Las vías de apoptosis impulsan la citotoxicidad de nanopartículas de óxido de zinc frescas vs. envejecidas

Resumen

Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NPs) se usan en amplia gama de aplicaciones: industria, productos comerciales y medicina. Numerosos estudios mecanicistas de toxicidad de ZnO NPs se realizaron en NPs prístinas (frescas). Sin embargo, la citotoxicidad inducida por NPs transformadas (envejecidas) y sus mecanismos subyacentes permanecen不明. Aquí observamos la transformación fisicoquímica de ZnO NPs a lo largo del tiempo, seguida de evaluación de citotoxicidad de NPs frescas y envejecidas. Hallamos que NPs frescas de ZnO indujeron mayor nivel de apoptosis que sus contrapartes envejecidas. Según datos de secuenciación de ARN de células híbridas humano-hámster (A_L) tratadas con NPs envejecidas, las vías de señalización p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutatión, ErbB, HIF-1, Oxitocina y Jak-STAT estuvieron enriquecidas, pero no la vía de apoptosis. Resultados de PCR cuantitativa revelaron nivel de ARNm significativamente mayor de IL1B y CD69 en grupos tratados con NPs frescas comparado con NPs de ZnO envejecidas y grupos de cloruro de zinc. Estos resultados indican que la menor citotoxicidad de NPs envejecidas se atribuye parcialmente a su potencia reducida para inducir apoptosis. La regulación transcripcional de múltiples vías de señal activadas por NPs envejecidas puede ayudar a establecer homeostasis celular. En conjunto, nuestros hallazgos resaltan la influencia del proceso de envejecimiento (transformación ambiental) de ZnO NPs en sus toxicidades y consecuencias biológicas.

Introducción

Con el rápido desarrollo de nanotecnología en décadas pasadas, nanopartículas (NPs) se han aplicado en diversos campos: industria, vida diaria y nanomedicina [1, 2]. El Inventario de Productos de Consumo de Nanotecnología (CPI) muestra aumento 30 veces entre 2005 y 2015 en números de nano-productos, incluyendo 762 productos de salud (fitness), 72 alimentos (bebidas) y 23 productos para bebés [2]. La creciente aplicación de NPs en productos de consumo y campos diversos aumentó posibilidad de NPs entrando al ambiente, generando preocupaciones de seguridad sobre sus impactos adversos potenciales. NPs de óxido de zinc (ZnO) están entre NPs más usadas, y su producción anual global alcanza casi 3400 toneladas [3, 4]. Algunas sustancias consideradas biológicamente inertes podrían volverse tóxicas en estado nanoparticulado. Estudios crecientes elucidaron que NPs de ZnO pueden suponer riesgos significativos a células y animales mamíferos induciendo toxicidad significativa [5-7].

Diversas estrategias como recubrimiento, funcionalización de superficie y modificación de estado de oxidación se han usado para atenuar toxicidad potencial de NPs modificando propiedades fisicoquímicas (disolución, aglomeración, perturbación de membranas celulares) [8-11]. Aunque estas modificaciones debilitan efectos tóxicos en cierto grado, el uso de NPs no siempre es seguro, especialmente bajo ciertas condiciones de exposición y ambientes [12-14]. En realidad, muchos tipos de NPs no son estables e inclinados a sufrir "envejecimiento" o "transformación ambiental" tras ser liberados intencional o accidentalmente al ambiente natural [14-17]. En años recientes, se realizaron muchos trabajos para explorar proceso de transformación ambiental de NPs; sin embargo, investigación sobre efectos tóxicos de NPs "transformadas (envejecidas)" es aún muy limitada, y menos aún sus mecanismos tóxicos.

