Preparación y propiedades antibiofilm de películas compuestas de óxido de zinc / alúmina anódica porosa

Resumen

Las películas de PAA (alúmina anódica porosa) se prepararon mediante oxidación anódica en dos etapas después de diferentes tiempos, y luego se prepararon las películas compuestas de ZnO / PAA mediante el método sol-gel en su superficie. Mientras tanto, las películas compuestas de ZnO / PAA se caracterizaron por difracción de rayos X (XRD), analizador térmico termogravimétrico / diferencial (TG / DTA), espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier (FT-IR), microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión. (TEM), difracción de electrones de área seleccionada (SAED) y ángulo de contacto con el agua (CA). Las propiedades antibiofilm de las películas compuestas de ZnO / PAA en Shewanella putrefaciens se midieron simultáneamente. Los resultados muestran que las micromorfologías de las películas compuestas de PAA y ZnO / PAA se ven afectadas por el segundo tiempo de anodización. El ZnO es una estructura de wurtzita hexagonal y las partículas de ZnO con un diámetro de 10 a 30 nm se adhieren a las superficies internas o externas del PAA. Después de ser modificadas por Si69, las películas de ZnO se traducen de hidrofilia a hidrofobicidad. La película de ZnO / PAA con las propiedades óptimas de antibiofilm se prepara sobre la superficie de PAA mediante anodización en dos pasos durante 40 min. La adhesión de Shewanella putrefaciens está restringido por su superhidrofobicidad, y el crecimiento de bacterias de biopelícula es inhibido por sus abundantes partículas de ZnO.

Antecedentes

Como sabemos, las bacterias pueden adherirse a superficies sólidas y formar una biopelícula resbaladiza en entornos apropiados [1]. Por lo general, las biopelículas de bacterias se adhieren firmemente a las superficies de materiales, como acero inoxidable [2], caucho [3], vidrio [4] y poliestireno [5]. La biopelícula daría lugar a la corrosión del equipo [6] y la contaminación de los alimentos [7], lo que provocaría enormes pérdidas económicas. Muchos estudios han indicado que la adhesión de la biopelícula se ve afectada por las propiedades de la superficie del material, como la rugosidad [8,9,10,11], la microestructura [12, 13], la hidrofilia [14,15,16,17] y los componentes antibióticos. [18,19,20]. Bohinc y col. [10] señaló que la adherencia bacteriana aumentaría con la rugosidad de la superficie del vidrio. Singh y col. [12] demostró que una alta rugosidad de la superficie puede mejorar la adsorción de proteínas y acelerar la adhesión bacteriana y la formación de biopelículas. Bonsaglia et al. encontró que Listeria monocytogenes adherido a superficies hidrófilas (p. ej., acero inoxidable y vidrio) mejor que a superficies hidrófobas (p. ej., poliestireno) [14]. Otros estudios también demostraron que la superficie hidrófoba no era buena para la adhesión de biopelículas [16, 17]. Algunos estudios han demostrado que los componentes de los antibióticos podrían inhibir la formación de biopelículas [18,19,20]. Trescientos cuatro superficies de acero inoxidable que contienen Cu tienen excelentes propiedades antibacterianas y antibiofilm, aprovechando la actividad antimicrobiana del elemento Cu [18]. En resumen, las propiedades de la superficie son cruciales para las propiedades antibiofilm de los materiales.

Los materiales de aluminio se han utilizado ampliamente, y la alúmina anódica porosa (PAA) ha atraído más atención en los campos de la función eléctrica de la luz, la función catalítica y la función de detección en los últimos años [21,22,23,24], y su actividad antimicrobiana fue informó. Ferraz y col. [24] informó que el PAA puede inducir la activación adherente de monocitos / macrófagos debido a su fase de matriz y nanoporosidad.

Además, las películas delgadas de óxido de zinc (ZnO) se han estudiado como un excelente material antibacteriano y antifúngico. La adherencia de Pseudomonas aeruginosa a películas de ZnO con estructuras superficiales de nanobarras fue más débil que la de vidrio y ZnO pulverizado, y más P. aeruginosa mueren en las películas de ZnO [25]. Mientras tanto, una investigación señaló que las superficies recubiertas de ZnO restringían drásticamente la formación de biopelículas, y la generación de radicales hidroxilo desempeñaba un papel clave en la actividad antibiofilm, pero no en la existencia de iones de zinc [26]. Además, las películas compuestas de ZnO se pueden utilizar en muchos campos para restringir la formación de biopelículas y tendrán buenas perspectivas de aplicación en la conservación de productos acuáticos [27]. El ZnO es hidrófilo, mientras que las películas hidrófobas son buenas para restringir la adhesión de la biopelícula. Por tanto, es necesario mejorar las propiedades hidrofóbicas de la película de ZnO.

