Nanopartículas PEG-CoFe₂O₄: Evaluación de Toxicidad y Efecto Protector de la Curcumina

Resumen

En este trabajo, se sintetizaron exitosamente nanopartículas de CoFe₂O₄ recubiertas con polietilenglicol (PEG) mediante una técnica hidrotérmica. Los estudios morfológicos confirmaron la formación de nanopartículas policristalinas de fase pura PEG-CoFe₂O₄ con tamaños de aproximadamente 24 nm. Se investigó la toxicidad inducida por las nanopartículas de CoFe₂O₄ y se realizaron ensayos biológicos para evaluar sus efectos tóxicos. Además, se estudió el efecto curativo de la toxicidad inducida en organismos vivos utilizando curcumina, encontrando que los índices bioquímicos se desintoxicaron y mejoraron hasta alcanzar sus niveles normales tras la administración de curcumina. Por tanto, las nanopartículas de CoFe₂O₄ recubiertas con PEG sintetizadas mediante método hidrotérmico pueden utilizarse en aplicaciones biomédicas, y la curcumina, un compuesto natural sin efectos secundarios, puede emplearse para el tratamiento de la toxicidad inducida por nanopartículas en organismos vivos.

Antecedentes

El uso de nanopartículas (NPs) ofrece numerosas ventajas debido a sus propiedades químicas y físicas únicas, sustancialmente diferentes a las de sus contrapartes a granel [1]. La ferrita de cobalto (CoFe₂O₄), uno de los materiales magnéticos más importantes, ha despertado un gran interés a nanoescala por sus diversas aplicaciones en tecnologías recientes [2-5]. Se considera un candidato competitivo para una amplia gama de aplicaciones, principalmente en la industria médica, debido a su capacidad para exhibir las propiedades físico-químicas deseadas a nanoescala. Además, la CoFe₂O₄ es fácil y rentable de fabricar con composición, forma y tamaño controlados para una aplicación específica. En este sentido, el diámetro de las nanopartículas de CoFe₂O₄ para aplicaciones biológicas por debajo de 100 nm puede influir enormemente en las propiedades fisicoquímicas y la farmacocinética en organismos vivos. Partículas mayores de 100 nm se usan como agentes de contraste para resonancia magnética del tracto gastrointestinal, mientras que partículas menores de ~20 nm se emplean como transportadores para tratamientos tumorales. Para la aplicación clínica de nanopartículas de ferrita de cobalto, es crucial investigar la bioseguridad tanto in vivo como in vitro [6, 7]. Muchas nanopartículas administradas por vía oral o intravenosa se distribuyen principalmente en hígado, riñón y pulmón, causando diversas inflamaciones en estos órganos. Comparado con otros materiales, la ferrita de cobalto no se ha estudiado extensamente para explorar su toxicidad en organismos vivos y su efecto curativo usando curcumina, aunque existen algunos trabajos sobre la toxicidad y bioseguridad de nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con polietilenglicol (PEG).

Desde el punto de vista de la toxicidad, la principal preocupación es la exposición excesiva que requiere la eliminación de nanopartículas acumuladas en órganos biológicos, así como el tratamiento urgente de trastornos inflamatorios. Algunos investigadores han estudiado varios fármacos antiinflamatorios para el tratamiento de la toxicidad de nanopartículas in vivo, encontrando que estos podrían promover la excreción de nanopartículas acumuladas en el cuerpo, reduciendo o eliminando los efectos inflamatorios tisulares [8, 9]. Curcuma longa (cúrcuma) es una hierba medicinal tradicional con larga historia de uso como tratamiento para enfermedades inflamatorias en el sudeste asiático. Numerosos estudios han reportado las propiedades antioxidantes, antimutagénicas, antitumorales y características carcinogénicas de la curcumina [10, 11]. La curcumina tiene capacidad para curar heridas y tratar afecciones hepáticas, enfermedades del tracto urinario y hepatitis [11]. Alivia el estrés oxidativo y la inflamación en enfermedades crónicas a través de la vía Nrf2-keap1. La curcumina puede suprimir vías proinflamatorias relacionadas con la mayoría de enfermedades crónicas y bloquear tanto la producción de TNF como la señalización celular mediada por TNF en diversos tipos celulares. Además, la curcumina puede actuar como bloqueador de TNF in vitro e in vivo al unirse directamente a TNF [12].