Como representante típico de NPs no persistentes, NPs de ZnO tienen reactividad muy alta y tienden a transformar propiedades fisicoquímicas y estado de ocurrencia tras liberarse al ambiente o ser ingeridas por animales, afectando significativamente sus efectos toxicológicos [17, 18]. Por ejemplo, estudios mostraron que proceso de sulfidación de NPs ZnO cambió carga, hidrofobicidad y estado de agregación, resultando en adsorción de NPs estado sulfuro en saliva, sudor y líquido de lavado broncoalveolar humano. Además, proteínas adsorbidas por NPs ZnO forman corona proteica especial que usualmente afecta su efecto biológico [19]. Fosfatos en soluciones fisiológicas podrían convertir NPs ZnO en ZnHPO₄ metastable y Zn₃(PO₄)₂ en 5-10 h [20]. El proceso de transformación completa de NPs ZnO (≤ 3 μg/mL) en sistema de exposición in vitro a linfocitos T humanos (37 °C, medio RPMI1640 con 10 % FBS por 24 h) se investigó usando espectroscopía de estructura de absorción de rayos X de radiación sincrotrón (XANES) [21]. Estudios sugieren subestimación de riesgos ambientales y de salud de NPs ZnO al evaluar solo efectos biológicos de NPs prístinas (frescas) [22].

Nuestro estudio previo reveló que NPs ZnO envejecidas 40-120 días en agua ultrapura sufren transformación fisicoquímica y se convierten en Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn(OH)₂ y Zn²⁺ [23]. Curiosamente, NPs envejecidas exhibieron menor citotoxicidad que contrapartes frescas [23], pero mecanismos de tal variación son不明. En presente estudio, exploramos razones subyacentes de diferentes citotoxicidades entre NPs frescas y envejecidas. Se aplicaron sistemáticamente NPs ZnO con dos tamaños (20 nm y 90-200 nm). Ensayos de citotoxicidad demostraron que NPs envejecidas indujeron anomalías morfológicas menos pronunciadas y viabilidades celulares relativamente mayores que contrapartes frescas. Datos de secuenciación ARN revelaron que genes apoptóticos se enriquecieron en células tratadas con NPs frescas, mientras que estos genes fueron mucho menos afectados por tratamientos con NPs envejecidas. Además, células expuestas a NPs envejecidas mostraron nivel reducido de proteína Caspasa-3 clivada, indicando mayor potencia de NPs frescas en elicitar apoptosis en células cultivadas. Combinado con hallazgos previos, este estudio sugiere que citotoxicidad disminuida de NPs envejecidas se atribuye a su capacidad atenuada para desencadenar apoptosis celular.

Materiales y métodos

Nanopartículas y reactivos

Nanopolvos de ZnO comerciales (ZnO NPs), con tamaño medio reportado por fabricante 20 nm (pureza 99,5 %, casi esféricos) y 90-200 nm (pureza 99,9 %, morfología irregular), se compraron a Nanostructured & Amorphous Materials (Houston, TX). Salvo indicación contraria, todos los reactivos y químicos se compraron a Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Dispersión, envejecimiento y caracterización de nanopartículas

Suspensiones stock de NPs ZnO (1 mg/mL) se prepararon suspendiendo nanopolvos secos en agua Milli-Q H₂O (Millipore, 18 MΩ cm) y esterilizaron por autoclave (120 °C, 30 min) y almacenaron a 25 °C para período de envejecimiento natural de 0 a 60 días. NPs transformadas naturalmente a 0 y 60 días se designaron como NPs frescas y envejecidas, respectivamente. Para asegurar dispersión adecuada, suspensiones frescas y envejecidas se sonicaron (100 W) 30 min en baño ultrasónico antes de caracterización o incubación con células. Morfología, tamaño de partícula y agregación de NPs frescas y envejecidas se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL JEM-2010, Tokio, Japón). La estructura cristalina se determinó por difracción de rayos X en polvo (XRD, PANalytical B.V., Shanghai, China) comparando con estándares auténticos. Detalles de proceso de envejecimiento natural y caracterización de NPs ZnO se describieron previamente [23].

Cultivo celular y tratamiento con NPs ZnO

Línea celular A_L, células híbridas humano-hámster formadas por fusión de mutante gly2A de ovario de hámster chino (CHO) y fibroblastos humanos, se usó. Estas células híbridas contenían conjunto estándar de cromosomas CHO-K1 y una copia de cromosoma humano 11, cultivadas en medio Ham's F12 (Hyclone, Grand Island, NY) suplementado con suero fetal bovino (8 %, Hyclone), gentamicina (25 g/mL) y glicina (2 × 10⁻⁴ M) a 37 °C en incubadora humidificada 5 % CO₂ [24]. Suspensiones stock de NPs frescas y envejecidas se dispersaron por 30 min ultrasonicación (100 W) para prevenir aglomeración, luego diluidas a concentraciones apropiadas con medio de cultivo para exposición celular. Células mantenidas en medio sin NPs sirvieron como control en cada experimento.

