Nanopartículas de oro funcionalizadas con ácido litocólico inducen apoptosis selectiva en células de cáncer hepático

Resumen

Las nanopartículas de oro (AuNP) son reconocidas por su biocompatibilidad, propiedades ópticas y potencial para la administración de fármacos. En este estudio, diseñamos AuNP con un espaciador de polietilenglicol (PEG) y ligando de ácido litocólico (LCA) mediante acoplamiento por carboxilato, obteniendo AuNP@MPA-PEG-LCA. Los ensayos de citotoxicidad revelaron que AuNP@MPA-PEG-LCA exhibe una selectividad pronunciada, inhibiendo marcadamente múltiples líneas de carcinoma hepatocelular (HepG2, SMMC-7721) mientras preserva hepatocitos normales (QSG-7701) y células de cáncer de mama (MCF-7). La inducción de apoptosis se confirmó mediante condensación nuclear (Hoechst 33342), unión a anexina V-FITC, pérdida de potencial de membrana mitocondrial (JC-1) y tinción con naranja de acridina/bromuro de etidio (AO/EB). Las nanopartículas desencadenaron acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), llevando a disfunción mitocondrial y muerte celular programada. Estos hallazgos demuestran que AuNP@MPA-PEG-LCA es un nanoterapéutico prometedor y dirigido para el cáncer hepático.

Antecedentes

Las nanopartículas de oro poseen resonancia óptica única, estabilidad química y una extensa área superficial que las hacen atractivas para aplicaciones biomédicas, incluyendo administración de fármacos, imagenología y terapia fototérmica. Su geometría esférica facilita la captación celular eficiente y minimiza efectos fuera de blanco. La funcionalización de AuNP con ligandos dirigidos o polímeros mejora aún más su índice terapéutico, particularmente en oncología.

El ácido litocólico (LCA), un ácido biliar secundario, ha demostrado ejercer potente actividad antitumoral contra el cáncer hepático mediante apoptosis. Como molécula natural, el LCA puede servir como ligando para guiar AuNP a tejidos hepáticos, mejorar la solubilidad y potencialmente modular vías de señalización intracelular.

Combinar la biocompatibilidad de las AuNP con las propiedades supresoras de tumor del LCA puede producir un agente anticancerígeno selectivo que explota vías mitocondriales mediadas por ROS para desencadenar apoptosis en células de carcinoma hepatocelular.

Métodos

Materiales

Todos los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich salvo indicación contraria. Los reactivos de cultivo celular (RPMI-1640, FBS) se obtuvieron de Invitrogen. Las líneas de carcinoma hepatocelular humano (HepG2, SMMC-7721), hepatocitos normales (QSG-7701) y células de cáncer de mama (MCF-7) provinieron del Instituto de Ciencias Biológicas de Shanghái.

Síntesis de AuNP@MPA

AuNP recubiertas de citrato (diámetro promedio 4,0 ± 0,5 nm) se sintetizaron mediante el método de Turkevich usando HAuCl₄ y NaBH₄. Las nanopartículas resultantes se recubrieron posteriormente con ácido 3-mercaptopropiónico (MPA) a pH 11 para proporcionar grupos carboxilato para conjugación ulterior.

Conjugación con PEG

AuNP@MPA (0,0875 mmol) se activó con NHS (0,0875 mmol) y EDC (0,035 mmol) en tampón MES 50 mM, seguido de la adición de NH₂-PEG₁₀₀₀-NH₂ (0,045 mmol). Tras 24 h a 25 °C, las nanopartículas PEGiladas (AuNP@MPA-PEG) se aislaron por centrifugación.

Unión del ácido litocólico

AuNP@MPA-PEG se mezcló con LCA (0,045 mmol) en DMF anhidro y se agitó durante 24 h a 25 °C. El producto final, AuNP@MPA-PEG-LCA, se purificó mediante centrifugaciones repetidas.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

La morfología y tamaño de partícula se examinaron en un TEM JEOL JEM-200CX operando a 200 kV. Las suspensiones de nanopartículas se depositaron sobre rejillas de cobre de 300 mallas.

Ensayos de citotoxicidad

La viabilidad celular tras 48 h de exposición a AuNP (0,2-1,0 mg mL⁻¹) se midió mediante ensayo MTT. La absorbancia a 570 nm se registró en un lector de placas Tecan Infinite M200.

Morfología apoptótica (Hoechst 33342)

Células HepG2 se trataron con 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA durante 24 y 48 h, luego se tiñeron con 10 µg mL⁻¹ Hoechst 33342 por 30 min. La morfología nuclear se imagenó con microscopio confocal Leica-SP8.

