Nanopartículas de sorafenib dirigidas por hGC33 inhiben sinérgicamente hepatoma suprimiendo vía Wnt

Resumen

La administración de inhibidores tumor-específicos es un desafío en tratamiento del cáncer. Nanopartículas modificadas con anticuerpos pueden entregar fármacos a células tumorales que sobreexpresan antígenos tumor-asociados específicos. Aquí construimos nanopartículas de polímero polietilenglicol-b-PLGA cargadas con sorafenib y modificadas con anticuerpo hGC33 dirigido a glicano-3 (GPC3+), proteína de membrana sobreexpresada en carcinoma hepatocelular (CHC). Hallamos que NPs modificadas con hGC33 (hGC33-SFB-NP) dirigieron a células CHC GPC3+ uniéndose específicamente a GPC3 en superficie, inhibieron transducción de señal inducida por Wnt, y detuvieron células CHC en fase G0/G1 down-regulando ciclina D1, atenuando migración al inhibir transición epitelio-mesénquima (EMT). hGC33-SFB-NP inhibió migración, progresión del ciclo y proliferación de células CHC inhibiendo vías Ras/Raf/MAPK y Wnt en tándem con moléculas GPC3. hGC33-SFB-NP inhibió crecimiento de cáncer hepático in vivo y mejoró supervivencia de ratones portadores de tumor. Concluimos que hGC33 aumenta direccionamiento de SFB-NP a células CHC. hGC33-SFB-NP inhibe sinérgicamente progresión de CHC bloqueando vías Wnt y Ras/Raf/MAPK.

Introducción

Glicano-3 (GPC3) es un proteoglicano de sulfato de heparano expresado en superficies celulares mediante anclas glicerofosfatidilinositol. Aunque GPC3 se expresa en varios tejidos durante desarrollo, su expresión se inhibe al menos parcialmente en la mayoría de tejidos adultos por metilación de ADN en región promotora. Sin embargo, proteína GPC3 se sobreexpresa en ~70% de pacientes con CHC y estimula transducción de señal Wnt clásica mediante interacción con ligando Wnt, promoviendo unión Wnt/frizzled y crecimiento CHC. Activación de vía Wnt clásica es uno de los eventos más frecuentes asociados a transformación maligna de CHC. Basado en capacidad de GPC3 para aumentar señalización Wnt, hipotetizamos que sobreexpresión de GPC3 promueve crecimiento CHC estimulando vía Wnt clásica.

Anticuerpo monoclonal terapéutico que reconoce epítopo en porción C-terminal de GPC3 (524–563) (hGC33) inhibe crecimiento tumoral en xenoinjertos subcutáneos de HepG2 y Huh-7 en ratones. hGC33 ha sido humanizado por trasplante de región determinante de complementariedad, y su efecto anticancerígeno es tan efectivo como hGC33 para xenoinjerto HepG2, usándose en ensayos clínicos. Resultados sugieren importante actividad antitumoral de hGC33; tratamiento anti-GPC3 inhibirá directamente proliferación/supervivencia de células CHC bloqueando Wnt y/u otras vías.

Sin embargo, por patogénesis compleja de CHC, eficacia de bloquear GPC3 sola es limitada. Explorar mecanismo detallado de patogénesis CHC e identificar biomarcadores prometedores para diagnóstico y pronóstico puede proporcionar dianas terapéuticas efectivas y mejorar pronóstico. Anticuerpos anti-GPC3 se han propuesto para aumentar sensibilidad de CHC a quimioterápicos. Actividad antitumoral de hGC33 combinado con quimioterapia estándar se evaluó recientemente. Sorafenib es fármaco oral dirigido novedoso para CHC que inhibe directamente proliferación tumoral bloqueando vía de señalización celular mediada por RAF/MEK/ERK. Sin embargo, distribución no dirigida de sorafenib in vivo y señales Wnt anormalmente activadas en CHC limitan efectividad y aumentan efectos secundarios. Wnt se une a receptores familia Frizzled activando transducción intracelular que regula proliferación, apoptosis, migración, causando resistencia en muchos tumores como CHC.