Ensayo para detectar citotoxicidad

Células A_L en fase logarítmica de crecimiento se cultivaron en láminas de vidrio en platos Petri de 35 mm (6 × 10⁴ células/plato) por 24 h antes de estimulación, seguidas de tratamiento con 2 mL medio conteniendo 1, 5, 10, 12, 15, 20 µg/mL NPs frescas o envejecidas por 72 h. Tras tratamiento, imágenes de morfología celular se obtuvieron con microscopio Leica DM4B (Leica, Alemania). ZnCl₂ se incluyó como referencia de iones zinc para comparar citotoxicidad con NPs ZnO.

Kit de conteo celular (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, China) se usó para detectar viabilidad celular. En detalle, células A_L se sembraron en placas de 96 pozos (4 × 10³ células/pozo) con medio de cultivo 24 h y tratadas con medio conteniendo varias concentraciones de ZnCl₂, NPs frescas y envejecidas por 24, 48, 72 h. Para solución de trabajo, volumen de NPs añadido de suspensión stock fue < 5 % del volumen total de medio en cada pozo. Tras tratamiento, medio se aspiró y células se incubaron con 100 µL solución CCK-8 2 h a 37 °C según instrucciones. Luego, absorbancia se registró a 450 nm con lector de fluorescencia Spectra Max M2 (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK). Viabilidad celular se calculó como porcentaje de absorbancia en pozos, cada concentración de NPs normalizada a absorbancia de células control (100 %).

Extracción ARN, transcripción reversa y PCR cuantitativa

Células A_L en fase logarítmica se sembraron en plato Petri 35 mm (6 × 10⁴ células/plato) con medio 24 h. Luego, medio se reemplazó con 2 mL medio conteniendo 12 µg/mL ZnCl₂, NPs frescas y envejecidas por 72 h. Tras tratamiento, medio se aspiró y células se lavaron 3 veces con PBS. Posteriormente, 1 mL reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) se añadió a cada plato para extraer ARN total según instrucciones. Concentración y pureza de ARN total se cuantificaron con espectrofotómetro Q5000 UV-Vis (Quawell, EE. UU.). Tras cuantificación, transcripción reversa se realizó con kit TransGene RT-PCR (TransGene Biotech, Beijing, China) para obtener cDNA de plantilla ARN según protocolos. cDNA resultante se cuantificó con Q5000 UV-Vis y analizó usando SYBR-Green como tinte fluorescente (TransGene Biotech) en sistema Roche RT-PCR (Applied Biosystems) [25].

Gen de mantenimiento Gliceraldehído-3-fosfato Deshidrogenasa (Gapdh) se usó como control interno para evaluar expresión de ARNm Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun y MT1. Resultados se expresaron como ratio de expresión relativa entre gen diana y Gapdh. Secuencias de primers usadas se proveen en Tabla 1.

Análisis de datos de secuenciación ARN

Muestras de ARN total de células A_L de grupo control, grupo tratado con NPs envejecidas y grupo tratado con ZnCl₂ fueron secuenciadas por BangFei Bioscience (Beijing, China). Brevemente, ARN total se extrajo siguiendo protocolos TRIZOL hasta precipitación isopropanol. Luego, muestras ARN se resuspendieron en buffer de extracción antes de secuenciación. Datos crudos de conteo de secuenciación ARN se analizaron con paquete R Deseq2 [Eric1]. Diagrama de Venn generado con paquete R VennDiagram [Eric1.2]. Genes significativamente cambiados usados para análisis de enriquecimiento de vías. Experimentos en tres réplicas independientes. Genes rRNA, mitocondriales y genes detectados < 40 pb se excluyeron.