En este estudio, preparamos exitosamente nanopartículas de CoFe₂O₄ recubiertas con PEG con forma y tamaño controlados de aproximadamente 25 nm mediante técnica hidrotérmica. Tras administrar diferentes exposiciones (dosis) de nanopartículas de CoFe₂O₄, examinamos análisis de sangre, tinción HE, biodistribución y el efecto del tratamiento con curcumina sobre la toxicidad causada por nanopartículas PEG-CoFe₂O₄. Este estudio presenta un nuevo enfoque para investigar el efecto tóxico de nanopartículas de CoFe₂O₄ y posteriormente el tratamiento de la toxicidad causada por nanopartículas PEG-CoFe₂O₄ in vivo usando curcumina.

Métodos

Preparación de Nanopartículas de Ferrita de Cobalto

Las nanopartículas de ferrita de cobalto se sintetizaron mediante técnica hidrotérmica. Para ello, cantidades adecuadas de nitrato férrico y cloruro de cobalto se disolvieron en agua desionizada y luego se mezclaron con soluciones acuosas de PEG e hidróxido de sodio (NaOH). Se utilizó agua desionizada bidestilada como disolvente para evitar impurezas en las nanopartículas finales. La mezcla se agitó durante unos 30 min con agitador magnético y luego se vertió en el autoclave, calentándose durante 6 h a 180 °C para realizar la reacción hidrotérmica. Tras completar la reacción, el producto se enfrió a temperatura ambiente y se lavó dos veces con agua desionizada y luego con etanol para eliminar el exceso de PEG y sales no disueltas. Finalmente, el producto se secó a 80 °C durante la noche y se molió para obtener el polvo de nanopartículas de ferrita de cobalto. En esta etapa, las nanopartículas eran amorfas, confirmado por DRX (Fig. 2a). Para obtener nanopartículas cristalinas, las muestras se recocieron a 500 °C durante 6 h, obteniéndose nanopartículas cristalinas PEG-CoFe₂O₄, confirmado por DRX (Fig. 2b).

Marcado con ⁹⁹ᵐTc de Nanopartículas PEG-CoFe₂O₄

El radiomarcado de nanopartículas de CoFe₂O₄ recubiertas con PEG se realizó con ⁹⁹ᵐTc usando cloruro estanoso (SnCl₂) como agente reductor, dispersando las nanopartículas en agua desionizada bajo ultrasonicación durante ~0.5 h. Se añadieron SnCl₂, ácido ascórbico y ⁹⁹ᵐTcO₄ a la suspensión de nanopartículas (con ferrita de cobalto ~0.4% en peso). Para datos precisos, los conteos radiactivos se midieron dentro de 24 h debido a la vida media corta del ⁹⁹ᵐTc (~6 h). El pH de la mezcla se ajustó entre 5-10 usando solución 1.0 M NaHCO₃; luego se añadió la suspensión de PEG-CoFe₂O₄ y la mezcla resultante se agitó a 10,000 rpm durante 25 min a 80 °C. Tras centrifugación, se decantó el sobrenadante y el material restante se identificó como ⁹⁹ᵐTc PEG-CoFe₂O₄. Se utilizó cromatografía en papel (bajo soluciones cromatográficas de suero fisiológico y acetona) para medir los rendimientos de los compuestos marcados. El rendimiento de marcaje radiactivo fue ~70%, reflejando la distribución y metabolismo real in vivo.