En modelos de xenoinjerto HepG2, combinación hGC33 y sorafenib es más efectiva inhibiendo crecimiento tumoral que sorafenib solo. Administración de fármacos con nanovehículos poliméricos ha recibido atención en tratamiento cáncer. Nanovehículos cargados con fármacos anticancerígenos previenen distribución y degradación inespecíficas in vivo, mejoran biodisponibilidad y direccionamiento antitumoral, simplifican evaluación farmacocinética y tratamiento. En variedad de nanopartículas poliméricas, formulaciones basadas en ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) son consideradas portadores ideales y seguros. Polietilenglicol-b-poli(d,l-lactida-co-glicólido) (PEG-b-PLGA) basados en copolímeros PEG y PLGA, son seguros y no tóxicos tras hidrólisis, aprobados por FDA. Por tanto, inyección intravenosa con nanovehículo copolímero PEG-b-PLGA es estrategia prometedora para entrega dirigida y mayor eficacia. Además, aplicación de anticuerpo específico hGC33 contra moléculas GPC3 en membrana de células CHC no solo mejora entrega de nanofármaco in vitro e in vivo, sino que también bloquea vías Wnt/u otras conectadas con GPC3, inhibe proliferación/supervivencia de células cancerosas, pudiendo lograr actividad antitumoral sinérgica.

En este estudio exploramos si nanopartículas de copolímero PEG-b-PLGA modificadas con anticuerpo hGC33 facilitan entrega de sorafenib (hGC33-SFB-NP) a CHC in vivo e in vitro, mejorando eficiencia tratamiento mediante direccionamiento activo para cambiar farmacocinética. Según tamaño, potencial zeta, morfología, eficiencia encapsulación, capacidad carga y liberación in vitro, NP dirigido se caracterizó exhaustivamente. Capacidad direccionamiento in vitro caracterizada por captación celular de HepG2. Biodistribución y efecto terapéutico sinérgico de hGC33-SFB-NP en CHC se evaluaron comparando sorafenib y SFB-NP. Resultados demostraron que hGC33-SFB-NP dirige a CHC GPC3+. Inhibe progresión ciclo celular, proliferación e invasión tumoral inhibiendo vías Wnt y Ras/Raf/MAPK, inhibiendo sinérgicamente progresión cáncer hepático.

Materiales y métodos

Materiales

Anticuerpo hGC33, MTT, DAPI, JC-1, DMSO de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida clorhidrato e N-hidroxisuccinimida de Qiyun Biotech (Guangzhou, China). Kit cuantificación proteína BCA, cumarina-6, kit detección apoptosis Annexin V-FITC/PI de Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). Copolímero dibloque mal-PEG-b-PLGA (25,000–30,000 Da, PLGA, LA:GA, p/p; PEG, 13–15%) de Polyscitech (West Lafayette, IN, USA). Kits anticuerpos PI3K (9655#), p-Akt (9916#), mTOR (9964#), familia Bcl-2 (9942#), apoptosis (9915#), anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón de Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA); ciclina B1 y quinasa dependiente de ciclina de Abcam (USA). Anticuerpos anti-fosfo-Rb, ciclina D1, quinasa checkpoint 1 (CHK1), P53, BRCA1 fosforilada (p-BRCA1), RAD51, citocromo C, metaloproteinasa matriz (MMP2 y MMP9) de Abcam (USA). Demás reactivos grado analítico de proveedores estándar, usados sin purificación.

Células y animales

Línea CHC HepG2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) cultivada en medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) con 10% SFB (HyClone, Logan, UT, USA), 80 U/mL penicilina, 80 μg/mL estreptomicina, 5% CO₂, 37 °C. Ratones nude BALB/C, 20–22 g (5–6 semanas) de Nanjing Junke Biotechnology (China). Mantenidos en habitación SPF. Cuidados y tratamientos según requisitos Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui. Protocolos revisados y aprobados por comité ética experimentación animal (Aprobación No.: 2019dw013).

Preparación de NPs

Para NPs, mal-PEG-b-PLGA y SFB o cumarina-6 se pesaron y disolvieron en fase orgánica (3:2 v/v diclorometano/acetona). Solución se añadió gota a gota a solución alcohol polivinílico (PVA) 5% p/v con vortex continuo. Mezcla se sonificó intermitentemente con sonda (550 W, 8 veces) en hielo para crear emulsión aceite-agua. Emulsión se añadió a solución PVA 1% p/v con agitación magnética. NPs de SFB y cumarina-6 se recogieron por centrifugación 8000 rpm 30 min, lavadas 3 veces con agua Milli-Q.