Datos de secuenciación ARN, series de referencia GSE97852, GSE60159, GSE39444, se obtuvieron de Gene Expression Omnibus [Eric 2-4]. Gráfico de Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos Génicos generado con R (v3.6.2) usando paquete fgsea [Eric 5]. Genes de apoptosis con cambio significativo 1,5 veces y valor p < 0,05 usados para análisis posterior. Mapa de calor con árbol génico generado con paquete R "ComplexHeatmap" [Eric 6]. Enlace promedio usado como método de clustering, distancia euclidiana como medida. Análisis de enriquecimiento de vías precedido usando STRING2.0 [Eric 7].

Western Blotting

Células A_L en fase logarítmica se sembraron en plato Petri 60 mm (1,5 × 10⁵ células/plato) con medio 24 h. Luego, medio se reemplazó con 4 mL medio conteniendo 12 µg/mL NPs frescas o envejecidas por 24 h. Al final, medio se aspiró, células se lavaron 3 veces con PBS y lisis en hielo con buffer RIPA (Beyotime, China) para recoger proteínas celulares. Cantidades iguales de proteínas se separaron en geles SDS-PAGE 12 % y transfirieron a membrana PVDF (Roche, Suiza). Brevemente, tras 2 h bloqueo con leche desnatada 5 % en TBST a 25 °C, membranas se incubaron con anticuerpo primario a diluciones apropiadas (según protocolo) a 4 °C overnight, seguido de incubación con anticuerpos secundarios HRP-conjugados (1:5000, Promega, Madison, EE. UU.) 2 h a 25 °C. Finalmente, inmunodetección se detectó con quimioluminiscencia mejorada (ECL) (BOSTER, China). Anticuerpos primarios anti-pro/Caspasa-3 clivada y anti-Actina se compraron a Cell Signaling Technology e ImmunoWay.

Estadísticas

Análisis estadístico se compiló sobre medias de resultados de al menos tres experimentos independientes. Todos los datos presentados como medias ± desviación estándar (DE) y comparados con ANOVA de un factor. En todos los gráficos valores p < 0,05 mostrados como * y considerados significativos.

Resultados

Caracterización de NPs ZnO

Para determinar diferencias en características fisicoquímicas entre NPs frescas y envejecidas, observamos morfología por TEM (Fig. 1A). Resultados indicaron que NPs frescas 20 nm eran cristales casi esféricos y NPs 90-200 nm cristales irregulares tipo varilla/cúbicos. Tamaño de partícula individual coincidió con fabricante. Obviamente, ambas NPs 20 nm y 90-200 nm tendieron a agregar en agua ultrapura. Además, independientemente de forma y tamaño originales, microestructura de ambas NPs cambió dramáticamente de estructura cristalina clara a estado amorfo o tipo lámina/aguja tras envejecer 60 días. Además, naturaleza cristalina y pureza de fase de NPs frescas y envejecidas se determinaron por XRD con radiación Cu Kα (λ = 0,15418 nm) a 25 °C, Fig. 1B. Patrón XRD de NPs frescas indicó muestras compuestas de estructura wurtzita cristalina y ningún pico de impureza característico, sugiriendo alta calidad. Para NPs envejecidas, patrón XRD exhibió neoformación de Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ (tarjeta 00-011-0287) y Zn(OH)₂ (tarjeta 00-003-0888) fases sólidas, indicando transformación química de NPs ZnO (20 y 90-200 nm) durante envejecimiento.

Características fisicoquímicas de NPs ZnO frescas y envejecidas. A Micrografías representativas de NPs frescas y envejecidas (100 μg/mL, 20 y 90-200 nm) en agua Milli-Q usando TEM baja resolución, B Patrones XRD de NPs frescas, envejecidas, ZnO, Zn(OH)₂ y Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ referencias en forma seca

Observación morfológica de células A _L expuestas a NPs ZnO frescas y envejecidas