Los productos acuáticos son muy perecederos debido a su deterioro microbiano [28]. En condiciones de almacenamiento aeróbico, Pseudomonas spp. y Shewanella putrefaciens se conocen como organismos de descomposición dominantes [29]. Shewanella putrefaciens tiene naturaleza psicrotrófica y puede reducir la trimetilamina- N -óxido a trimetilamina [30]. Entonces, Shewanella putrefaciens se utilizará como bacteria indicadora en este documento.

Las microestructuras de las películas de ZnO serían diferentes debido a su base de PAA, y luego las propiedades antibiofilm se verían afectadas. En este trabajo se prepararon películas de ZnO sobre PAA con diferente morfología y se modificaron para mejorar la hidrofobicidad. Las propiedades antibiofilm de Shewanella putrefaciens de las películas compuestas de ZnO / PAA. Los resultados proporcionan valor potencial para las aplicaciones en envasado de alimentos, equipos de procesamiento de alimentos y otros campos de materiales funcionales antibacterianos.

Materiales y métodos

Materiales

Todos los reactivos utilizados en este estudio fueron analíticamente puros. El agua desionizada y estéril se utilizó para preparar soluciones con conductividad inferior a 0,5 mS / cm. Shewanella putrefaciens ATCC8071 se adquirió en American Type Culture Collection. Se adquirieron láminas de aluminio de 0,3 mm de espesor con una pureza de aluminio superior al 99,99% de Shengshida Metal materials Co., Ltd. (China).

Preparación de películas compuestas de ZnO / PAA

Preparación de películas de alúmina anódica porosa (PAA)

Se cortó una hoja de aluminio de alta pureza en una dimensión pequeña de 10 × 30 mm ² y se pulió con pasta de pulir de sílice de 50 nm mediante un pulidor (WV80, Positec Machinery Co., Ltd., China) y se desengrasó ultrasónicamente en acetona a 53 kHz, 280 W durante 15 min (SK8210HP, Kudos Ultrasonic Instruments Co.Ltd. ., Shanghái). Luego, las láminas se lavaron dos veces con etanol y agua, respectivamente. Las hojas de aluminio pretratadas se utilizaron como ánodo, la hoja de grafito de áreas iguales como cátodo y la solución de ácido oxálico 0,3 mol / L como electrolito. La primera anodización fue en las condiciones de 30 ° C y 40 V durante 90 min. Después de eso, las láminas de aluminio se sumergieron en la solución mixta de 6.0% en peso de H ₃ PO ₄ y 1,8% en peso de H ₂ CrO ₄ a 60 ° C durante 4 h para eliminar las capas de alúmina. A continuación, se realizó la segunda anodización en las mismas condiciones pero durante 0, 40, 60 y 80 min, respectivamente. Se obtuvieron las películas de alúmina anódica porosa (PAA) con un modelo de puerto diferente.

Preparación de películas compuestas de ZnO / PAA

En primer lugar, el volumen igual de 0,02 mol / L de solución de etanol de acetato de zinc y 0,04 mol / L de solución de etanol de NaOH se mezclaron con agitación rápida a 70 ° C durante 5 min, y luego se sumergieron las películas de PAA (láminas de aluminio) en la solución mixta. bajo un grado de vacío de - 0.085 MPa. Posteriormente, la solución se calentó a ebullición. Después de que se convirtiera en un sol azul fino, se sacaron las hojas de aluminio y se enjuagaron con agua desionizada. Luego, las muestras se secaron al vacío a - 0.085 MPa, 80 ° C durante 6 h, y las películas compuestas de ZnO / PAA se prepararon después de calcinadas a 480 ° C durante 2 h en atmósfera de aire. Los polvos de óxido de zinc se prepararon simultáneamente. Finalmente, las películas compuestas de ZnO / PAA y los polvos se modificaron con una solución de etanol de Si69 al 1,0% en peso a 65 ° C durante 2 hy luego se secaron al vacío a - 0,085 MPa, 40 ° C durante 12 h.