Para generar hGC33-NP mediante enlaces tioéter formados por reacción maleimida con residuos sulfhidrilo libres en anticuerpo hGC33, anticuerpo hGC33 se mezcló con NPs funcionalizadas maleimida en relación molar 5:1 (hGC33:mal-PEG-b-PLGA) incubando 4 °C 16 h con agitación continua. hGC33 se conjugó a NPs mediante reacción grupos sulfhidrilo en anticuerpo con grupos maleimida de cadenas PEG. Anticuerpos no conjugados se eliminaron por columnas Sepharose CL-4B. Conjugación eficiente confirmada con kit BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Caracterización de nanopartículas (NPs)

Morfología, tamaño, eficiencia encapsulación (EE) y estabilidad

Morfología NPs evaluada por microscopía electrónica transmisión (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japón). NPs sin fármaco hGC33-NP y NPs sin fármaco registradas por espectrofotómetro FTIR (Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) usando bromuro potasio. Tamaño medio y potencial zeta caracterizados con Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) a 20 °C. EE y contenido carga (LC) evaluados por ultrafiltración. Muestras cargadas en dispositivo ultrafiltración (100 kMWCO; Sartorius, Göttingen, Alemania) centrifugadas 8000 rpm 25 min 4 °C para eliminar fármaco libre. Mismo volumen disuelto en acetonitrilo para confirmar cantidad total fármaco. Concentración medida por HPLC. Longitud onda absorción 266 nm. EE (%) = (peso fármaco encapsulado/peso total fármaco) × 100%. LC (%) = (peso fármaco encapsulado/peso NPs) × 100%. Estabilidad NPs a TA evaluada por dispersión luz dinámica (DLS) en puntos temporales predeterminados (0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 h) a 25 °C.

Liberación in vitro de fármaco y ensayo captación celular

Liberación fármaco de NPs investigada con bolsas diálisis corte peso molecular 10 kDa. 1 mL NPs cargado en bolsa diálisis (MWCO 8,000–10,000 Da; Spectrum Labs Inc., CA, USA). Bolsas sumergidas en PBS agitadas con agitador magnético 25 °C. Perfiles liberación medidos en 100 mL PBS 0.2 M (pH 7.4) 7 días. Concentración fármaco medida por HPLC. En estudios subsiguientes, hGC33-cumarina 6-NP con mismo tamaño que hGC33-SFB-NP usado para evaluar direccionamiento. HepG2 (GPC3+) y Li-7 (GPC3−) incubados con hGC33-cumarina 6-NP 0.5, 2, 4 h a 37 °C 5% CO₂. Células co-cultivadas lavadas, fijadas 4% formaldehído 10 min; núcleos teñidos 5 μg/mL Hoechst 33,342 15 min para localizar NPs intracelulares. Microscopía confocal analizó imágenes NPs intracelulares (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokyo, Japón).

Efecto celular in vitro

Citotoxicidad de hGC33 libre (Ab), SFB libre, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP determinada por MTT. HepG2 (GPC3+) y Li-7 (GPC3−) en fase logarítmica sembradas en placa 96 pocillos a 4000 células/pocillo, incubadas 48 h 37 °C 5% CO₂. Tratadas con hGC33, SFB libre, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP 48 h 37 °C 5% CO₂. Tras co-cultivo, actividad antiproliferativa por MTT. Absorbancia medida 490 nm, IC50 calculado con SPSS 17.0.

Medida capacidad invasión celular

Células fase logarítmica sembradas en placas 6 pocillos a 5 × 10⁴ células/pocillo, rascadas con punta succión, reemplazadas con medio sin suero. Curación herida registrada 0, 24, 48 h en control y experimental. Mismo número células inoculado en cámaras Transwell tratadas con hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP. 500 μL medio 10% SFB en cámara inferior. Incubación 24 h, cámara retirada, células fijadas 4% paraformaldehído, teñidas 0.1% violeta cristal. Tamaño curación herida y número células migradas calculados para evaluar capacidad migración.

