Nanopartículas de quitosano cargadas con genisteína y bioflavonoides dirigidas al receptor de folato para un efecto anticancerígeno mejorado en los cánceres de cuello uterino

Métodos

Materiales

La genisteína se compró a Aladdin Chemicals (Shanghai, República Popular de China). El ácido fólico, quitosano (85% desacetilado), se adquirió en Sigma-Aldrich, China. También se adquirieron EDC y NHS de Sigma-Aldrich, China. Todos los demás productos químicos son de grado reactivo y se utilizan sin modificaciones.

Preparación de nanopartículas de quitosano conjugadas con ácido fólico cargadas con GEN

Antes de preparar las nanopartículas, se preparó el conjugado de quitosano de ácido fólico. Brevemente, se disolvieron 44,1 mg de ácido fólico en DMSO junto con una mezcla de clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDAC.HCl) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (relación molar 1:1,5:1,5 ). La mezcla se agitó durante 30 min para permitir la activación del grupo funcional. La solución orgánica se añadió gota a gota a una solución de quitosano (0,5% p / p) con agitación continua. Se continuó agitando durante la noche en condiciones de oscuridad. El pH se llevó a pH 8 mediante la adición de hidróxido de sodio 1 M. Al final, la mezcla se centrifugó para separar el precipitado amarillo y se lavó con carbonato de sodio y luego se dializó nuevamente con agua.

Para preparar la nanopartícula, se disolvieron GEN, quitosano y conjugado de quitosano-FA (10:1) en DMSO. Después, la solución de DMSO se añadió gota a gota a una solución de Tween 80 al 0,5% con agitación continua. La mezcla se agitó durante 3 h, y después de que se evaporaran todos los disolventes, la suspensión se centrifugó durante 30 min a 10.000 rpm a 4ºC. El sobrenadante se eliminó y se evaluó mediante el método de HPLC. Las muestras se cuantificaron mediante HPLC (LC 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) Utilizando una columna C-18 de fase inversa a 25 ° C. Una fase móvil de metanol / agua (60/40, v / v) se utilizó como fase móvil a un caudal de 1 ml / min.

Análisis de morfología de superficie y tamaño de partículas

El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de las nanopartículas fueron observados por Malvern Mastersizer 2000 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments Ltd., Reino Unido). Las muestras se diluyeron adecuadamente antes del análisis. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

La morfología de la superficie de las nanopartículas se evaluó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM-1230, JEOL, Tokio, Japón). Brevemente, la dispersión de nanopartículas se mezcló con PTX al 2% y se colocó en la rejilla TEM y se secó durante 10 min bajo radiación infrarroja baja. Las muestras se tiñeron con ácido fosfotungístico (2%) y se observaron bajo TEM a un voltaje de aceleración de 100 kV.

Estudio de liberación de fármacos in vitro

El estudio de liberación del fármaco se realizó mediante el método de diálisis. Brevemente, se suspendieron 5 mg equivalentes de nanopartículas GEN en 1 ml de tampón de liberación (PBS, pH 7,4) y se transfirieron a un tubo de diálisis (MWCO:3500). El tubo de diálisis se colocó en un tubo Falcon que contenía 25 ml de tampón de liberación. El tubo Falcon se colocó en un agitador con agitación suave a 37 ° C. A intervalos preestablecidos, se tomó un volumen específico de muestra y se reemplazó con tampón o medio nuevos. El fármaco liberado del medio de liberación se estudió mediante HPLC.

Cultivo celular

La línea celular de carcinoma de cuello uterino humano (células HeLa) se obtuvo de ATCC, MS, EE. UU. Y se cultivó en DMEM que contenía FBS al 10% y una mezcla de antibióticos a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%.

Captación celular

La eficiencia de focalización de las nanopartículas (GCN y FGCN) se estudió mediante análisis de captación celular. En este estudio, la sonda fluorescente empleada fue la cumarina-6. Las células se colocaron en una placa de 96 pocillos y se dejaron adherir durante 24 h. El medio de cultivo se retiró y se reemplazó con medio fresco que contenía GCN y FGCN y se incubó durante diferentes intervalos. Después, las células se lavaron con PBS, se lisaron (Triton-X), se centrifugaron y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se utilizó para evaluar la intensidad de la fluorescencia mediante un lector de microplacas (GENios, Tecan, Suiza). La absorción se midió a una longitud de onda de excitación de 430 nm y una longitud de onda de emisión de 485 nm.