Tratamiento con NPs resulta en cambio notable en forma celular in vitro [26]. Por tanto, células A_L expuestas a NPs frescas o envejecidas a 10 y 15 µg/mL por 72 h se examinaron bajo microscopio estereoscópico. Como en Fig. 2, morfología en grupo control permaneció normal. Células adhirieron bien, la mayoría en 2 h. La mayoría eran fusiformes o poligonales, con pocas células dividiéndose mostrando citoplasma más transparente y mejor dispersión. Tratamiento con 12 μg/mL NPs frescas (20 nm y 90-200 nm) por 72 h cambió morfología significativamente. Aunque la mayoría adhirieron en 3-5 h, no se extendieron bien, algunas se redondearon y perdieron forma poligonal. Al aumentar concentración a 15 μg/mL, células tratadas atrofiaron y no adhirieron, sugiriendo viabilidad significativamente menor que 10 μg/mL. Resultados indicaron LC100 para NPs frescas probablemente < 15 μg/mL por tratamiento 72 h. En contraste, morfología en grupos NPs envejecidas 20 nm y 90-200 nm (15 μg/mL) no se afectó significativamente, mayoría de células supervivientes adhirieron y extendieron, con menos de la mitad muertas, revelando que NPs envejecidas son mucho menos citotóxicas que frescas.

Cambios de morfología en células A_L tras exposición a NPs ZnO frescas o envejecidas 72 h en medio Ham's F12 suplementado, células no expuestas como control. Morfología observada con microscopio óptico 10×

NPs ZnO envejecidas indujeron menor citotoxicidad que NPs frescas

Para investigar diferencia en citotoxicidad entre NPs frescas y envejecidas, examinamos viabilidad con kits CCK-8. Como en Fig. 3, incubación células A_L con dosis gradientes de NPs frescas y envejecidas (0-20 μg/mL, 20 nm y 90-200 nm) por 24, 48, 72 h mostró disminución dependiente de dosis en viabilidad. No citotoxicidad obvia con NPs ≤ 10 μg/mL. Al elevar dosis a 12 y 15 μg/mL, viabilidad mostró disminución dependiente de tiempo. Obviamente, viabilidad en grupos NPs envejecidas fue significativamente mayor que en grupos NPs frescas. Además, tratamiento ZnCl₂ también comprometió viabilidad de forma dependiente de dosis y tiempo, mientras citotoxicidad de ZnCl₂ fue mucho menor que ambas NPs frescas y envejecidas.

Viabilidad celular inducida por NPs frescas y envejecidas en células A_L. Células incubadas con varias concentraciones de NPs frescas y envejecidas (20 y 90-200 nm) por 24 h (A), 48 h (B) y 72 h (C). D Células A_L expuestas a varias concentraciones de ZnCl₂ por diferentes tiempos. Datos ≥ 3 experimentos independientes, media ± DE, *p < 0,05

Tratamiento con NPs ZnO frescas activó vías de apoptosis y up-reguló expresión de genes apoptóticos

Para revelar mecanismos de menor citotoxicidad de NPs envejecidas, analizamos datos de secuenciación ARN de NPs frescas y envejecidas. Como en Fig. 4A, B, tras tratamiento con NPs frescas, vía de apoptosis se activó en células Jurkat (p = 0,017) y HMDM (p = 0,041). Genes de apoptosis: ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38, ISG20 enriquecidos significativamente en células Jurkat tratadas con NPs frescas. Genes: CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D, SPTAN1 enriquecidos en células HMDM tratadas con NPs frescas (Fig. 4C, D). Como Jurkat (linfocitos T periféricos) y HMDM (macrófagos derivados monocitos humanos) son diferentes, forma de desencadenar apoptosis puede diferir. En suma, resultados mostraron que exposición a NPs frescas activa diferentes vías de apoptosis en varios tipos celulares.

Vía de apoptosis enriquecida en datos RNA-seq de células Jurkat y HMDM tratadas con NPs frescas. Puntuación de enriquecimiento de genes expresados significativamente de vía apoptosis en células Jurkat (A) y HMDM (B). Mapa de calor de expresión génica apoptótica en células Jurkat (C) y HMDM (D) y sus controles

NPs ZnO envejecidas no up-regularon expresión de genes apoptóticos como NPs frescas