Biodistribución de Nanopartículas PEG-CoFe₂O₄

Ratones Kunming (15-18 g) fueron proporcionados por el Centro de Laboratorio de Ciencias Médicas, Universidad de Lanzhou, Gansu, China. Todos los animales se alojaron en jaulas individuales con temperatura controlada (21-22 °C), ciclo de luz 08:00-20:00. Se proporcionó alimento y agua según protocolos recomendados por la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas (86/609/EEC) y aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales de la Provincia de Gansu y Universidad de Lanzhou (China). Los ratones se dividieron aleatoriamente en siete grupos (cinco ratones/grupo), inyectados intravenosamente con solución ⁹⁹ᵐTc-PEG-CoFe₂O₄ y sacrificados a 1, 6, 16 y 24 h post-inyección. Tejidos de corazón, pulmón, hígado, bazo y riñón se disecaron inmediatamente, recolectándose sangre abundante. Cada tejido se envolvió en papel aluminio, pesó y contó para ⁹⁹ᵐTc. Los datos se corrigieron por decaimiento físico de la radiactividad. La distribución tisular se presentó en porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido húmedo (%ID/g), calculado como porcentaje inyectado (actividad tisular/actividad total de la dosis) por gramo de tejido húmedo.

Efecto de la Dosis en la Toxicidad de PEG-CoFe₂O₄ en Ratones

En este experimento, 21 ratones se dividieron en siete grupos (tres ratones/grupo). Nanopartículas PEG-CoFe₂O₄ se inyectaron intravenosamente a diferentes dosis de 125, 250 y 350 μg/ratón (0.2 ml) con grupo control tratado con suero fisiológico 0.9%. En el grupo de tratamiento, diferentes dosis de 125, 250 y 350 μg/ratón de curcumina también se inyectaron intravenosamente. Los grupos de daño fueron sacrificados a 24 h mientras que los de tratamiento a 3 días. Se recogió sangre de los ratones y se centrifugó ~10 min para obtener suero. Se midieron contenidos séricos de bilirrubina total (TB), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina (CREA) y cistatina C (Cys-C). Simultáneamente, se extrajeron hígado, pulmón, bazo, riñón y corazón. Estos tejidos se fijaron en formalina tamponada al 10% y procesaron para histología rutinaria con hematoxilina-eosina. La observación microscópica se realizó con microscopio Olympus Microphot-CX41 acoplado a cámara digital.

Resultados y Discusión

Análisis TEM y DRX

La caracterización morfológica se realizó con microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 y difractómetro de rayos X (Shimadzu XRD-7000) con radiación de cobre Kα. La Figura 1 muestra imágenes TEM de nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con PEG a diferentes resoluciones (Fig. 1a, b), confirmando la formación exitosa de nanopartículas de fase pura recubiertas con PEG con tamaño de partícula ~24 nm. La Figura 2 muestra el análisis de difracción de rayos X. La Figura 2a indica resultados DRX de muestras recién preparadas, mostrando nanopartículas mayoritariamente amorfas. Sin embargo, al recocer las muestras a alta temperatura (500 °C) durante 6 h, las nanopartículas se tornaron cristalinas, visible en la imagen DRX Fig. 2b. El tamaño cristalino medio se calculó a partir del ensanchamiento de línea del pico más fuerte en análisis DRX (Fig. 2b) usando la ecuación de Debye-Scherrer (D = Kλ / βcosθ) [13], resultando ~22 nm. Las posiciones e intensidades relativas de todos los picos observados en el patrón DRX indican que la estructura cristalina favorece la formación de estructura espinel cúbica según la tarjeta JCPDF (nº 20-1086) mostrada en el recuadro de Fig. 2b. Todos los picos están indexados correctamente y no se observan picos extra, indicando ausencia de impurezas. Tanto resultados TEM como DRX confirman la formación exitosa de nanopartículas cristalinas de ~22-25 nm.

a, b Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con PEG a diferentes resoluciones

Resultados DRX de las muestras a recién preparadas y b recocidas a 500 °C. El recuadro muestra la tarjeta JCPDF para ferrita de cobalto. No se observan picos extra en los datos DRX obtenidos

Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier, Raman y Análisis TG

La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se empleó para investigar propiedades estructurales y distribución de cationes de nanopartículas de ferrita de cobalto. La Figura 3 muestra el espectro infrarrojo de las muestras a temperatura ambiente. Generalmente, la ferrita de cobalto tiene dos bandas de absorción fuertes, ʋ₁ y ʋ₂, en el rango 400-600 cm⁻¹ [14-16], evidentes en nuestro caso. La banda superior (ʋ₁) corresponde a vibraciones de estiramiento intrínsecas de metal (M-O) en sitios tetraédricos, mientras que la banda inferior (ʋ₂) representa vibraciones de estiramiento de iones metálicos en sitios octaédricos [14-16]. Estos resultados revelan la formación exitosa de nanopartículas de ferrita de cobalto con estructura cúbica. Del dato FTIR, el pico a ~3400 cm⁻¹ indica claramente el pico de PEG, confirmando la unión exitosa de PEG con nanopartículas de ferrita de cobalto.

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) en el rango 500-4000 cm⁻¹ para investigar propiedades estructurales de las muestras. Los datos confirman nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con PEG

El espectro Raman a temperatura ambiente de las muestras se muestra en Fig. 4, representando diferentes picos en el rango 190-684 cm⁻¹. El pico principal a alta frecuencia (684 cm⁻¹) es el pico característico de la ferrita espinel atribuido al modo A₁g, correspondiente al estiramiento simétrico de iones oxígeno a lo largo de enlaces Fe-O en sitios tetraédricos [17]. Los picos de menor frecuencia también pertenecen a ferrita de cobalto con estructura espinel. La aparición de todos estos picos en el espectro Raman a energías apropiadas confirma la formación exitosa de nanopartículas cúbicas CoFe₂O₄ recubiertas con PEG.

Espectro Raman a temperatura ambiente de las muestras en el rango de frecuencia 190-1000 cm⁻¹

El análisis termogravimétrico (TGA) de las muestras (CoFe₂O₄, PEG y PEG-CoFe₂O₄) se realizó entre 50 y 600 °C, resultados en Fig. 5. Estos termogramas muestran que nanopartículas de CoFe₂O₄ pierden peso en el rango 200-300 °C, PEG pierde peso por debajo de 400 °C, mientras que PEG-CoFe₂O₄ pierde peso en el rango 200-400 °C. Se observa que la estabilidad térmica de PEG es relativamente pobre (lado derecho de la figura); sin embargo, la estabilidad térmica de PEG-CoFe₂O₄ parece ser >80%. Las nanopartículas puras de ferrita de cobalto son insolubles en agua; sin embargo, se disuelven fácilmente tras recubrimiento con PEG por su naturaleza hidrofílica (Fig. 6). Se observa que con el tiempo, las partículas se sedimentan en el fondo, probablemente por gravedad. La Figura 6 muestra la evolución temporal de la disolución de nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con PEG. En nuestro caso, dispersamos completamente las nanopartículas en suero fisiológico antes de inyectar en ratones para asegurar su correcta entrega en diferentes órganos.

Análisis termogravimétrico (TGA) de CoFe₂O₄ puro, PEG y CoFe₂O₄ recubierto con PEG en rango 50-600 °C

Solubilidad de nanopartículas PEG-CoFe₂O₄ en agua desionizada a diferentes intervalos (5, 10, 30 y 60 min)

