Liberación de sustancias exopoliméricas mediada por calcio en fitoplancton marino expuesto a nanopartículas diseñadas

Resumen

Las nanopartículas diseñadas (ENPs) se incorporan rápidamente a productos de consumo, sin embargo, su impacto en los ecosistemas marinos sigue siendo poco comprendido. Examinamos la respuesta de cuatro especies de diatomeas —Odontella mobiliensis, Skeletonema grethae, Phaeodactylum tricornutum y Thalassiosira pseudonana— y un alga verde, Dunaliella tertiolecta, a ENPs modelo: TiO₂ de 25 nm, SiO₂ de 10–20 nm y CeO₂ de 15–30 nm. Las ENPs de SiO₂ amplificaron la secreción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) en un 200–800 %, mientras que el TiO₂ indujo la menor liberación de EPS. Concurrentemente, las concentraciones intracelulares de Ca²⁺ aumentaron significativamente tras la exposición a ENPs, lo que indica una vía de secreción dependiente de Ca²⁺. Elucidar este mecanismo ofrece una base para desarrollar estrategias que mitiguen los posibles riesgos ecológicos que plantean las ENPs en ambientes marinos.

Antecedentes

Las nanopartículas diseñadas (ENPs), que oscilan entre 1 y 100 nm, son componentes esenciales de productos como tintas, pinturas, cosméticos y fármacos. En 2017, la financiación estadounidense en nanotecnología alcanzó los 1400 millones de dólares, reflejando el crecimiento del sector [1–3]. A medida que las ENPs ingresan inevitablemente en sistemas acuáticos, su alta reactividad superficial genera preocupaciones sobre la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otros efectos toxicologicos [5–6]. El fitoplancton marino, los productores primarios del océano, ha demostrado sensibilidad a las ENPs, con efectos perjudiciales documentados en el crecimiento y la viabilidad [7–11]. Sin embargo, las respuestas celulares del fitoplancton a diversas ENPs no están completamente definidas [12–21]. El fitoplancton produce rutinariamente sustancias exopoliméricas (EPS), una compleja gama de polisacáridos y proteínas que median la formación de biopelículas, la captura de metales y la protección contra factores estresantes ambientales [22–27]. La secreción de EPS es a menudo una respuesta al estrés, y la señalización de calcio (Ca²⁺) se ha implicado en la regulación de la liberación de EPS en diatomeas [28–31]. Aunque las ENPs pueden perturbar las vías intracelulares de Ca²⁺ [29,32–34], no se ha informado una evaluación sistemática de la secreción de EPS mediada por Ca²⁺ en respuesta a TiO₂, SiO₂ o CeO₂.

Resultados y Discusión

Caracterización de ENPs

La dispersión dinámica de luz (DLS) reveló partículas de TiO₂ predominantemente a 25 nm, SiO₂ a 10–20 nm y CeO₂ a 15–30 nm (Fig. 1). Subpoblaciones menores de hasta 70 nm probablemente resultan de agregación. Estas mediciones confirmaron las especificaciones del fabricante y aseguraron consistencia entre experimentos.

Figura 1. Distribución de tamaño DLS de TiO₂ (a), SiO₂ (b) y CeO₂ (c) en medio L1 tras sonicación. Concentración: 1 µg/mL.

Las ENPs Inducen Elevación de Ca²⁺ Intracelular

La obtención de imágenes con Fluo-4AM demostró que 1 mg/mL de SiO₂ aumentó el Ca²⁺ intracelular en un 50–300 %, el CeO₂ en un 150–200 % y el TiO₂ en ~40 % en todas las especies analizadas (Fig. 2). El TiO₂ indujo solo cambios modestos de Ca²⁺, lo que probablemente refleja su pronunciada citotoxicidad y la muerte celular asociada [37–39]. Estos resultados establecen que distintas ENPs provocan señalización de Ca²⁺ específica de especie, un prerrequisito para la secreción subsiguiente de EPS.

Figura 2. Respuestas de Ca²⁺ intracelular en Dunaliella tertiolecta (a), Thalassiosira pseudonana (b), Skeletonema grethae (c), Phaeodactylum tricornutum (d) y Odontella mobiliensis (e) tras exposición a 1 mg/mL de TiO₂ (verde), SiO₂ (rojo), CeO₂ (púrpura) y control (azul). Los datos representan promedios de 20 células.

Liberación de EPS Inducida por ENPs

Utilizando un ensayo de lectina ligado a enzima (ELLA), cuantificamos la secreción de EPS normalizada al ADN genómico total. El SiO₂ estimuló la liberación de EPS hasta un 1000 % en Skeletonema grethae y un 900 % en Phaeodactylum tricornutum, con aumentos del 500–800 % en las especies restantes (Fig. 3). El TiO₂ desencadenó secreción significativa de EPS solo en Skeletonema y Phaeodactylum, reflejando su respuesta limitada de Ca²⁺. El CeO₂ tuvo efectos modestos en todos los taxones. La magnitud de la liberación de EPS se correlacionó fuertemente con las elevaciones de Ca²⁺ observadas, reforzando el modelo de secreción dependiente de Ca²⁺.

Figura 3. Liberación de EPS de cada especie de fitoplancton tratada con TiO₂ (círculos), SiO₂ (triángulos) y CeO₂ (cuadrados) a concentraciones de 10 µg/mL a 5 mg/mL. Los valores representan media ± DE (n = 3).

Conclusiones

Nuestro estudio demuestra que las nanopartículas diseñadas, particularmente el SiO₂, pueden provocar una secreción sustancial de EPS mediada por Ca²⁺ en fitoplancton marino. Esta respuesta varía entre especies y tipos de nanopartículas, destacando la complejidad de las interacciones nanomaterial-biota. Investigaciones futuras deben extender estos hallazgos a matrices de agua de mar naturales y evaluar las consecuencias ecológicas de la dinámica alterada de EPS, como la formación de biopelículas y el secuestro de contaminantes.

Métodos

Los cultivos de fitoplancton (Odontella mobiliensis, Dunaliella tertiolecta, Skeletonema grethae, Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana) se cultivaron en medio L1 a 24 °C bajo un ciclo luz:oscuridad de 14:10 h. Las ENPs (TiO₂, SiO₂, CeO₂) se sonicaron en agua, se reconstituyeron en L1 filtrado y se caracterizaron por DLS (Brookhaven BI-200SM). Las células se expusieron a ENPs (10 µg/mL–5 mg/mL) durante 48 h en placas de 96 pozos; el EPS se cosechó de los sobrenadantes y se cuantificó mediante ELLA usando conjugado Concanavalina A-HRP. El Ca²⁺ intracelular se midió con tinte Fluo-4AM en un Nikon Eclipse TE2000-U. El contenido de ADN se determinó por NanoDrop tras extracción con kit ZR-96 Quick-gDNA. El análisis estadístico empleó GraphPad Prism, reportando medias ± DE de al menos tres replicados independientes.