Caracterización de películas compuestas de ZnO / PAA

La difracción de rayos X de los polvos de óxido de zinc se realizó utilizando un difractómetro de rayos X en polvo (Rigaku Ultima IV, Rigaku, Japón) en un paso de 0,02 ° y 2 θ rango de 10 ° –80 ° con radiación CuKa de 40 kV, 50 mA. Los cambios térmicos y la pérdida de peso de las muestras se analizaron mediante un analizador térmico termogravimétrico / diferencial (TG / DTA, Perkin Elmer Diamond). Los espectros de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) se registraron con un espectrómetro Scimitar 2000 Near FT-IR (Agilent, estadounidense) en el rango de 4000 a 400 cm ⁻¹ . Las micrografías de superficie de las películas de PAA y las películas compuestas de ZnO / PAA se obtuvieron mediante microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FESEM, S-4800, Hitachi, Japón). Las morfologías de nanopartículas extraídas de las películas compuestas de ZnO / PAA se miden mediante microscopía electrónica de transmisión de emisión de campo (FETEM, Jem-2100F, JEOL, Japón) y la difracción electrónica de área seleccionada (SAED, Jem-2100F, EOL, Japón) del Se examinaron muestras. Los ángulos de contacto con el agua (CA) de las películas compuestas (antes / después de la modificación) se midieron mediante el método de gota sésil en varias posiciones diferentes en cada superficie de muestra utilizando gotas de agua desionizada de 3,0 μL (SL200B, EE. UU.).

Las propiedades de antibiofilm de las películas compuestas de ZnO / PAA

Cultivo de Shewanella putrefaciens Biopelícula

La suspensión de bacterias de Shewanella putrefaciens activadores secundarios (OD ₅₉₅ ≈ 0.5) y agua de peptona alcalina (APW) de NaCl al 3% (m / v) se mezclaron con uniformidad en una proporción de 1:200 ( v / v ). Se sumergieron películas compuestas de ZnO / PAA (0,5 x 0,5 cm) en los inóculos diluidos de 3 mL y se incubaron a 28 ° C durante un cierto tiempo. En esta condición, Shewanella putrefaciens creció bien y mostró una fuerte capacidad proliferativa.

Ensayo de adhesión de Shewanella putrefaciens Biopelículas en películas compuestas de ZnO / PAA

Después de cultivar en suspensión bacteriana de Shewanella putrefaciens Durante un tiempo, las películas compuestas de ZnO / PAA con biofilm se transfirieron a otros tubos de centrífuga estériles y se lavaron tres veces con 1 mL de solución de NaCl estéril al 0,85% (m / v) para eliminar las bacterias libres. La biopelícula se tiñó con 1 ml de p / p al 0,2%. violeta cristal durante 15 min a temperatura ambiente y se lavó tres veces con 1 ml de solución de NaCl estéril al 0,85% (m / v) para eliminar el violeta cristal redundante. Luego, las biopelículas teñidas se eliminaron ultrasónicamente en un 33% ( v / v ) ácido acético de 200 μL a 53 kHz, 280 W durante 10 min. El OD ₅₉₅ (densidad óptica a 595 nm) de la solución anterior se registró mediante un lector de microplacas VICTOR ™ X3 (Perkin Elmer, América) en las placas de microtitulación de 96 pocillos. Los resultados se mostraron como "promedios ± desviaciones estándar" del experimento tres veces paralelo.

Ensayo de recuento bacteriano total de Shewanella putrefaciens Biopelícula en películas compuestas de ZnO / PAA

Las películas compuestas de ZnO / PAA con biopelícula se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4; 137 mmol / L de NaCl, 2,7 mmol / L de KCl, 10 mmol / L de Na ₂ HPO ₄ y 1,8 mmol / L KH ₂ PO ₄ ) para desalojar las bacterias flotantes, y las biopelículas teñidas se separaron por ultrasonidos en 10 ml de PBS estéril a 53 KHz, 280 W durante 10 min. Posteriormente, se midió el recuento bacteriano total en las biopelículas mediante el método de recuento en placa. Con el experimento tres veces paralelo, los resultados se mostraron como "promedios ± desviaciones estándar" y se trazó la curva de crecimiento de colonias de las bacterias del biofilm.

La medición de micrografías de Shewanella putrefaciens Biofilms

Después de la eliminación de las bacterias flotantes, las películas compuestas de ZnO / PAA con biopelícula se sumergieron en 2,5% ( w / v ) glutaraldehído a 4 ° C durante 4 h. Posteriormente, las muestras se deshidrataron cada 30 min con 50, 70, 80 y 90% ( v / v ) etanol, respectivamente. Después de sumergirlas en alcohol etílico absoluto durante 1 h, las muestras se secaron al aire de forma natural en un banco limpio. Las micrografías de la superficie de las muestras fueron obtenidas por FESEM (S-4800, Hitachi, Japón) después de un recubrimiento catódico de oro a 3 kV durante 40 s.