Determinación ciclo celular

Tras incubación nocturna en placas 6 pocillos, células tratadas con hGC33 libre (Ab), SFB libre, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP 24 h, recolectadas, fijadas con etanol. Tras tinción yoduro propidio, citometría flujo realizada, ciclo analizado con modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).

Western Blotting

Para evaluar estado activación vía señal y expresión moléculas diana, células incubadas noche en placas 6 pocillos, tratadas con hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP 24 h. Células cada grupo recolectadas, proteína extraída y medida. Concentración medida y calibrada con kit BCA (Biosharp, Hefei, China). Proteína separada por electroforesis gel poliacrilamida dodecil sulfato 12%, transferida a membrana PVDF, bloqueada con leche descremada. Primer anticuerpo (diluido 1:1000) incubado noche 4 °C, segundos anticuerpos (1:2000) 1 h TA. Bandas visualizadas sustratos ECL (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA), imágenes mostradas por sistema análisis gel, β-actina como control.

Actividad antitumoral in vivo

Inhibición de hGC33 libre, SFB libre, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33-SFB-NP sobre crecimiento CHC in vivo determinada. Según reglamentos comité ética Universidad de Tecnología Anhui, experimentos en ratones BALB/c en jaulas en habitación temperatura controlada (23 ± 2 °C) ciclo 12 h luz/oscuridad. Suspensión 50 μL con 5 × 10⁶ células HepG2 vivas inyectada subcutáneamente abdomen derecho ratones hembras BALB/c 5 semanas (20–22 g). Cuando volumen tumoral ~50 mm³, ratones divididos aleatoriamente 6 grupos (10 ratones/grupo). Control salino normal NS (200 mg/kg NP nulo en 200 μL PBS), hGC33-null-NP (en 200 μL PBS, equivalente hGC33 = 100 μg/kg/vez), hGC33 libre (en 200 μL PBS, 100 μg/kg/vez), SFB libre (dosis SFB: 8 mg/kg/vez), SFB-NP (dosis SFB: 8 mg/kg/vez), hGC33-SFB-NP (equivalente SFB = 8 mg/kg/vez, hGC33 = 100 μg/kg/vez) inyectados vena cola cada 2 días 10 veces. Peso y tamaño tumoral medidos cada 4 días. Fórmula volumen tumoral = 0.5 × L × W² (L y W longitud y anchura tumor). Cuatro semanas post-administración, animales anestesiados éter dietílico, tamaño y peso tumoral medidos. Además, tumor, corazón, hígado, riñón, pulmón, bazo extirpados, fijados 4% paraformaldehído, incluidos en parafina, seccionados, teñidos hematoxilina-eosina para evaluar cambios histológicos por microscopía digital.

Análisis estadístico

Datos presentados como media ± desviación estándar (DE) evaluados por ANOVA con SPSS 18.0. Comparaciones pareadas por t-test bilateral Student. Diferencias significativas para P < 0.05.

Resultados

Caracterización de NPs y liberación fármaco in vitro

Diámetro y propiedades superficiales NP afectan captación celular, liberación fármaco, distribución in vivo; NPs preparadas caracterizadas con parámetros correspondientes. Morfología, tamaño, distribución tamaño de SFB-NP, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP resumidos Fig. 1. Morfología hGC33-SFB-NP por TEM (Fig. 1a) muestra núcleos rígidos con bordes difusos, indicando hGC33 en superficie NPs. Tamaños SFB-NP, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP 100–150 nm, distribución unimodal típica. Diámetro medio hGC33-SFB-NP (120.2 ± 10.2 nm) ligeramente mayor que hGC33-null-NP, SFB-NP, NP nulo (Fig. 1a, Tabla 1). Películas esféricas delgadas con superficie única en hGC33-SFB-NP y hGC33-null-NP indican anticuerpo hGC33 en superficie. Tamaño aumentado confirma existencia película hGC33. Síntesis hGC33-SFB-NP confirmada por ¹H-NMR (Fig. 1b) antes preparación NPs. Picos 5.2 ppm y 1.58 ppm asignados a protones –CH3 ácido láctico; pico 4.8 ppm a –OCH2– ácido glicólico; pico 3.6–3.8 ppm a protones –CH2CH2O– unidades repetidas PEG. Química superficie PEG-b-PLGA y Ab-PEG-b-PLGA NPs estudiada por FTIR (Fig. 2c). En espectro PEG-b-PLGA, banda fuerte ~1750 cm⁻¹ de estiramiento carbonilo (C=O) cadena PLGA. Banda 2880 cm⁻¹ por estiramiento –CH en cadena PEG. Pico 2520 cm⁻¹ atribuido a estiramiento –SH anticuerpo hGC33. Resultados ¹H NMR y FTIR indican anticuerpo injertado en esqueleto copolímeros PEG-b-PLGA.