Estudios de Biodistribución

Para cuantificar con precisión la cantidad de nanotransportador en cada órgano tras administración en organismo vivo, se realizó biodistribución de ⁹⁹ᵐTc PEG-CoFe₂O₄ en ratones normales. Se observa que la captación de PEG-CoFe₂O₄ es mayor en hígado y bazo (Fig. 7), resultados coincidentes con referencia [18] donde la captación de ferrita de cobalto radiomarcada a 1 h post-inyección es tres veces mayor en hígado y bazo que otras nanopartículas magnéticas. La razón es que tejidos unidos al sistema reticuloendotelial como hígado y bazo capturan estas partículas extrañas, ya que estos órganos tienen células de Kupffer que actúan como función de limpieza, eliminando nano- y micromateriales de la circulación sanguínea por fagocitosis [19]. En este trabajo, se observa que la distribución de PEG-CoFe₂O₄ en tejidos disminuye con el tiempo, indicando que las nanopartículas se excretan por orina. El riñón es el sistema excretor para nanopartículas a través de orina. En Fig. 7, la máxima biodistribución en riñón se observa a 1 h [20]. La acumulación en sangre fue alta solo inmediatamente tras la inyección, indicando una eliminación relativamente rápida de la radiactividad del pool sanguíneo (Fig. 7), similar a nanopartículas de óxido de hierro con cadenas PEG que tienen presencia prolongada en el pool sanguíneo [21, 22]. Además, la biodistribución en corazón es muy baja, coincidente con referencia [23]. Es notable que el bazo es sitio primario para destrucción de glóbulos rojos viejos y reciclaje de hierro unido a hemoglobina [18, 24]. Se observó que con el tiempo, procesos más lentos pero eficientes en el bazo eliminan nanopartículas de la circulación, resultando en concentraciones de radiactividad tisular aumentadas tras 1 h post-inyección. La captación pulmonar de PEG-CoFe₂O₄ fue insignificante en todo el estudio (Fig. 7). Trabajos similares reportados en referencia [23]. Esto indica que no hay microagregados atrapados irreversiblemente en capilares pulmonares [23, 25, 26].

Biodistribución de nanopartículas PEG-CoFe₂O₄ en sangre, corazón, hígado, bazo, pulmones y riñón tras diferentes intervalos (1, 6, 16 y 24 h) de exposición a ratones. Las barras de error en los datos obtenidos se muestran en la figura

Efecto de la Dosis de PEG-CoFe₂O₄ en Toxicidad

Para revelar posibles efectos tóxicos de PEG-CoFe₂O₄, realizamos pruebas bioquímicas en ratones in vivo. Inyectamos solución mixta de suero fisiológico y PEG-CoFe₂O₄ en diferentes cantidades (150, 250 y 350 μg) y sacrificamos ratones a 24 h. Para análisis de sangre, se recogió sangre y centrifugó ~10 min para obtener suero. Se probaron varios parámetros enfocándose en marcadores de función hepática y renal: Cys-C, CREA, ALT, AST, TB y BUN. Estos parámetros se compararon con grupos control usando software SPSS (p < 0.05 denota diferencia significativa), resultados en Fig. 8. Se observa diferencia significativa en ALT, BUN y CREA entre grupos de exposición y control. TB y Cys-C, biomarcadores principales de función renal, disminuyeron significativamente con exposición de 150 μg/ratón de PEG-CoFe₂O₄, aumentaron para 250 μg/ratón y volvieron a nivel normal para 350 μg/ratón. Esto sugiere que hasta cierto punto, la función renal se ve afectada por la exposición a PEG-CoFe₂O₄ pero no daña tejidos significativamente. AST, biomarcador de salud hepática, disminuyó significativamente con todas las dosis, indicando mayor afectación de función hepática vs grupo control. De todos estos resultados, una dosis de 250 μg/ratón de PEG-CoFe₂O₄ exhibe daño relativamente mayor. Por tanto, para análisis posteriores usamos 250 μg/ratón de PEG-CoFe₂O₄.

Contenido de índices bioquímicos en suero tras diferentes dosis (en μg) de exposición a PEG-CoFe₂O₄ en ratones con barras de error mostradas en la figura