La medición CLSM de Shewanella putrefaciens Biofilms

Las películas compuestas de ZnO / PAA con biopelícula se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH =7,4) tres veces para eliminar las bacterias flotantes, y las muestras se tiñeron en la oscuridad durante 15 min en la solución mixta al 0,01% en peso. naranja de acridina (AO, Sigma, América) y yoduro de propidio al 0,1% en peso (PI, Sigma, América). Después de eso, las muestras se lavaron tres veces con PBS para desalojar la solución de teñido redundante y se desalojó la humedad excesiva. Se dejaron caer diez microlitros de agentes de sellado para extinción de fluorescencia (Biosharp BL701A, China) sobre las biopelículas y las muestras se almacenaron a 4ºC sin luz. Las proporciones de células vivas y muertas de las biopelículas se observaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, TCS-SP5 II, Alemania Leica Instrument Co., Ltd.) [31, 32].

Resultados y discusión

Caracterización de películas de ZnO

Caracterización XRD de los polvos de ZnO preparados mediante el proceso Sol-gel

Las propiedades antibacterianas y antibiofilm del óxido de zinc se ven afectadas por su estructura cristalina [33, 34]. La Figura 1 muestra que la estructura cristalina de las muestras se transforma después de la calcinación. Antes de las calcinaciones, las muestras están contenidas en la estructura hexagonal de wurtzita de ZnO. Los picos de difracción a 31,70 °, 34,52 °, 36,31 °, 47,68 °, 56,82 °, 62,92 ° y 67,92 ° de 2 θ corresponden a (100), (002), (101), (102), (110), (103) y (112) planos cristalinos de óxido de zinc (PDF n. ° 36-1451, a = b =3.250 y c =5,207), respectivamente. Los picos de difracción amplios indican baja cristalinidad y pequeñas partículas de ZnO. Mientras tanto, picos menos impuros revelan el intermedio en la muestra. Después de calcinado a 230 ° C, los picos impuros desaparecen y el ruido medido disminuye, pero el ancho de los picos de difracción es invariable. Significa que el intermedio desaparece y aumenta el grado del cristal. Con el aumento de la temperatura de calcinación, los picos de difracción de ZnO se vuelven más nítidos, lo que indica que la cristalinidad aumenta y las partículas de cristal crecen.

Patrones XRD de los polvos de óxido de zinc calcinados a diferentes temperaturas

Solo agua ligada de Zn (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O se produce en la solución etanólica de Zn (CH ₃ COO) ₂ y la hidrolización de CH ₃ COO ^- está inhibido. En primer lugar, el Zn (CH ₃ COO) ₂ se hidroliza y produce el producto intermedio.

4Zn (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O → Zn ₄ O (CH ₃ COO) ₆ + 2CH ₃ COOH + 3H ₂ O (1)

En el proceso de calentamiento, el collosol es facilitado por la solución etanólica de NaOH y el efecto espacial estérico del CH ₃ COO ^- es de gran importancia para la estabilidad del collosol de ZnO. Mientras tanto, la reacción neutra del CH ₃ Ocurre COOH con NaOH.

5Zn ₄ O (CH ₃ COO) ₆ + 22NaOH + 13H ₂ O → 4Zn ₅ (OH) ₈ (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O + 22CH ₃ COONa (2)

CH ₃ COOH + NaOH → CH ₃ COONa + H ₂ O (3)

Spanhel y Anderson [35] indicaron que los alcogeles de óxido de zinc se forman a partir de granos de ZnO a través de la agregación y el crecimiento de Ostwald (envejecimiento). Luego, el intermedio de Zn ₅ (OH) ₈ (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O se calienta y se descompone en la fase ZnO [36, 37]. Por lo tanto, la estructura hexagonal de wurtzita de ZnO es la base de la gelatina seca antes de las calcinaciones.

Zn ₅ (OH) ₈ (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O → 5ZnO + 2CH ₃ COOH + 5H ₂ O (4)

Hosono y col. [37] han confirmado este mecanismo de reacción. La solución etanólica de Zn (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O convirtió productos coloidales durante el calentamiento a 60 ° C, y los resultados de XRD muestran que el producto seco de gelatina es una mezcla de ZnO cristalino y Zn5 (OH) ₈ (CH ₃ COO) ₂ · 2H ₂ O. Después de calentar a reflujo durante 48 h, las partículas se transforman en la wurtzita ZnO.