Interesantemente, hGC33-SFB-NP y SFB-NP en medio DMEM 10% SFB (pH 7.4) liberación rápida ~4 días, luego lenta y estable; liberación acumulada SFB en 20 días ~77% y 65% respectivamente (Fig. 1d). Diferencia puede deberse a molécula hidrofílica en superficie matriz PEG-b-PLGA, acelerando degradación NPs aumentando hidratación e hidrólisis. Estabilidad NPs: hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP, SFB-NP en DMEM 10% SFB (pH 7.4) y PBS (pH 7.4). Tamaños NPs estables >2 semanas. SFB liberado hGC33-SFB-NP forma sostenida estable 14 días, cambio modesto tamaño en DMEM vs 10% SFB (Fig. 1e, f). Estabilidad hGC33-SFB-NP apropiada para rol biológico sostenido SFB.

Potencial zeta grande causa interacción electrostática repulsiva fuerte entre NPs manteniendo estabilidad dispersión. Tabla 1: potenciales zeta hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP: −18.2 ± 2.2 mV, −18.5 ± 1.8 mV, −15.9 ± 2.1 mV, posiblemente por cargas negativas grupo aldehído, carboxilo, fosfato en glicoproteína anticuerpo hGC33. NPs cargadas negativamente alta estabilidad suspensión. Además, superficie células negativamente cargada en ambientes fisiológicos normales; NPs preparadas repelen células baja carga, menos tóxicas tejidos/células. Distribución tamaño null-NP y SFB-NP (índice polidispersidad PDI 0.18 y 0.19) ligeramente menor que hGC33-null-NP (PDI 0.21) y hGC33-SFB-NP (PDI 0.23). Tamaño NPs buena uniformidad. Tamaño, distribución, potencial zeta en Tabla 1 según EE y LC encapsulación SFB. hGC33 no conjugado eliminado ultracentrifugación, eficiencia unión hGC33 a NPs evaluada. Análisis proteína BCA mostró eficiencia unión 79.5% ± 2.9%.

hGC33-Cumarina 6-NP dirige efectivamente células HepG2 GPC3+

Para verificar si anticuerpo hGC33 en NPs mantiene capacidad dirigir específicamente GPC3, usamos HepG2 GPC3+ y Li-7 GPC3− como células diana y hGC33-cumarina 6-NP como NPs trazadoras, incubando diferentes células 2, 4, 8 h. Células lavadas PBS 3 veces, reaccionadas DAPI teñir núcleo. Fijadas, fotografiadas microscopio fluorescencia Leica (DMi8, Alemania). Fluorescencia verde en HepG2 significativamente mayor que Li-7 mismo tiempo incubación (Fig. 2), indicando mayor cantidad hGC33-cumarina 6-NP internalizadas en HepG2. Resultados documentan anticuerpo hGC33 en hGC33-Cumarina6-NP mantiene capacidad dirigir GPC3 mediar internalización NPs. Expresión GPC3 en HepG2 y Li-7 examinada inmunoquímica indirecta y tinción citoquímica. HepG2 sobreexpresan GPC3; Li-7 no expresan GPC3 (Fig. 2).

hGC33-Null-NP inhibe proliferación células HepG2

Para determinar si NP modificada hGC33 (hGC33-null-NP) inhibe crecimiento CHC, medimos inhibición crecimiento línea CHC GPC3+ HepG2 y línea GPC3− Li-7. Ambos hGC33-null-NP y hGC33 inhibieron crecimiento HepG2 tras 24 h tratamiento, pero hGC33 efecto inhibitorio más significativo que hGC33-null-NP (Fig. 3a); en contraste, hGC33-null-NP y hGC33 no afectaron crecimiento Li-7 GPC3− (Fig. 3b). Curso temporal representativo hGC33-null-NP (equivalente 0.1 μM hGC33) y hGC33 (0.1 μM) en proliferación HepG2 ilustrado Fig. 3c. Al ser hGC33 péptido C-terminal que reconoce GPC3, hGC33 superior a hGC33-null-NP inhibiendo HepG2. Resultados sugieren molécula hGC33 en hGC33-null-NP puede tener efecto bloqueo espacial, afectando capacidad unión hGC33 a epítopos.