Efecto de la Curcumina en Toxicidad de PEG-CoFe₂O₄

En este estudio, se empleó curcumina para reducir la inflamación por efecto dañino de PEG-CoFe₂O₄. Para investigar el efecto de curcumina en toxicidad de PEG-CoFe₂O₄, se midieron índices bioquímicos e histología tisular de ratones. Estos índices incluyen BUN, CREA, Cys-C, ALT, AST y TB en suero de ratones del grupo de tratamiento. Se observa que BUN, CREA, Cys-C y AST muestran disminución significativa en diferentes dosis de curcumina vs grupo de exposición, mientras que con 150 μg/ratón de curcumina, ALT, AST y CREA vuelven a nivel normal vs grupo control (Fig. 9). En contenidos de TB y ALT, todas las dosis de curcumina muestran disminución significativa vs grupo de exposición a PEG-CoFe₂O₄. En Fig. 9, los resultados indican que la curcumina exhibe efecto de tratamiento positivo sobre el daño de PEG-CoFe₂O₄ en ratones y diferentes dosis muestran mejor efecto. Este trabajo investiga el efecto protector de la curcumina contra niveles séricos de enzimas hepáticas (ALT y AST) y renales (BUN, CREA, Cys-C y TB). En este estudio, PEG-CoFe₂O₄ aumentó significativamente los niveles séricos de enzimas ALT, AST, BUN, CREA, Cys-C y TB vs grupo control, que se acercaron a nivel normal tras administración de curcumina. La necrosis o daño de membrana celular puede causar liberación de estas enzimas a la sangre. Sin embargo, el nivel sérico de estas enzimas se asocia con rendimiento hepático y renal. En grupos que recibieron curcumina, la cantidad de estas enzimas se redujo, indicando efectos protectores contra toxicidad de nanopartículas PEG-CoFe₂O₄. Esto se debe al efecto antioxidante de la curcumina que reduce estrés oxidativo. Además, TNF-α e IL-1 juegan papel en inducción de necrosis hepática. Así, la curcumina puede reducir efecto de toxicidad inhibiendo secreción de TNF-α e IL-1 por macrófagos [11]. Estos hallazgos concuerdan con resultados reportados en referencia [27].

Contenido de índices bioquímicos en suero en ratones del grupo de tratamiento con curcumina con barras de error indicadas en el gráfico

El análisis histopatológico de hígado, riñones y bazo también se realizó para verificar posibles efectos tóxicos inducidos por administración de nanopartículas. Los órganos de cada ratón se extrajeron, trataron en formalina al 10% e incluyeron en parafina. Secciones de 5 micrómetros se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) y examinaron microscópicamente. Los resultados muestran que no se registraron cambios histopatológicos relevantes en órganos analizados (Fig. 10). Los exámenes de hígado y bazo mostraron que la arquitectura orgánica no se vio afectada por administración de nanopartículas de ferrita de cobalto. Esto se debe a dos razones posibles: primero, el tamaño de nanopartículas es relativamente mayor (24 nm), y segundo, se administró dosis pequeña de nanopartículas (150, 250 y 350 μm) y se sacrificaron ratones a 24 h. Así, solo afecta función de órganos pero no su arquitectura. Esto es similar al caso reportado en referencia [28], donde administraron 20 mg/kg (mayor que nuestro caso) por 7 días. Similarmente, en referencia [29], no se monitorizaron cambios histopatológicos en órganos.

Secciones histológicas de tejidos tras exposición a PEG-CoFe₂O₄ o curcumina en ratones

Conclusiones

En este trabajo, fabricamos exitosamente nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con PEG de 24 nm mediante técnica hidrotérmica. Se exploró en detalle la toxicidad inducida en varios órganos de ratones usando diferentes dosis de nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas con PEG, y luego se estudió su efecto curativo usando curcumina. Se realizaron ensayos biológicos para verificar la toxicidad de nanopartículas CoFe₂O₄. Se monitorizaron cambios positivos en índices bioquímicos tras tratamiento con curcumina, que volvieron a nivel normal o disminuyeron sustancialmente. Este estudio indica que PEG-CoFe₂O₄ recubierto sintetizado vía hidrotérmica es un buen modelo para transportador de fármacos, y la curcumina, compuesto natural sin efectos secundarios, podría utilizarse para tratamiento de toxicidad y otras enfermedades en organismos vivos.

Abreviaturas

ALT:

Alanina aminotransferasa

AST:

Aspartato aminotransferasa

BUN:

Nitrógeno ureico en sangre

CREA:

Creatinina

Cys-C:

Cistatina C

FTIR:

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

H&E:

Hematoxilina-eosina

NPs:

Nanopartículas

Nrf2:

Factor nuclear eritroide 2-relacionado factor 2

PEG:

Polietilenglicol

TB:

Bilirrubina total

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TGA:

Análisis termogravimétrico

TNF:

Factor de necrosis tumoral

XRD:

Difracción de rayos X