Imagen de captación celular

Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal (Olympus Fluoview FV-1000, Tokio, Japón) para determinar la captación celular cualitativa en las células cancerosas. 2 × 10 ⁵ las células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h. El medio se retiró y se reemplazó con medio fresco que contenía GCN y FGCN y se incubó durante 2 h. Las células se lavaron con PBS, se fijaron y se lavaron de nuevo. Luego, las células se observaron usando CLSM.

Ensayo de citotoxicidad

La eficacia de destrucción celular de GEN, GCN y FGCN libres se estudió mediante el protocolo de ensayo MTT. Células HeLa con una densidad de siembra de 1 × 10 ⁴ las células se colocaron en una placa de 96 pocillos y se dejaron adherir durante 24 h. Al día siguiente, las células se trataron con GEN, GCN y FGCN libres en 100 µl de medio fresco y se incubaron durante 24 h. Posteriormente, se retiró el medio y se lavó dos veces con PBS. Se colocaron diez microlitros de DMEM que contenía MTT (5 mg / ml) en una placa de 96 pocillos y se dejaron reposar durante 4 h. La solución de MTT se separó por sifón y se añadió DMSO para disolver los cristales de formazán que corresponden a células vivas. La absorbancia del formazán se estudió a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector de placas (Bio-Tek Instruments Inc., EE. UU.). El IC50 también se calculó con el software GraphPad Prizm (versión 17).

Ensayo en vivo / muerto

Células HeLa con una densidad de siembra de 2 × 10 ⁵ las células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h. Al día siguiente, las células se trataron con GEN, GCN y FGCN libres en 100 µl de medio fresco y se incubaron durante 24 h. Posteriormente, se retiró el medio y se lavó dos veces con PBS. Las células se procesaron de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante (Molecular Probes, EE. UU.). La calceína AM y el homodímero de etidio son los respectivos tintes de células vivas y muertas que se utilizan para la tinción.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron estadísticamente utilizando t prueba. A P Se utilizó un valor inferior a 0,05 para mostrar significación estadística. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Resultados y discusión

El cáncer de cuello uterino humano es uno de los cánceres más populares en la edad reproductiva de las mujeres en todo el mundo, y es principalmente el resultado del virus del papiloma humano. Por lo tanto, se utilizan con regularidad opciones de tratamiento como quimioterapia, cirugía y radioterapia; sin embargo, ninguno es eficaz para tratar los cánceres de cuello uterino. Se ha informado que los agentes quimioterapéuticos u otras moléculas pequeñas mejoran la eficacia del tratamiento del cáncer si se administran específicamente. Recientemente, los compuestos naturales han ganado una atención significativa en el tratamiento del cáncer, ya que se sabe que tienen menos toxicidad en comparación con los fármacos quimioterapéuticos. La genisteína ha recibido mayor atención debido a su potente propiedad anticancerosa. Sin embargo, el potencial clínico de GEN se vio obstaculizado debido a su escasa solubilidad (~ 1,43 μg / ml) y su baja biodisponibilidad. En el presente estudio, nuestro objetivo principal era aumentar la propiedad anticancerígena de GEN hacia las células de cáncer de cuello uterino HeLa sobreexpresadas en FR-α mediante la encapsulación en nanopartículas de quitosano conjugadas con FA (Fig. 1).