Nuestros datos de secuenciación ARN de células A_L tratadas con NPs envejecidas mostraron que vías p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutatión, ErbB, HIF-1, Oxitocina y Jak-STAT estuvieron enriquecidas (Fig. 5A). Genes de apoptosis enriquecidos en Jurkat y HMDM no se afectaron significativamente en células tratadas con NPs envejecidas (Fig. 5B). Para confirmar, probamos expresión de genes relacionados por PCR tiempo real. Hallamos que algunos genes apoptóticos: BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38, IL1β fueron indetectables en células A_L tratadas con NPs envejecidas (datos no mostrados), probablemente porque la mayoría se expresan en células inmunes. Otros genes apoptóticos up-regulados (IL1α, IL1β, CD59) en grupos NPs frescas no cambiaron significativamente en expresión por tratamiento NPs envejecidas. Mientras MT1 (control positivo) aumentó significativamente, expresión de Caspase 3 no cambió significativamente (Fig. 5C). Estos datos sugirieron que NPs envejecidas, a diferencia de frescas, son menos potentes activando genes de vías de apoptosis en células A_L.

Vía de apoptosis no enriquecida en datos RNA-seq de células A_L tratadas con NPs envejecidas. (A) Análisis ontología génica de vías enriquecidas de células A_L tratadas con NPs envejecidas. (B) Mapa de calor de expresión génica apoptótica de células A_L tratadas con NPs envejecidas y control. (C) Expresión de genes apoptóticos seleccionados y genes control (MT1) en células A_L tratadas con NPs frescas y envejecidas

NPs frescas pero no envejecidas aumentaron nivel de proteína Caspasa 3 activada

Detección de expresión génica Caspase 3 sola no indica directamente activación de vía apoptosis. Para analizar si tratamiento NPs cambió niveles de proteínas apoptóticas, expresión de proteína Caspasa 3 clivada, biomarcador común para indicar activación de apoptosis [27], se examinó por Western blotting. Como en Fig. 6, vs grupo control, NPs frescas (20 nm) aumentaron nivel celular de Caspasa 3 clivada 1,31 ± 0,023 veces, significativamente mayor que grupo NPs envejecidas 20 nm (1,12 ± 0,039 veces). Al aumentar tamaño NPs frescas a 90-200 nm, expresión de Caspasa 3 clivada inducida por NPs frescas aumentó 1,46 ± 0,078 veces, significativamente mayor que NPs envejecidas (1,07 ± 0,075 veces). Estos datos ilustran mayor potencia de NPs frescas induciendo apoptosis vs contrapartes envejecidas.

Niveles apoptóticos en células A_L incubadas con NPs frescas y envejecidas (20 y 90-200 nm). Western Blotting (A) y cuantificación (B) de niveles Caspasa 3 clivada con 12 μg/mL NPs frescas y envejecidas (20 y 90-200 nm) 72 h. Datos ≥ 3 experimentos, media ± DE, *p < 0,05

Discusión

NPs ZnO se transforman fisicoquímicamente en Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ con liberación de Zn²⁺ durante envejecimiento natural [23, 28]. Sin embargo, citotoxicidad inducida por NPs transformadas (envejecidas) y mecanismos subyacentes permanecen不明. Aquí, para revelar mecanismo de citotoxicidad diversa entre NPs frescas y envejecidas, se realizó análisis de secuenciación ARN y prueba RT-PCR. También, Western blotting examinó nivel de proteína Caspasa 3, ejecutor clave en apoptosis.

Nuestros datos mostraron NPs envejecidas indujeron mucha menos citotoxicidad que NPs frescas en células A_L. LC₁₀₀ de ambas NPs frescas (90-200 nm y 20 nm) fue < 15 μg/mL (Fig. 3), consistente con hallazgos previos que LC₁₀₀ de NPs ZnO 19-36 nm a NIH-3T3 o MSTO es ~15 μg/mL [29]. Confirmamos que transformaciones ambientales de propiedades fisicoquímicas en NPs alteran dramáticamente su toxicidad. Se reportó que sulfidación de NPs ZnO cambia carga, hidrofobicidad y agregación, resultando en adsorción de NPs estado sulfuro en saliva, sudor y líquido broncoalveolar. Proteínas adsorbidas forman corona proteica que afecta efecto biológico [19]. Fosfatos en soluciones fisiológicas (saliva) convierten NPs ZnO en ZnHPO₄ metastable y Zn₃(PO₄)₂ en 5-10 h con citotoxicidad a células epiteliales digestivas [20]. Ivask et al. probaron transformación completa de NPs ZnO (≤ 3 μg/mL) en sistema in vitro a linfocitos T humanos (37 °C, RPMI1640 10 % FBS 24 h) usando XANES. Espectro y citotoxicidad de productos consistentes con ZnSO₄ [21]. Nuestros resultados revelaron toxicidad dependiente de dosis y tiempo de ZnCl₂ a células A_L, donde citotoxicidad es mucho menor que NPs frescas y envejecidas (Fig. 3). Esto explica que citotoxicidad de NPs frescas no se atribuye totalmente a Zn²⁺ liberado [30].

