de una población más pequeña de células madre leucémicas y células progenitoras que tienen la capacidad de formar colonias; Es importante probar si la TPLN puede apuntar al grupo de células formadoras de colonias. Como muestran los resultados, puede reducir significativamente el riesgo de cáncer de leucemia, lo que sugiere la capacidad de prevenir el desarrollo de cáncer y / o eliminar las células malignas en etapa temprana. Por lo tanto, el ensayo de formación de colonias brinda información crucial sobre la posible eficacia anticancerosa de las formulaciones.

Ensayo de formación de colonias. Las células se sometieron a un protocolo de ensayo de formación de colonias después del tratamiento respectivo. Las células se incubaron con las respectivas formulaciones durante 24 h. ** p <0.001 es la diferencia estadística entre PTX y PTLN

Conclusión

En general, la nanopartícula lipídica cargada con paclitaxel decorada con transferrina se preparó con el objetivo de aumentar la eficacia quimioterapéutica en las células leucémicas. Los resultados mostraron claramente el potencial superior de direccionamiento de TPLN a las células cancerosas en comparación con el de PLN. Para ser específicos, TPLN mostró un efecto citotóxico significativamente mayor en las células cancerosas en comparación con el PLN, lo que indica la eficacia de dirección superior del sistema de nanopartículas decoradas con Tf. Es importante destacar que TPLN mostró una notable apoptosis de las células cancerosas y mostró una fuerte capacidad antitumoral en ambas células HL-60. En general, los resultados mostraron claramente el potencial de focalización del sistema de nanopartículas de lípidos conjugados con ligando a las células leucémicas que podrían allanar el camino para el tratamiento exitoso del cáncer. La eficacia terapéutica de las formulaciones en modelo clínico animal y su biodistribución será parte de nuestro próximo trabajo.

Abreviaturas

EPR:

Efecto de penetración y retención mejorado

OA:

Ácido oleico

PEG:

Polietilenglicol

PLN:

Nanopartículas lipídicas cargadas con PTX

PTX:

Paclitaxel

SLN:

Nanopartículas de lípidos sólidos

Tf:

Transferrina

TPLN:

PLN conjugado con Tf

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