hGC33-Null-NP inhibe ciclo celular células HepG2

Para entender mecanismo actividad molecular anticuerpo hGC33 modificado en NPs hGC33-null-NP, estudiamos progresión ciclo celular HepG2 tratadas con hGC33-null-NP. En línea HepG2, hGC33-null-NP y hGC33 aumentaron significativamente proporción células fase G1 (Fig. 4a, b), indicando ambos inducen arresto ciclo en G1. Además, hGC33-null-NP y hGC33 down-regulan significativamente expresión ciclina D1 en HepG2 (Fig. 4c, d).

Activación Wnt en HepG2, Huh-7 y Li-7

Para entender activación señal Wnt/β-Catenina clásica en células CHC, detectamos expresión ligando Wnt y proteína receptor frizzled (FZD/Frz) en líneas CHC: HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC3+), Li-7 (GPC3−). Wnt3a y receptor FZD transducen vía β-Catenina expresados en todas líneas, especialmente HepG2 y Huh-7 (Fig. 5).

hGC33-Null-NP inhibe proliferación dependiente transducción Wnt inducida por Wnt3a

Estudios muestran parte extracelular GPC3 puede ser co-receptor Wnt, promoviendo activación/transducción señal Wnt/β-Catenina. Por tanto, co-incubando HepG2 (GPC3+), Huh-7 (GPC3+), Li-7 (GPC3−) con hGC33 y hGC33-null-NP, activación señal Wnt/β-catenina bloqueada por hGC33 y hGC33-null-NP, inhibiendo proliferación HepG2 y Huh-7, no Li-7, en medio condicionado Wnt3a. Proliferación Li-7 probablemente por ausencia GPC3 superficie (Fig. 6). Resultados indican hGC33 y hGC33-null-NP se unen específicamente moléculas GPC3 membrana celular. hGC33 y hGC33-null-NP neutralizan parcialmente actividad mitogénica Wnt3a e inhiben vía Wnt/β-catenina. Sin embargo, inhibición proliferación por hGC33-null-NP menor que hGC33. Quizás estructura espacial NPs interfiere hGC33-null-NP limitando función molécula hGC33 en NPs, no pudiendo bloquear completamente interacción GPC3-Wnt3a.

hGC33-Null-NP inhibe transducción señal inducida Wnt3a en HepG2 y Huh-7

Para entender efecto hGC33-null-NP en señalización Wnt/β-catenina en CHC, extrajimos proteínas HepG2 y Huh-7 tratadas con hGC33 o hGC33-null-NP. Western blot mostró tras tratamiento hGC33-null-NP, niveles pYAP y pβ-catenina aumentaron, pero YAP y β-catenina disminuyeron. Además, niveles ciclina D1, CD44, VEGF, c-MYC en grupo hGC33-null-NP menores que control, pero menos que tratamiento hGC33. Efectos similares en HepG2 y Huh-7 (Fig. 7).

hGC33-SFB-NP o hGC33 atenúan migración CHC inhibiendo transición epitelio-mesénquima (EMT)

CHC uno de cánceres más letales, incidencia creciente. Sorafenib único tratamiento estándar aprobado para CHC avanzado, mejora supervivencia. Sin embargo, observaciones clínicas/preclínicas sugieren eficacia limitada por desarrollo rápido resistencia. Elucidar mecanismo escape resistencia sorafenib es énfasis mayor en investigación CHC. Recientemente, más atención a papel EMT en progresión CHC y desarrollo resistencia. EMT transformación epitelio a mesénquima, confiere capacidad metastatizar/invadir: adquisición características células madre, reducción apoptosis/envejecimiento, promoción inmunosupresión, participación ocurrencia/desarrollo cáncer. Pérdida expresión E-cadherina paso clave carcinogénesis y EMT. EMT reprogramación molecular/celular multi-paso desarrollo que células cancerosas usan para agresión. Principalmente down-regulan E-cadherina, queratina, mucina, ZO-1; up-regulan vimentina, α-SMA, fibronectina, MMPs, N-cadherina, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, colágeno tipo I/II para invasión, metástasis, anti-apoptosis característicos EMT. Cambios expresión proteínas involucran activación vías Wnt/β-catenina y Ras/Raf/MAPK.