Análisis TG / DTA

El resultado de TG / DTA de la gelatina de óxido de zinc se muestra en la Fig. 2, y la curva de TG podría dividirse en tres etapas. En la primera etapa, la pérdida de masa es del 68,6% desde la temperatura ambiente a 100 ° C y existía un pico endotérmico a 62 ° C. Corresponde a la pérdida de disolvente de etanol y agua en gelatina de óxido de zinc. En la segunda etapa, la pérdida de masa es solo del 3.8% de 100 a 400 ° C. Los resultados de XRD muestran que la impureza desapareció, la cristalinidad aumentada y el crecimiento de partículas de cristal después de calcinadas a 230, 280 y 360 ° C, respectivamente. Una pequeña cantidad de pérdida de masa puede ser la pérdida de agua de los poros y la transición de la impureza. De 400 a 850 ° C, no hay pérdida de masa ni pico endotérmico, lo que indica que no hay transformación cristalina en esta etapa. Mientras tanto, el resultado de XRD muestra que el cristal crece después de la calcinación a 480 ° C. Los resultados de TG / DTA son consistentes con los resultados de XRD.

Gráficos TG / DTA para gelatina de óxido de zinc

Caracterización FT-IR de las películas de óxido de zinc sin modificar / modificadas

La Figura 3 muestra los espectros FT-IR de las películas de ZnO modificadas hidrófobas y sin modificar. Los picos anchos a 3600–3300 cm ⁻¹ se atribuyen a la vibración de estiramiento de −OH, y el pico a 1651 cm ⁻¹ se atribuye a la vibración de flexión de –OH, respectivamente, lo que indica el agua absorbida y el agua capilar en las muestras [38]. Los picos a 2360 y 2328 cm ⁻¹ se atribuyen al dióxido de carbono en el aire. Los picos a 2943 y 2864 cm ⁻¹ se deben a vibraciones de estiramiento asimétricas y simétricas de −CH ₂ , respectivamente. El pico más fuerte a 1475 cm ⁻¹ se atribuye a la vibración de flexión en el plano o vibración de tijera de −CH ₂ grupos [39], y el pico a 895 cm ⁻¹ se atribuye a las vibraciones de estiramiento de los grupos Si-O [40]. Los picos a aproximadamente 440 y 414 cm ⁻¹ se atribuyen al marco de vibración de los grupos Zn-O del ZnO no modificado / modificado [41]. Los resultados indican que la modificación hace que los enlaces –S – S– de Si69 se rompan, y se injerta trietoxisililpropilo en las muestras, por lo que aumentan las propiedades hidrofóbicas de las películas de ZnO. Wang [42] informó que la dispersión de nano-ZnO podría mejorarse mediante la modificación in situ de Si69 y Si69 injertados en la superficie de las partículas de nano-ZnO a través de la reacción química. Esto es consistente con los resultados de nuestro análisis.

Espectros FT-IR de las películas de óxido de zinc sin modificar / modificadas

Análisis de micromorfologías de películas PAA

Las morfologías de las películas de PAA se ven afectadas por el segundo tiempo de oxidación anodizada. Como se muestra en la Fig. 4, después de quitar las capas de alúmina de la primera anodización, la película de PAA es un marco de panal hexagonal serrado con nanoporos de 5 a 10 nm (Fig. 4a). Después de la anodización en dos pasos durante 40 min, los nanoporos se transforman en marcos de concha multicapa (Fig. 4b). Después de la anodización en dos pasos durante 60 min, los marcos de la carcasa multicapa se desvanecen y el diámetro de los nanoporos se agranda a 20-40 nm, mientras que existen las crestas en la superficie (Fig. 4c). Al extender el tiempo de anodización en dos pasos a 80 minutos, los nanoporos se agrandan a 60-70 nm y las crestas desaparecen (Fig. 4d).

Imágenes SEM de la alúmina anódica porosa (PAA) con diferentes tiempos de duración de la segunda anodización a 0 min, b 40 min, c 60 min y d 80 min

De acuerdo con la teoría de la disolución asistida por campo ácido (AFAD) [43], en el proceso de anodización, las películas de óxido de la capa de barrera se vuelven no uniformes y se forman las crestas. En estos puntos, la AFAD agravada promueve la formación y el desarrollo de los microporosos. Con la prolongación del segundo tiempo de anodización, los orificios ordenados y pasantes se forman gradualmente en la superficie, y luego desaparecen los armazones y las crestas de la carcasa multicapa (Fig. 4b-d). El resultado es similar al de Reddy's, que preparó PAA mediante un proceso de anodización en dos pasos en ácido oxálico 0,3 mol / L [44].

Análisis de micromorfologías de películas de ZnO

Las propiedades antobiofilm de las superficies del material se ven afectadas por su morfología y sustancias [12]. Como se muestra en la Fig. 5, las morfologías de las películas de ZnO son significativamente diferentes que se preparan en las películas de PAA con diferentes tiempos de duración de la segunda anodización. En las superficies de la película de PAA con nanoporos de 5 a 10 nm, las partículas grandes aglomeradas de 20 a 30 nm están densamente unidas y forman películas gruesas de ZnO (Fig. 5a). Sobre la superficie de la película de PAA que se prepara mediante una duración de anodización en dos etapas durante 40 min, los marcos de la carcasa de múltiples capas permanecen en la película de ZnO (Fig. 5b). Como se muestra en la Fig. 5c, las partículas de ZnO se han unido al esqueleto de la película de PAA y han formado agujeros más grandes. En la muestra con nanoporos de 60 a 70 nm, las partículas de ZnO de 10 a 20 nm se adhieren al borde de los orificios del PAA y una parte de las partículas ingresa a los nanoporos (Fig. 5d). Este puede ser el collosol que ingresa a los orificios más grandes en condiciones de vacío y luego forma las partículas de ZnO. Los resultados anteriores indican que cuanto más pequeños son los diámetros de nanoporos de PAA, mayor es la tasa de adherencia de ZnO. Wu y col. [45] Considere que las partículas de collosol se forman fácilmente en la pared de los orificios debido al negativo de las partículas de sol y al positivo de las paredes de los poros de PAA. El hallazgo también es consistente con el estudio de Bousslama et al. [46]. El collosol simplemente se adhiere a la pared de los orificios cuando la película de PAA se sumerge en sol de zinc durante 24 h, y luego los orificios se llenan durante 48 h, lo que indica que las partículas de collosol se adhieren preferentemente a la pared de los orificios.

Imágenes SEM de las películas de ZnO preparadas en PAA con diferentes tiempos de duración de anodización en dos pasos a 0 min, b 40 min, c 60 min y d 80 min

Los resultados anteriores muestran que las partículas de collosol entran fácilmente en grandes orificios y se adhieren a la superficie interna en condiciones de vacío; sin embargo, las partículas de collosol solo se adhieren a los esqueletos de las superficies exteriores de PAA con los pequeños agujeros.

Las imágenes TEM de la película de ZnO recortada de la película compuesta de ZnO / PAA se muestran en la Fig. 6. En la superficie de PAA preparada solo por anodización en un paso, las partículas de ZnO deslaminadas son de aproximadamente 10 nm, pero las partículas de 20-30 nm se muestran en la imagen SEM (Fig. 5a), lo que indica que las partículas de ZnO están aglomeradas. En la superficie de PAA preparada mediante anodización en dos pasos, las partículas de ZnO deslaminadas tienen aproximadamente 20 nm y una parte de las partículas se aglomeran en las ubicaciones individuales. Se manifiesta que las partículas de ZnO se unen primero al borde de los orificios del PAA (Fig. 6c, e, f).

Imágenes TEM ( a , c , e , f ) y patrones SAED ( b , d ) de las películas de ZnO preparadas en PAA con diferentes tiempos de duración de anodización en dos etapas a , b 0 min c , d 40 min; e 60 min; y f 80 min

Los planos de celosía (100), (101), (102), (110) y (103) de la estructura hexagonal de wurtzita ZnO se muestran en patrones SAED (Fig. 6b, d), lo que indica que ZnO es una wurtzita hexagonal. Los resultados coinciden con el análisis XRD.

Caracterización de hidrofobicidad-hidrofilicidad de la superficie de la película de ZnO

Para disminuir la adhesión bacteriana de los materiales, las películas de ZnO preparadas con diferentes micromorfologías se tratan para mejorar la hidrofobicidad, y el ángulo de contacto con el agua de la superficie de la película delgada antes y después de la modificación se muestra en la Tabla 1.

Antes de la modificación, las películas de ZnO son hidrófilas debido a los grupos hidroxilo de la superficie de las partículas de ZnO. La hidrofilia es la mejor debido a su estructura porosa que se preparó en una superficie de PAA con una duración de anodización en dos pasos de 40 min. Para las otras muestras con una duración de anodización en dos etapas de 60 y 80 min, las hidrofilias disminuyen gradualmente debido a la baja cantidad de adhesivo de ZnO. Para la muestra con duración de anodización en un solo paso, la baja hidrofilia se debe a su estructura no porosa.

Después de la modificación, las películas de ZnO se traducen en hidrófobas. Según el análisis FT-IR, el trietoxisililpropilo se injerta en las muestras después de la rotura de los enlaces –S – S– de Si69. Mientras tanto, podría ser el resultado de su estructura porosa y más partículas de ZnO; la película tiene la mayor hidrofobicidad con una duración de anodización en dos pasos de 40 min.

Caracterización de Shewanella putrefaciens Biofilms

Chi y col. [47] informó que el aluminio anodizado no tiene actividad antibacteriana contra las bacterias Gram-negativas ( Escherichia coli y P. aeruginosa ) y bacterias Gram-positivas ( Streptococcus faecalis y Staphylococcus aureus ). Sin embargo, el ZnO tiene una excelente actividad antibacteriana y antibiofilm [25,26,27], y existe una correlación positiva entre la actividad antibacteriana y antibiofilm [48, 49]. Además, las propiedades antibacterianas del ZnO se ven afectadas por su microestructura [50, 51]. Con el fin de obtener una excelente superficie de actividad antibiofilm, se prepararon películas de ZnO con diferente microestructura sobre películas de PAA con diferentes tiempos de duración de la segunda anodización, y se midieron las propiedades antibiofilm.

La adhesión de las biopelículas y las curvas de crecimiento de las bacterias de las biopelículas

La formación y desarrollo de la biopelícula bacteriana se puede concluir en cinco etapas:la adhesión reversible de las bacterias a la superficie inicialmente; la conversión de la adhesión reversible a la adhesión irreversible; la formación inicial de la biopelícula; el desarrollo de la biopelícula madura; y la degeneración de la biopelícula y las bacterias vuelven al estado planctónico [52].

Como se muestra en la Fig. 7 (1), en 2 horas, la adherencia de Shewanella putrefaciens La biopelícula en las películas de ZnO aumenta rápidamente, lo que ilustra la conversión de la adhesión reversible de bacterias a la adhesión irreversible. De 2 a 12 h, la adherencia del biofilm aumenta gradualmente, que es la etapa de crecimiento del biofilm. De 12 a 24 h, la adherencia del biofilm aumenta o declina levemente, manifestándose la etapa de madurez del biofilm. Después de 24 h, la adherencia de la biopelícula disminuye y las biopelículas entran en la etapa de degeneración. La Figura 7 (2) muestra que la tendencia a la variación de las bacterias del biofilm concuerda con la adherencia del biofilm, lo que indica que el desarrollo del biofilm depende de las bacterias del biofilm.

La adhesión de Shewanella putrefaciens biopelícula ( 1 ) y curva de crecimiento de colonias de las bacterias del biofilm ( 2 ) en las películas de ZnO preparadas en PAA con diferentes tiempos de duración de anodización en dos pasos (a) 0 min, (b) 40 min, (c) 60 min y (d) 80 min

Además, para la película de ZnO preparada en la superficie de PAA con una duración de anodización en dos pasos durante 80 min, la adherencia del biofilm y la cantidad total de bacterias del biofilm son las más altas entre las cuatro muestras. Sin embargo, para la película de ZnO preparada en la superficie de PAA con una duración de anodización en dos pasos durante 40 min, la propiedad antibiofilm es óptima. Esto podría deberse a la adherencia de la biopelícula que es inhibida por la mayor hidrofobicidad, y luego menos exopolisacáridos (EPS) y el otro nutriente contra el crecimiento de la biopelícula bacteriana. Para la película de ZnO preparada en la superficie de PAA con una duración de anodización en dos pasos durante 80 min, su hidrofilia es buena para la adherencia inicial de la biopelícula y menos partículas de ZnO no inhiben el crecimiento de las bacterias de la biopelícula. Mientras tanto, más materiales adhesivos de biopelícula nutren las bacterias de la biopelícula y las bacterias de la biopelícula se multiplican rápidamente. De acuerdo con nuestra investigación, la adherencia de la biopelícula es inhibida por la mayor hidrofobicidad de la película de ZnO en la etapa inicial de formación de la biopelícula [49]. La adherencia de las biopelículas se ve afectada por las propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas de los materiales [14, 53, 54]. Bonsaglia et al. [14] informó que L. monocytogenes se adhieren a la superficie hidrófila más fácilmente que a la superficie hidrófoba. Many studies found that the bacterial adhesion is reduced or inhibited by hydrophobic surface [47, 54]. Shaer et al. [54] indicated that the biofilm colonization on the functionalizing orthopedic hardware could be prevented by hydrophobic polycations. Chen y col. [55] also suggested that the biofilm could be inhibited by low surface free energy. The results matched those from us.

The Morphological Characteristics of Shewanella putrefaciens Biofilm

The microtopographies of Shewanella putrefaciens biofilm at various stages are shown in Fig. 8.

SEM images of the biofilms on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

After cultivated for 2 h, there are less adhesive materials on the ZnO film prepared on PAA without two-step anodization (a) and with two-step anodization duration for 40 min (b), but more adhesive materials and a few bacteria on the other two (c, d). It is indicated that the anti-adhesive properties of the former two are better than the latter two, it is consistent with Fig. 7. After cultivated for 12 h, more and more EPS and bacteria are attached to ZnO films, signifying the rapid growth of the biofilm. At 24 h, the EPS films are thickened gradually and biofilm bacteria grew well, indicating mature biofilms. At 36 h, the deciduous EPS films and dead bacteria illustrate the biofilm degenerating stage.

According to the antibacterial mechanisms of dissolved metallic ions, the dissolved zinc ions are combined with active proteinase of bacteria, make proteinase lose its bioactivity, and damage its bacterial cells to death [34, 56]. Thus, the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to the latter two (c, d) due to their plentiful ZnO particles on the films. Xie [57] and Jones [58] also thought that the antibacterial abilities strengthened with the dosage increasing of ZnO particles. Meanwhile, the adhesive materials and bacteria on the sample (d) are all more than the others, according to the analysis of adhesion of Shewanella putrefaciens biofilm and colony growth curve of the biofilm bacteria (Fig. 7). Feng y col. [59] found that the hypha of Escherichia coli easily reached into the PAA pores with diameters of 50 and 100 nm, and the biofilm accumulated and adhered to the surface of PAA. However, there is no hypha of Shewanella putrefaciens could be observed in our study. It can be inferred that the optimal antibiofilm properties are ascribed to the lower hydrophobicity of ZnO film in the initial stage of the biofilm formation.

The CLSM Characteristics of the ZnO/PAA Composite Biofilms

As shown in CLSM images, the live Shewanella putrefaciens bacteria are green, and the dead ones are red (Fig. 9). The black images indicate that the counts of live bacteria on the surfaces are few after biofilm cultivation for 2 h. Biofilm bacteria multiply rapidly, and the counts of live bacteria are significantly increased with the cultivation time. More dead bacteria are observed in the former two (a, b) at 24 h and in all samples at 36 h. The counts of dead bacteria of the latter two (c, d) are less than that of the former two (a, b). The results indicate that the antibacterial properties of the former two (a, b) are superior to that of the latter two (c, d), which is according to the previous analysis.

CLSM images biofilms formed on the zinc oxide films prepared on PAA with different time of two-step anodization duration a 0 min, b 40 min, c 60 min, and d 80 min

Conclusions

In this work, the PAA films with different microstructures were prepared by two-step anodic oxidation first, and then the ZnO/PAA composite films are prepared by sol-gel. The ZnO films are hydrophilic due to the surface hydroxyl group on the ZnO particles. After being modified by Si69, the ZnO films translate to hydrophobicity because of its hydrophobic group. The antibiofilm properties of the ZnO films are affected by the hydrophobicity and amount of ZnO particles. The hydrophobicity inhibits the initial adherence of the biofilm and less EPS and the other nutrient against the growth of biofilm bacteria. So, the antibiofilm properties of the ZnO/PAA film are optimal which are prepared on the PAA surface with two-step anodization duration for 40 min because of its super-hydrophobicity and plenty of ZnO particles.

Abreviaturas

AO:: Acridine orange
CA:: Water contact angle
EPS:: Exopolysaccharides
FT-IR:: Fourier transform infrared spectrometer
PAA:: Porous anodic alumina
PBS:: Solución salina tamponada con fosfato
PI:: Propidium iodide
SAED:: Difracción de electrones de área seleccionada
SEM:: Microscopía electrónica de barrido
TEM:: Microscopía electrónica de transmisión
TG/DTA:: Thermogravimetric/differential thermal analyze
XRD:: X-ray diffusion

Un enfoque fácil para la preparación de óxido de zinc de tamaño nanométrico en agua / glicerol con fuentes de zinc extremadamente concentradas Propiedades termoeléctricas del SnSe policristalino bidopado tipo n prensado en caliente

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