Nuestro estudio previo también mostró NPs envejecidas exhiben mayor potencia eliciting ROS (especies reactivas oxígeno), así como capacidad atenuada matando células vs NPs frescas [23]. Razonamos que menor citotoxicidad por NPs envejecidas podría ser más tolerable en células mamíferas. Estudio presente de datos RNA-seq ilustró que genes apoptóticos up-regulados en células tratadas con NPs frescas, fueron mucho menos afectados en grupos NPs envejecidas. IL1α e IL1β son miembros familia citocina interleucina 1. Liberación de IL1α e IL1β activa apoptosis dependiente Caspasa 8 parcialmente [31]. CD69 codifica miembro superfamilia lectina calcio-dependiente receptores transmembrana tipo II. Aumento expresión CD69 asociado con aumento expresión anexina V y CD95 (Fas) apoptosis [32]. JUN es subunidad factor transcripción AP-1. Aumento actividad JUN proteolíticamente cleava alfa-fodrina, sustrato enzima convertidora interleucina 1beta (ICE), y familia proteasas cisteína CED-3, causando muerte celular programada [33]. Aumento expresión estos genes apoptóticos revela NPs frescas desencadenan apoptosis de varias formas. Tras elevación expresión génica apoptótica, procesos apoptosis son ejecutados por proteínas apoptóticas (Fig. 7). Caspasa 3 es proteasa central para varios escenarios apoptosis; clivaje de esta proteína necesario para activar vías extrínsecas e intrínsecas [34, 35]. Por tanto, detección de caspasa 3 clivada es método común para identificar apoptosis inducida por variedad de señales [36]. Nuestros datos Western blotting revelaron que, para ambos 20 nm y 90-200 nm NPs, exposición subletal no alteró nivel Pro caspasa 3 en todos los grupos. En contraste, caspasa 3 clivada elevó significativamente por NPs frescas, mientras NPs envejecidas mostraron pocos (si acaso) efectos en caspasa 3 clivada (Fig. 6). Combinado con análisis expresión ARN, resultados elucidaron claramente mayor potencia de NPs frescas induciendo apoptosis.

Modelo para NPs frescas pero no envejecidas inducen apoptosis dependiente Caspasa 8 y Caspasa 3. Aumento expresión génica CD69 activa Fas y anexina V apoptosis en células mamíferas expuestas a NPs frescas. Aumento expresión IL1α e IL1β activa parcialmente apoptosis dependiente Caspasa 8. Esto causa activación Caspasa 3 e induce apoptosis. Todos estos cambios en ARNm y proteína no detectables en células expuestas a NPs envejecidas

Conclusiones

En presente estudio, transformación fisicoquímica natural de NPs ZnO en agua ultrapura se confirmó, y variaciones en citotoxicidad inducida por NPs frescas y envejecidas se investigaron. Nos centramos en datos secuenciación ARN de nuestras células A_L tratadas con NPs envejecidas y NPs frescas de base de datos. Comparamos vías de señalización específicamente enriquecidas en grupo NPs envejecidas, diferentes de grupos NPs frescas o ZnCl₂. Nuestros datos indicaron que menor citotoxicidad de NPs envejecidas está estrechamente relacionada con su capacidad atenuada para inducir apoptosis, mientras regulación transcripcional de múltiples vías activadas por NPs promueve establecimiento de homeostasis celular en células mamíferas.