Experimentos mostraron anticuerpo hGC33 en superficie vector NP inhibe transducción señal β-catenina inducida Wnt3a, down-regulando β-catenina, CD44, VEGF, ciclina D1, c-MYC. Además, hGC33-SFB-NP inhibe activación vía Ras/Raf/MAPK e inhibe proliferación/apoptosis células CHC. hGC33 y SFB efecto sinérgico, inhibiendo EMT y disminuyendo migración CHC (Fig. 8).

hGC33-SFB-NP inhibe crecimiento carcinoma hepatocelular in vivo y mejora supervivencia ratones portadores tumor

Evaluar actividad antitumoral hGC33-SFB-NP in vivo: HepG2 y Huh-7 inoculados subcutáneamente abdomen derecho y dorso ratones nude BALB/c hembras. Cuando xenoinjerto ~30 mm³, ratones divididos aleatoriamente grupos (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33 libre, SFB libre, control) evaluar inhibición CHC (n=5/grupo). Fig. 9a,b: hGC33-SFB-NP ralentizó significativamente crecimiento tumoral vs control PBS y otros tratamientos. Frente a PBS, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33 libre, SFB libre también inhibieron CHC, porque hGC33 libre y SFB libre inhiben directamente Wnt y Ras/Raf/MAPK respectivamente, inhibiendo proliferación CHC en cierta medida. Aunque hGC33 modificado NPs (hGC33-null-NP) unido nano-superficie por enlaces químicos, no afectó direccionamiento hGC33 a moléculas GPC3 e inhibición actividad Wnt. SFB cargado NPs (SFB-NP), tras endocitosis, degradado liberando SFB copolímero inhibiendo crecimiento CHC. En conjunto, efecto inhibitorio hGC33-SFB-NP en injertos HepG2 mayor que Huh-7, probablemente porque HepG2 expresa GPC3.

Peso corporal ratones nude cada grupo medido (Fig. 9c,d). Peso grupo control disminuyó gradualmente. Peso ratones grupos hGC33 libre, SFB libre, SFB-NP, hGC33-null-NP también disminuyó progresivamente no significativamente menos que control. Sin embargo, peso ratones nude con HepG2 y Huh-7 tratados hGC33-SFB-NP solo disminuyó ligeramente, manteniéndose estable durante tratamiento. Resultados apoyan que nanofármaco hGC33-SFB-NP no tiene toxicidad significativa en ratones nude, y SFB cargado nanovehículo y hGC33 modificado superficie producen efecto antitumoral aditivo o sinérgico.

Discusión

Para examinar idoneidad hGC33-SFB-NP terapia dirigida CHC, probamos conjugados modelo capacidad unir glicano-3 humano en células CHC in vitro; inhibir proliferación, migración, transducción señal Wnt/β-catenina CHC GPC3+; inhibir CHC sobreexpresando glicano-3 in vivo.

Para unir covalentemente anticuerpo GPC3-específico hGC33 con NPs mal-PEG-b-PLGA, entrecruzamos grupo sulfhidrilo libre segmento Fc hGC33 con PEG-b-PLGA funcionalizado maleimida (mal-PEG-b-PLGA) formando enlaces tioéter estables. Conjugación prerrequisito direccionamiento CHC GPC3+. Serie experimentos, incluyendo cambios diámetro y potencial zeta NPs detectados por lente y captación intracelular hGC33-SFB-NP, verificaron direccionamiento hGC33-SFB-NP a HepG2 (GPC3+). Resultados indicaron actividad unión anticuerpo hGC33 no alterada por conjugación.