Ilustración esquemática de la preparación de nanopartículas de quitosano conjugadas con ácido fólico cargadas con genisteína

Caracterización fisicoquímica del sistema de nanopartículas cargado con GEN

El tamaño y el potencial zeta del sistema de partículas juega un papel crucial en la internalización celular y el desempeño sistémico de los medicamentos contra el cáncer. Se utilizó la dispersión de luz dinámica (DLS) para determinar el tamaño de partícula y la distribución de tamaño de las nanopartículas cargadas con GEN (Fig. 2). El tamaño de partícula promedio de GCN fue ~ 140 nm mientras que FGCN fue ~ 165 nm con excelente índice de polidispersidad. El diámetro hidrodinámico medio de la FGCN es inferior a 200 nm, lo que es suficiente para penetrar en los tejidos tumorales utilizando efectos mejorados de permeación y retención. El pequeño tamaño de las partículas podría resistir la propiedad de eliminación rápida de las nanopartículas del cuerpo (RES) [20]. La carga superficial se considera un indicador clave de la estabilidad de las partículas en forma de suspensión. El potencial zeta medio de GCN fue +26 mV mientras que FGCN fue +21,5 mV. Una ligera disminución de la carga superficial podría atribuirse a la sustitución del grupo amina del quitosano. Además, GCN y FGCN mostraron una alta eficiencia de atrapamiento de más del 95%, lo que indica su idoneidad para aplicaciones sistémicas. El tamaño de partícula y el potencial zeta de FGCN permanecieron sin cambios durante el almacenamiento durante 3 meses, lo que indica su alta estabilidad durante el almacenamiento (Fig. 3).

Microscopio electrónico de transmisión de FGCN

Perfil de liberación in vitro de GCN y FGCN en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La cantidad de fármaco liberado se cuantificó mediante el método HPLC y el experimento se realizó por triplicado

Análisis de morfología de superficie

La morfología de la superficie de la FGCN optimizada se caracterizó por TEM. Las nanopartículas exhibieron una morfología de forma esférica y se distribuyeron uniformemente en la rejilla de cobre. El tamaño de partícula observado en el análisis TEM fue consistente con la observación DLS (Fig. 4).

Análisis de captación celular de GCN y FGCN en células de cáncer de cuello uterino HeLa. un Análisis cuantitativo de la captación celular de nanopartículas por método de fluorescencia. b Análisis de captación celular basado en microscopio de barrido láser confocal (CLSM). La cumarina-6 se utilizó como sonda fluorescente

Cinética de liberación de fármacos in vitro

La liberación de GEN de GCN y FGCN se llevó a cabo mediante el método de diálisis. Se utilizó PBS para realizar el estudio de liberación para simular las condiciones fisiológicas. Como se esperaba, el perfil de liberación de GCN y FGCN fue casi similar. Ambas formulaciones exhibieron un perfil de liberación controlada para GEN y exhibieron una cinética de liberación monofásica. Aproximadamente el 35-40% del fármaco se liberó de ambos sistemas de nanopartículas al final de las 24 h. La tendencia de la tasa de liberación de GEN continuó hasta el final del período de estudio y, finalmente, se liberó ~ 90% del fármaco. La conjugación de folato en la superficie influye en la baja liberación de fármaco, lo que indica la influencia de la presencia de material conjugado. Se ha informado que una liberación controlada de fármaco de NP se atribuyó al alargamiento de la longitud de la ruta del fármaco al medio de liberación externo. En general, una liberación controlada del fármaco en condiciones de pH 7,4 sugiere que gran parte del fármaco estará intacto y se acumulará en los tejidos tumorales con el tiempo.

Estudio de captación celular in vitro

La concentración intracelular de GEN es muy importante para provocar su acción citotóxica en las células cancerosas. Por lo tanto, el potencial de captación celular del sistema NP es muy importante desde la perspectiva de la eficacia terapéutica. El GCN y FGCN cargados con cumarina-6 se incubaron en células cancerosas durante diferentes puntos de tiempo. Ambos sistemas NP exhibieron una captación celular dependiente del tiempo con una captación celular máxima a las 4 h. Como se esperaba, la FGCN dirigida al receptor de ácido fólico exhibió estadísticamente ( p <0.05) mayor absorción celular en células cancerosas HeLa. Una vez más, la captación predominante de FGCN en la mayoría de los casos se debe a la disponibilidad de FA en la superficie de la partícula que podría facilitar la interacción del ligando con los receptores correspondientes y que está presente en grandes cantidades en las células HeLa [21].

La captación celular se confirma aún más mediante imágenes microscópicas. Las células se incubaron con formulaciones respetadas y se incubaron durante 2 h. Como se ve, se observó una alta intensidad fluorescente para las células cancerosas expuestas a FGCN en comparación con las células tratadas con GCN. Estos resultados indicaron que el FGCN conjugado con ácido fólico tenía una afinidad específica por las células cancerosas HeLa debido al reconocimiento de ligando-receptor (FA-FR-α).

Citotoxicidad in vitro

La actividad citotóxica in vitro de GEN, GCN y FGCN en células cancerosas HeLa se estudió mediante el protocolo de ensayo MTT. Como se vio, las nanoformulaciones de GEN fueron más efectivas para matar las células cancerosas en comparación con las de GEN libre. Sin embargo, todas las formulaciones exhibieron un efecto citotóxico dependiente de la dosis típico en las células cancerosas. Como era de esperar, las nanoformulaciones marcadas con ácido fólico exhibieron estadísticamente ( p <0,05) mayor efecto citotóxico en comparación con las formulaciones no dirigidas. El efecto anticanceroso superior de FGCN se atribuyó a la internalización de nanopartículas mediada por receptores específicos en las células cancerosas que podrían aumentar la concentración de fármaco en el entorno intracelular. Además, la capacidad de las nanopartículas para controlar la liberación de compuestos encapsulados también contribuyó a la alta citotoxicidad de FGCN. El valor de CI50 se utilizó para evaluar el efecto citotóxico real de las formulaciones sobre las células cancerosas. Generalmente, es la concentración que se requiere para matar la mitad de las células originales. Los resultados mostraron que el valor de CI50 de GEN disminuyó de 33,8 a 26,5 μg / ml cuando se trató con GCN. Es importante destacar que el valor de IC50 disminuyó a 14,6 μg / ml cuando se trató con FGCN después de 24 h de incubación. Se ha informado que las nanopartículas reducen el efecto MDR y, por lo tanto, se espera que aumenten la eficacia anticancerosa de GEN al reducir su salida de las células mediadas por la glicoproteína P. El efecto anticanceroso superior de la FGCN fue consistente con su alta captación celular en las células cancerosas HeLa [22].

Análisis microscópico

El análisis morfológico de las células cancerosas se llevó a cabo después del tratamiento con medicamentos contra el cáncer. Las formulaciones se expusieron a células cancerosas y se incubaron durante 24 h. Las células de control eran normales y se extendieron sobre el cubreobjetos de la placa de pocillos, mientras que las células se redujeron en el grupo tratado con formulaciones. De acuerdo con el ensayo de citotoxicidad, la morfología de las células cancerosas fue diferente para diferentes formulaciones. Como se muestra, las células tratadas con FGCN eran menos en número y morfología redonda, lo que indica la mayor citotoxicidad de las formulaciones. El GCN también indujo cambios notables en las células cancerosas debido a su absorción razonablemente mayor en las células cancerosas. Los resultados revelan claramente que las nanopartículas recubiertas de quitosano serán beneficiosas para los tratamientos del cáncer de cuello uterino (Fig. 5).

Análisis de citotoxicidad in vitro de GEN, GCN y FGCN en células cancerosas HeLa. Las células se trataron con las respectivas formulaciones y se incubaron durante 24 h. ** p <0.01 es la diferencia estadística entre FGCN y GEN.A

Ensayo en vivo / muerto

El potencial citotóxico de las formulaciones individuales se estudió más a fondo mediante un ensayo de vivo / muerto. La cantidad de células vivas y muertas después del tratamiento con el fármaco (durante 24 h) se visualizó a partir de la intensidad de la fluorescencia verde. La calceína AM y el tinte de bromuro de etidio son marcadores representativos de células vivas y muertas que se aplican a las células tratadas con formulaciones. Las células vivas restantes presentes después del tratamiento con el fármaco absorben calceína y emiten una emisión de luz fluorescente verde (488 nm). Como se muestra, las células no tratadas mostraron una alta intensidad de fluorescencia (fluorescencia verde) y el tratamiento de GEN libre tampoco redujo las células en crecimiento. Por otro lado, FGCN mostró menos células vivas y más células muertas (baja intensidad de fluorescencia), lo que indica el potente efecto. La alta tasa de muerte celular del grupo tratado con FGCN se atribuyó a la mayor internalización de nanopartículas en las células cancerosas. El resultado es consistente con el ensayo de citotoxicidad (Fig. 6).

Análisis morfológico de las células cancerosas HeLa después del tratamiento con GEN, GCN y FGCN

Análisis de apoptosis

En este estudio, hemos diseñado un exclusivo sistema de administración dirigido al receptor de ácido fólico que podría aumentar la concentración intracelular de GEN y mejorar el efecto anticancerígeno en las células de cáncer de cuello uterino. Por lo tanto, para analizar la propiedad de inducción apoptótica de NP GEN, GCN y FGCN libres, las células se evaluaron mediante citometría de flujo después de la tinción doble con anexina V / PI. La Figura 7 muestra que las células tratadas con GEN libre no indujeron una apoptosis apreciable de las células cancerosas, mientras que GCN (~ 22%) fue eficaz para inducir la apoptosis en estas células cancerosas. Como era de esperar, FGCN exhibió una notable apoptosis de las células cancerosas (~ 55%), lo que indica su efecto anticanceroso superior. El mayor efecto anticanceroso de las formulaciones se debió a la afinidad específica del ligando por los receptores correspondientes, que a su vez aumentaron la concentración de fármaco en las células cancerosas. Los resultados revelan claramente que las nanopartículas recubiertas de quitosano serán beneficiosas para los tratamientos del cáncer de cuello uterino. La plataforma de nanotecnología para los medicamentos contra el cáncer aumentó la toxicidad en las células cancerosas y aumentó la eficacia terapéutica de los agentes antitumorales (Fig. 8).

Ensayo vivo / muerto de células cancerosas HeLa después del tratamiento con GEN, GCN y FGCN. La fluorescencia verde indica las células vivas

Análisis de apoptosis de células cancerosas HeLa después del tratamiento con GEN, GCN y FGCN. Se utilizó un citómetro de flujo para analizar la proporción de apoptosis celular. ** p <0.01 es la diferencia estadística entre FGCN y GEN

Conclusiones

En este estudio, se formuló una nueva nanopartícula de quitosano conjugado con ácido fólico para el suministro específico de bioflavonoide, genisteína (GEN), a las células de cáncer de cuello uterino. FGCN exhibió un potencial de internalización mejorado en células HeLa que el de GCN. Los resultados revelaron que FGCN tiene una afinidad específica hacia las células HeLa que contribuirá a un mejor tratamiento. Las nanoformulaciones marcadas con ácido fólico exhibieron un efecto citotóxico superior en comparación con las formulaciones no dirigidas. De manera constante, el valor de CI50 de GEN disminuyó de 33,8 a 14,6 μg / ml cuando se trató con FGCN después de 24 h de incubación. Los estudios de apoptosis indicaron que las nanopartículas de FGCN eran GCN o GEN libre en términos de actividad anticancerígena. En general, los resultados revelaron que la conjugación de folato al sistema de administración podría tener un gran efecto en la supervivencia de los cánceres de cuello uterino que serán beneficiosos para el tratamiento general del cáncer. El estudio sobre el modelo animal clínico le dará a la perspectiva el próximo paso del presente estudio.

Abreviaturas

EPR:

Permeabilidad y retención mejoradas

FGCN:

Nanopartículas de quitosano cargadas con GEN conjugado con ácido fólico

FR:

Receptores de folato

GCN:

Nanopartículas de quitosano cargadas con GEN

GEN:

Genisteína

Efecto del confinamiento en las propiedades fotofísicas de las cadenas P3HT en la matriz de PMMA (La0.97RE0.01Yb0.02) Nanophosphors 2O2S convertidos de hidroxil sulfato en capas e investigación de fotoluminiscencia de conversión ascendente (RE =Ho, Er)