Nanopartículas de quitosano conjugadas con ácido fólico administran genisteína, potenciando la eficacia anticancerígena contra cáncer cervical

Resumen

En este trabajo, diseñamos nanopartículas de quitosano conjugadas con ácido fólico (FGCN) para administrar el isoflavonoide natural genisteína (GEN) específicamente a células de cáncer cervical. Comparadas con nanopartículas de quitosano cargadas con GEN sin conjugar (GCN), las FGCN exhibieron un diámetro hidrodinámico ligeramente mayor (~165 nm) y una carga superficial modestamente reducida (+21,5 mV). Ambos sistemas lograron >95 % de encapsulación de fármaco y liberación controlada en tampón fosfato-salino (pH 7,4), liberando ~90 % de GEN en 24 h. Estudios de captación celular en células HeLa mostraron un aumento estadísticamente significativo (p < 0,05) de 2-3 veces en la internalización para FGCN versus GCN, atribuible a la alta afinidad del ácido fólico por el receptor de folato-α (FR-α) sobreexpresado. Los ensayos de citotoxicidad revelaron que el IC₅₀ de GEN descendió de 33,8 µg/mL (fármaco libre) a 14,6 µg/mL cuando se administró vía FGCN, mientras que GCN lo redujo a 26,5 µg/mL. El análisis de apoptosis demostró que FGCN indujo >55 % de muerte celular apoptótica, marcadamente superior a GCN (~22 %) y GEN libre. Estos hallazgos confirman que la conjugación con folato mejora la administración de GEN, la captación celular y la eficacia antitumoral en células de cáncer cervical.

Antecedentes

El cáncer cervical sigue siendo una causa principal de morbilidad entre mujeres mundialmente, impulsado principalmente por infección por virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo. Si bien existen vacunas profilácticas (Gardasil, Cervarix) y terapias convencionales —cirugía, radioterapia y quimioterapia—, son insuficientes para muchas pacientes, especialmente en entornos de bajos recursos. Compuestos naturales como flavonoides ofrecen actividad anticancerígena con menor toxicidad sistémica. La genisteína, un isoflavonoide de soja, inhibe quinasas de tirosina proteicas y NF-κB, arresta el ciclo celular en G2/M e induce apoptosis; sin embargo, su utilidad clínica está limitada por pobre solubilidad acuosa (~1,45 µg/mL) y baja biodisponibilidad. La encapsulación en nanopartículas puede mejorar estas propiedades fisicoquímicas, aumentar la acumulación tumoral vía el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR), y superar la multirresistencia a fármacos.

El quitosano, un polisacárido biodegradable rico en aminas primarias, es biocompatible y susceptible a modificación superficial. Conjugar ácido fólico (FA) al quitosano dirige al receptor FA-α, sobreexpresado en muchas células de cáncer cervical, permitiendo endocitosis mediada por receptor y administración selectiva.

Métodos

Materiales

Genisteína (Aladdin Chemicals, Shanghai), quitosano (85 % desacetilado, Sigma-Aldrich), ácido fólico, EDC y NHS (Sigma-Aldrich) se usaron tal como se recibieron.

Preparación de nanopartículas de quitosano conjugadas con FA cargadas con GEN

El ácido fólico se activó primero con EDC/NHS en DMSO y se conjugó al quitosano (0,5 % p/p) bajo agitación a pH 8. El conjugado FA-quitosano resultante se purificó por diálisis. GEN, quitosano y FA-quitosano (10:1 p/p) se disolvieron en DMSO y se añadieron gota a gota a 0,5 % Tween-80, seguido de agitación durante 3 h. El disolvente se evaporó, y la suspensión se centrifugó a 10 000 rpm (4 °C) durante 30 min. La carga de fármaco (DL%) y eficiencia de encapsulación (EE%) se calcularon por HPLC (Agilent LC-1100, columna C18, 60 % MeOH/40 % H₂O, 1 mL min⁻¹).

Tamaño de partícula y morfología superficial

La dispersión dinámica de luz (Malvern Zetasizer Nano ZS90) midió tamaño y polidispersidad. La microscopía electrónica de transmisión (JEOL JEM-1230, 100 kV) visualizó la morfología.

Liberación in vitro de fármaco

La liberación se evaluó por diálisis (MWCO 3500) en PBS (pH 7,4) a 37 °C con agitación suave. Las muestras se recolectaron en intervalos predeterminados y analizaron por HPLC.

Cultivo celular y captación

Células HeLa (ATCC) se mantuvieron en DMEM +10 % FBS. La captación celular de GCN y FGCN cargados con cumarina-6 se cuantificó por lectura de fluorescencia en microplaca (excitación 430 nm, emisión 485 nm) y visualizó por microscopía confocal de barrido láser (Olympus Fluoview).

Ensayos de citotoxicidad, viabilidad/muerte y apoptosis

MTT (5 mg mL⁻¹) midió viabilidad; valores IC₅₀ se ajustaron usando GraphPad Prism. Tinción vivo/muerto empleó calceína AM/etidio homodímero. La apoptosis se cuantificó por tinción annexina V/PI y citometría de flujo.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). La significancia estadística se evaluó mediante prueba t de Student (p < 0,05).

Resultados y discusión

Caracterización fisicoquímica

GCN exhibió diámetro promedio de 140 nm (+26 mV), mientras que FGCN midió 165 nm (+21,5 mV). Ambos tuvieron EE% >95 % y DL% entre 10-12 %. Tamaño y potencial zeta permanecieron estables tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C.

Cinética de liberación in vitro

Tanto GCN como FGCN liberaron ~35-40 % de GEN en las primeras 4 h, alcanzando ~90 % de liberación acumulada en 24 h. El ligero retraso en liberación de FGCN se atribuye al recubrimiento de FA, que prolonga la difusión del fármaco.

Captación celular

Los ensayos de fluorescencia mostraron una captación 2-3 veces mayor de FGCN comparado con GCN a 4 h (p < 0,05). Imágenes confocales confirmaron fluorescencia intracelular intensa para FGCN, indicando endocitosis mediada por FA exitosa.

Citotoxicidad

Valores IC₅₀: GEN libre 33,8 µg mL⁻¹ → GCN 26,5 µg mL⁻¹ → FGCN 14,6 µg mL⁻¹ (24 h). La eficacia superior de FGCN se vincula a captación mejorada y liberación controlada, reduciendo el eflujo mediado por P-glicoproteína.

Apoptosis

La tinción annexina V/PI reveló tasas de apoptosis de 0 % (GEN libre), 22 % (GCN) y 55 % (FGCN), subrayando la potencia de la administración dirigida.

Ensayo vivo/muerto

Las células tratadas con FGCN mostraron fluorescencia verde mínima y tinción roja abundante, consistente con alta muerte celular, mientras que células tratadas con GEN libre permanecieron mayormente viables.

Conclusiones

Las nanopartículas de quitosano conjugadas con ácido fólico mejoran marcadamente la administración de genisteína a células HeLa de cáncer cervical, mejorando la captación celular, reduciendo IC₅₀ a 14,6 µg mL⁻¹ e induciendo >55 % apoptosis. Estos resultados apoyan la evaluación preclínica adicional de FGCN como plataforma anticancerígena dirigida prometedora.

Abreviaturas

EPR

Permeabilidad y retención mejoradas

FGCN

Nanopartículas de quitosano cargadas con GEN conjugadas con ácido fólico

FR

Receptor de folato

GCN

Nanopartículas de quitosano cargadas con GEN

GEN

Genisteína