Detectamos directamente efecto fagocítico HepG2 GPC3+ y Li-7 GPC3− sobre NPs PEG-b-PLGA superficie-modificadas hGC33 por microscopía confocal. Co-cultivo HepG2 y Li-7 con hGC33-cumarina 6-NP: intensidad señal verde HepG2 significativamente mayor que Li-7, indicando más NPs en HepG2. Hallazgo consistente con anticuerpo hGC33 modificado superficie PEG-b-PLGA NP uniéndose específicamente glicano-3 superficie células CHC internalizándose. Eficiencia internalización NPs modificadas hGC33 depende nivel expresión antígeno GPC3 superficie celular.

Usamos MTT estándar medir eficiencia inhibición proliferación células hepatoma. Ambos hGC33-null-NP y hGC33 inhibieron crecimiento línea CHC GPC3+ HepG2, pero no afectaron proliferación Li-7 GPC3− (Fig. 3b). Nivel animal, hGC33-null-NP o hGC33 solos inhibieron crecimiento xenoinjertos Huh-7 y HepG2 en cierta medida, mientras hGC33-SFB-NP causó arresto crecimiento xenoinjertos hepatoma Huh-7 y HepG2 en ratones. Hallazgo que hGC33-null-NP inhibió significativamente hepatoma GPC3+ mostró que efecto inhibitorio NPs PEG-b-PLGA superficie-modificadas hGC33 sobre proliferación CHC depende expresión antígeno GPC3 superficie celular.

GPC3 regula muchas vías patogénesis CHC, incluyendo Wnt y YAP. GPC3 interactúa ligando Wnt pudiendo ser co-receptor Wnt facilitando unión Wnt/Frizzled crecimiento CHC. Examinamos efecto nanofármaco superficie-modificado hGC33 en vía Wnt en hepatoma. Como hGC33 libre, nanofármaco superficie-modificado hGC33 inhibió proliferación hepatoma no solo bloqueando transducción señal inducida Wnt en HepG2 y Huh-7 expresando GPC3, sino inhibiendo transducción señal β-catenina y YAP inducida Wnt3a. Estudios previos muestran expresión YAP regulada por β-catenina nivel transcripcional CHC. En este estudio, hGC33 libre y nanofármaco superficie-modificado inhibieron actividad YAP inducida Wnt3a, indicando Yap/TAZ liberado complejo β-catenina también inicia transducción Wnt clásica. Resultados indican Wnt típica y YAP crosstalk mediante diversos mecanismos. Comparado hGC33-null-NP y hGC33, hGC33-SFB-NP mayor capacidad anti-proliferación y anti-migración in vitro e in vivo. Así, hGC33 no solo determina especificidad células CHC, sino aumenta efecto inhibitorio SFB sobre proliferación/migración CHC bloqueando señales clave crecimiento tumoral: Wnt/β-catenina y Wnt/YAP.

Conclusión

Anticuerpo hGC33 a glicano-3, proteína membrana sobreexpresada en células carcinoma hepatocelular, aumentó unión nanopartículas polímero polietilenglicol-b-PLGA cargadas sorafenib (hGC33-SFB-NP) a glicano-3 en células cancerosas. Administración NPs modificadas anticuerpo inhibió sinérgicamente transducción señal inducida Wnt y vía Ras/Raf/MAPK; células CHC arrestadas fase G0/G1 down-regulando expresión ciclina D1, atenuando migración inhibiendo transición epitelio-mesénquima. hGC33-SFB-NP inhibió crecimiento cáncer hepático in vivo y mejoró supervivencia ratones portadores tumor.

Disponibilidad datos y material

Sí, todos los datos presentados en manuscrito.

Abreviaturas

AKT/PKB:

Proteína quinasa B

c-MET:

HGFR: Receptor factor crecimiento hepatocito

EE%:

Eficiencia encapsulación %

EMT:

Transición epitelio-mesénquima

FTIR:

Espectroscopía infrarroja transformada Fourier

¹H NMR:

Espectroscopía resonancia magnética nuclear ¹H

CHC:

Carcinoma hepatocelular

LC%:

Carga fármaco %

MAPK:

Quinasa activada mitógeno proteína

PDI:

Índice polidispersidad

PI3K:

Fosfoinosítido 3-quinasa

pRAD51:

Fosfo-RAD51

SFB:

Sorafenib

TEM:

Microscopía electrónica transmisión

YAP:

Proteína asociada sí 1