Apoptosis temprana (Anexina V-FITC)

Tras 6 h de tratamiento con 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA, las células HepG2 se tiñeron con anexina V-FITC y se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur, BD). También se adquirieron imágenes confocales.

Potencial de membrana mitocondrial (MMP)

El colorante JC-1 (10 µg mL⁻¹) se usó para evaluar cambios en MMP en células HepG2 tratadas con AuNP@MPA-PEG-LCA (6 h). Se emplearon tanto citometría de flujo como microscopía confocal.

Especies reactivas de oxígeno (ROS)

El ROS intracelular se cuantificó usando H₂DCF-DA (10 µM) tras 6 h de exposición a 0,5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA-PEG-LCA. La fluorescencia se midió por citometría de flujo y microscopía confocal.

Resultados y discusión

Caracterización de nanopartículas

AuNP@MPA-PEG-LCA mantuvo forma esférica con diámetro promedio de 16,0 ± 1,2 nm, confirmado por TEM. Las capas de PEG y LCA contribuyeron al aumento del tamaño hidrodinámico comparado con el núcleo AuNP@MPA (4,0 nm). Estas dimensiones son ideales para el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR) en tejidos tumorales.

Citotoxicidad selectiva

Los ensayos MTT mostraron citotoxicidad despreciable de AuNP@MPA en todas las líneas celulares. En contraste, AuNP@MPA-PEG-LCA redujo la viabilidad de HepG2 y SMMC-7721 de manera dosis-dependiente, con valores IC₅₀ por debajo de 0,6 mg mL⁻¹, mientras que QSG-7701 y MCF-7 fueron mínimamente afectadas. Este perfil selectivo subraya la capacidad de direccionamiento conferida por LCA.

Morfología apoptótica

La tinción con Hoechst reveló condensación nuclear progresiva, fragmentación y marginación de cromatina en células HepG2 tratadas con AuNP@MPA-PEG-LCA durante 48 h, indicativo de apoptosis tardía. Las células control y tratadas con AuNP@MPA mantuvieron morfología nuclear uniforme.

Confirmación con anexina V-FITC

La tinción con anexina V demostró translocación clara de fosfatidilserina a la hoja externa de la membrana plasmática en células tratadas con AuNP@MPA-PEG-LCA. La citometría de flujo cuantificó una tasa de apoptosis del 38,45 % frente al 8,16 % en controles, confirmando la inducción de apoptosis temprana.

Despolarización mitocondrial

El análisis con JC-1 reveló pérdida de fluorescencia roja agregada y aumento de señal verde monomérica, indicando colapso del MMP en células tratadas. La citometría de flujo confirmó reducción significativa en la relación rojo/verde, corroborando disfunción mitocondrial como evento posterior de apoptosis.

Generación de ROS

La tinción con H₂DCF-DA mostró aumento marcado de fluorescencia verde en células HepG2 tratadas con AuNP@MPA-PEG-LCA, reflejando producción elevada de ROS. La cuantificación citométrica confirmó la tendencia, sugiriendo que el estrés oxidativo precede a la despolarización mitocondrial y apoptosis.

Conclusiones

Fabricamos exitosamente nanopartículas AuNP@MPA-PEG-LCA (~16 nm) que inhiben selectivamente el crecimiento de células de carcinoma hepatocelular desencadenando apoptosis. Ensayos integrales —morfología nuclear, unión a anexina V, pérdida de MMP con JC-1 y elevación de ROS— confirman que la acción terapéutica se media mediante disfunción mitocondrial inducida por ROS. Estos resultados posicionan a AuNP@MPA-PEG-LCA como una nanomedicina prometedora y dirigida para el tratamiento del cáncer hepático.

Abreviaturas

AuNP:

Nanopartículas de oro

DMF:

Dimetilformamida

EDC:

Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida

FBS:

Suero fetal bovino

H₂DCF-DA:

Diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína

HepG2:

Células de carcinoma hepatocelular humano

JC-1:

Yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina

LCA:

Ácido litocólico

MCF-7:

Células de cáncer de mama humano

MES:

Ácido 4-morfolinoetanosulfónico

MMP:

Potencial de membrana mitocondrial

MPA:

Ácido 3-mercaptopropiónico

MTT:

Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio

NHS:

N-hidroxisuccinimida

PEG:

Polietilenglicol

PS:

Fosfatidilserina

QSG-7701:

Células de hepatocito normal humano

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

SMMC-7721:

Células de carcinoma hepatocelular humano

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión