Nanopartículas de Gd₂O₃ funcionalizadas con ácido hialurónico: Mejora de la radioterapia guiada por RM para tumores

Resumen

La localización inexacta y la radiorresistencia intrínseca de tumores sólidos obstaculizan seriamente la implementación clínica de la radioterapia. En este estudio, fabricamos nanopartículas de óxido de gadolinio funcionalizadas con ácido hialurónico (HA-Gd₂O₃ NPs) mediante proceso hidrotérmico one-pot para imágenes de resonancia magnética (RM) efectivas y radiosensibilización de tumores. En virtud de la funcionalización HA, las NPs HA-Gd₂O₃ preparadas con diámetro de 105 nm mostraron dispersibilidad favorable en agua, baja citotoxicidad y excelente biocompatibilidad y entraron fácilmente en el citoplasma de células cancerosas por endocitosis mediada por receptor HA. Importante, las NPs HA-Gd₂O₃ exhibieron alta relajividad longitudinal (r₁) 6.0 mM⁻¹S⁻¹ como agentes de contraste RM y mejora de radiosensibilización de manera dependiente de la dosis. Estos hallazgos demostraron que las NPs HA-Gd₂O₃ sintetizadas como agentes teranósticos bifuncionales tienen gran potencial en diagnóstico y radioterapia de tumores.

Introducción

La radioterapia se ha aplicado extensivamente en cáncer, que involucra rayos X de alta energía y deposición de dosis de irradiación en sitios tumorales causando daño por radicales libres o daño al ADN. Sin embargo, pobre radiosensibilidad, inexactitud en la localización del tumor y pobre discriminación entre lesiones y tejidos normales causando efectos secundarios de irradiación limitan la implementación clínica de la radioterapia. Por tanto, es importante desarrollar métodos para mejorar la radiosensibilidad del tumor mientras se minimizan efectos secundarios sistémicos. Una combinación de nanotecnología y radioterapia es una prioridad bien establecida para radiosensibilización.

En años recientes, la nanotecnología ha sido considerada una estrategia atractiva para diagnóstico y terapia del cáncer. Una de las funciones principales de las nanopartículas (NPs) es una orientación tumoral precisa basada en la acumulación selectiva de NPs en tejidos tumorales mediante orientación pasiva, el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR), orientación activa y tiempo de circulación prolongado. Nuestro trabajo previo demostró que dopar NPs de carbono con heteroátomos ajusta efectivamente sus propiedades intrínsecas e introduce características beneficiosas. Interesantemente, las NPs pueden usarse como radiosensibilizadores. NPs de metales pesados (con elementos de alto Z) (ej. Au, Bi, Gd) como radiosensibilizadores prometedores pueden usarse en terapia radiosensibilizante debido a su alta sección transversal de captura de fotones X y efecto de dispersión Compton. Cuando rayos X interactúan con NPs de alto Z, electrones Auger y fotoelectrones, la liberación de electrones secundarios dañan células cancerosas, proporcionando mejora de dosis durante radioterapia. Hasta la fecha, NPs basadas en gadolinio (GdNPs) se han mostrado como agentes de contraste RM efectivos y diferencian tejido normal de enfermo y lesiones de manera no invasiva y en tiempo real. Estos agentes acortan tiempo de relajación longitudinal para afectar relajividad longitudinal r₁, y su orientación inexacta frecuentemente resulta en efectos secundarios. Es bien conocido que el ácido hialurónico (HA) es un ligando principal y portador de fármacos a sitios diana con receptores HA como determinante de clúster 44 (CD44).

Basados en resultados de estudios previos, usamos HA como ligando de orientación para funcionalizar NPs Gd₂O₃ con funciones duales: agentes de contraste RM efectivos para orientación tumoral y radiosensibilizadores para superar radiorresistencia intrínseca e inexactitud en localización tumoral. Además, las NPs HA-Gd₂O₃ muestran alta relajividad longitudinal (r₁) como agentes prometedores de imagen RM con mejor calidad de imagen RM. Comparadas con agentes de contraste disponibles actualmente, las NPs HA-Gd₂O₃ resultantes muestran tres ventajas significativas: primero, las NPs HA-Gd₂O₃ exhiben biocompatibilidad favorable debido al uso de matriz extracelular natural como precursores. Segundo, la funcionalización HA mejora significativamente la orientación tumoral y reduce efectos secundarios. Finalmente, las NPs HA-Gd₂O₃ poseen capacidad bifuncional en diagnóstico y terapia. Para verificar la efectividad y explorar el mecanismo de mejoras de radiosensibilización, evaluamos el efecto radiosensibilizador de NPs HA-Gd₂O₃ en viabilidad de células tumorales, ciclo celular y apoptosis.

Resultados y Discusión

Preparación y Caracterización de NPs HA-Gd₂O₃

En este estudio, las NPs HA-Gd₂O₃ se prepararon exitosamente usando un proceso hidrotérmico simple como se muestra en el Esquema 1. Los tamaños de partícula se analizaron por dispersión dinámica de luz, mientras que el examen morfológico se realizó por microscopía electrónica de transmisión. Como se muestra en la Fig. 1a, las NPs HA-Gd₂O₃ exhibieron dispersión uniforme y formas cuasi-esféricas discretas sin agregación aparente. Los diámetros promedio de las NPs HA-Gd₂O₃ fueron 105 nm. Comparado con tejidos normales, la permeabilidad endotelial capilar de tejidos tumorales aumentó y el espacio endotelial fue 100-600 nm. Por tanto, NPs con tamaños deseables se sumergieron fácilmente en tejidos tumorales y pueden aumentar dramáticamente la eficiencia de administración pasiva de fármacos.

La estructura de fase de las NPs HA-Gd₂O₃ se investigó mediante XRD usando óxido de grafito (GO) como control. Como se muestra en la Fig. 1d, se observó un pico principal de difracción (2θ = 12.04°) y dos picos menores (2θ = 29.6°, 42.1°) en el patrón de difracción de NPs HA-Gd₂O₃, que correspondieron a picos característicos de GO (plano 100) y grafito (plano 002), respectivamente. El espaciado de red principal de NPs HA-Gd₂O₃ mostró menor espaciado (0.73 nm calculado por fórmula de Bragg) que el espaciado GO de d₀₀₁ = 0.85 nm, donde el desplazamiento hacia arriba en la posición del pico puede atribuirse a la disminución en espaciado entre capas sp³. Todos los picos de difracción anchos demostraron que las NPs HA-Gd₂O₃ tenían una estructura amorfa, que puede atribuirse al carbono altamente desordenado y disminución en sp² (C-C) espaciado de capas durante el proceso de carbonización. El resultado indicó further que las NPs HA-Gd₂O₃ con naturaleza cristalina pobre poseían una estructura multi-capa heterogénea, consistente con nuestros reportes previos sobre puntos de carbono.

Estructura Química y Composición Superficial de NPs HA-Gd₂O₃

Grupos funcionales superficiales y composición de NPs HA-Gd₂O₃ se investigaron usando espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier y espectroscopía de fotoelectrones de rayos X. Como se muestra en la Fig. 2a, el espectro XPS mostró cuatro picos típicos en 284.0, 400.0, 530.6 y 1188.5 eV, indicando que las NPs HA-Gd₂O₃ estaban compuestas principalmente de gadolinio, carbono, oxígeno e hidrógeno. El espectro de alta resolución de Gd_3d (Fig. 2b) reveló la presencia de dos picos fuertes en 1187.5 eV y 1221 eV, correspondientes a una separación espín-órbita de 32 eV, correspondientes respectivamente a niveles de energía 3d_5/2 y 3d_3/2 de Gd. Estas observaciones estuvieron en buen acuerdo con reportes previos de NPs HA-Gd₂O₃. El espectro O (1s) mostrado en Fig. 2c fue dominado por un pico principal posicionado en 531.4 eV, correspondiente al enlace entre O²⁻ y Gd³⁺. La espectroscopía FTIR se realizó para muestras desnudas y NPs HA-Gd₂O₃ (Fig. 2d). Para muestras desnudas, como se muestra en Fig. 2a, las bandas de absorción características de ν_as O-C-O en 1580 y 1380 cm⁻¹ revelaron la presencia de grupo carbonato. Los picos anchos en 3340 y 2900 cm⁻¹ se atribuyeron a vibraciones de estiramiento O-H y C-H, respectivamente, correspondientes a agua adsorbida en superficie. Para NPs HA-Gd₂O₃, las vibraciones de estiramiento de COO⁻ en 1580 y 1380 cm⁻¹ se mejoraron, indicando la introducción del grupo carboxílico de ácido hialurónico. Estos resultados revelaron que los grupos funcionales de NPs HA-Gd₂O₃ contenían principalmente numerosos grupos carbonilo, carboxilato e hidroxilo. La presencia de estos grupos funcionales ubicados en la superficie confirió a las NPs HA-Gd₂O₃ excelente dispersibilidad en agua. Importantemente, el ion Gd incrustado en la superficie de las NPs puede ser útil para imagen RM y radiosensibilización, lo que previno dramáticamente la fuga del ion Gd al entorno circundante.

Biocompatibilidad de NPs HA-Gd₂O₃

La biocompatibilidad de NPs HA-Gd₂O₃, como agentes biomédicos potenciales, es crítica para su aplicación biomédica. Primero, la citotoxicidad inherente de NPs HA-Gd₂O₃ se evaluó en células HepG2 y VSMC usando ensayo CCK-8. Como se muestra en Fig. 3a y Fig. S1, las NPs HA-Gd₂O₃ no exhibieron citotoxicidad obvia hasta 3 días. Incluso a concentración de 200 μg/mL después de tiempo de exposición 24 h, la viabilidad celular fue aproximadamente 90%. Segundo, la hemocompatibilidad de NPs HA-Gd₂O₃ in vivo se estimó usando ensayo de hemólisis. Como se muestra en Fig. 3b, observamos hemólisis de glóbulos rojos en agua (control positivo). En contraste, no se observó hemólisis obvia después de incubación con NPs HA-Gd₂O₃ a diferentes concentraciones de 0 a 200 μg/mL por 2 h, similar a resultados para solución PBS (control negativo). Comparado con control negativo, el porcentaje de hemólisis a diferentes concentraciones de NPs HA-Gd₂O₃ se evaluó ligeramente basado en absorbancia del sobrenadante a 541 nm. Los resultados mostraron que los porcentajes de hemólisis de NPs HA-Gd₂O₃ fueron todos menos de 3% en la concentración estudiada, verificando su favorable hemocompatibilidad. Para examinar toxicidad potencial, NPs HA-Gd₂O₃ se inyectaron intravenosamente en ratones Balb/c (como se ve en Fig. S2). Después de 1 semana, estos ratones fueron sacrificados y vejiga, riñón y bazo se cosecharon para análisis de sección patológica. Como se muestra en Fig. S2, el resultado de secciones patológicas mostró que no había lesión observable o respuesta inflamatoria en órganos de ratones tratados con NPs HA-Gd₂O₃. Estos resultados indicaron claramente que las NPs HA-Gd₂O₃ sintetizadas tenían citocompatibilidad favorable y buena hemocompatibilidad.

Estudio de Fantasma RM

Los tiempos de relajación longitudinal (T₁) de NPs HA-Gd₂O₃ se investigaron in vitro junto con el contraste comercial Magnevist (Gd-DTPA) como control usando solución salina fosfato amortiguada (pH = 7.4, 0.2 M). Con concentraciones crecientes de Gd, la intensidad de señal de imágenes fantasma T₁-peso aumentó claramente, indicando que todas las muestras podían generar mejora de contraste RM en secuencias T₁-peso (Fig. 4a). Además, gráficos de intensidad de señal versus tiempo de inversión dieron tiempos de relajación T₁ de cada agente de contraste a concentraciones específicas. Como se muestra en Fig. 4b, el valor r₁ de NPs HA-Gd₂O₃ se midió en 6.0 mM⁻¹S⁻¹, significativamente mayor que el de Magnevist (3.86 mM⁻¹S⁻¹) bajo mismas condiciones. El r₁ mejorado puede atribuirse al radio hidrodinámico y área superficial mucho mayores de NPs HA-Gd₂O₃; por tanto, más átomos de Gd dopados en la red de NPs se volvieron accesibles a moléculas de agua, acortando la relajación longitudinal y mejorando el valor r₁.

Imagen RM In Vivo

Para determinar aplicaciones potenciales in vivo, el rendimiento de imagen RM y destino de circulación de NPs HA-Gd₂O₃ (10 mg/kg) se investigaron usando escáner RM con ratones BALB/c normales como modelo. Comparado con imágenes pre-inyección (Fig. 4c), regiones más brillantes de riñón y vejiga indicadas por círculos discontinuos se observaron claramente a 10 min post-inyección, demostrando que NPs HA-Gd₂O₃ podían usarse como agentes de contraste mejoran relajación T₁ en estos órganos principales in vivo. Importantemente, la mejora de contraste de NPs HA-Gd₂O₃ se mantuvo hasta 60 min post-inyección, mucho más que complejos Gd de moléculas pequeñas (vida media de unos minutos en animales pequeños), indicando que NPs HA-Gd₂O₃ poseían tiempos de retención in vivo más largos que el contraste comercial. Para analizar cuantitativamente el efecto de contraste RM, calculamos la relación señal-ruido (SNR) analizando finamente regiones de interés de imágenes RM y calculamos valores de SNR_post/SNR_pre para representar mejora de señal relativa (RSE) (Fig. 4d). Los valores RSE de NPs HA-Gd₂O₃ en riñón fueron 1.35, 1.99 y 1.86. Similarmente, los valores RSE de NPs HA-Gd₂O₃ en vejiga fueron mayores que en riñón (1.29, 3.59 y 2.26). NPs HA-Gd₂O₃ con tamaño grande (más de 100 nm) mostraron tiempos de circulación largos, luego pueden eliminarse vía vía biliar-intestinal según resultados previos. Además, el tiempo de circulación prolongado in vivo puede haber aumentado orientación pasiva en tumores mejorando el efecto EPR.

Imagen de Tumor

NPs HA-Gd₂O₃ con excelente rendimiento de imagen RM y tiempo de circulación largo proporcionan gran oportunidad para imagen de tumores a través de efecto EPR. Establecimos modelos de tumor hepático subcutáneo para investigar si carcinomas hepatocelulares (HCC) pueden detectarse por RM mejorada con NPs HA-Gd₂O₃. Después de inyección intravenosa de NPs HA-Gd₂O₃, observamos que la región tumoral subcutánea se vuelve más brillante que el tejido circundante como se ve en ambos escaneos coronal y transversal (Fig. 5a). El RES del tumor subcutáneo alcanzó dramáticamente 1.54 y 1.83 con escaneo transversal y coronal, respectivamente, indicando acumulación efectiva de NPs HA-Gd₂O₃ en región tumoral a través de efecto EPR. Estos hallazgos demuestran que NPs HA-Gd₂O₃ son altamente sensibles para visualización RM de tumores. Muchos estudios mostraron que tiempo de circulación largo podría promover eficiencia de orientación pasiva a través de vasculatura permeable de tumores sólidos.

Mejora de Radiosensibilización de NPs HA-Gd₂O₃

El excelente rendimiento de NPs HA-Gd₂O₃ como agente de contraste T₁ nos llevó a determinar su ubicación en la radiosensibilización de tumores con precisión. Primero, si ocurría mejora de dosis con esta combinación de tratamiento se exploró usando ensayo CCK-8. Como se muestra en Fig. 6a, NPs HA-Gd₂O₃ solas (concentración 0-200 μg/mL) no influyeron significativamente en viabilidad de HepG-2, pero irradiación X-ray (rango 0-9 Gy) disminuyó viabilidad de HepG-2 a menos de 70% a 9 Gy. Importantemente, una combinación de irradiación X-ray con NPs HA-Gd₂O₃ disminuyó dramáticamente viabilidad de HepG-2 a menos de 50%, particularmente a concentración de 200 μg/mL a 9 Gy. Luego, se realizó ensayo clonogénico para evaluar viabilidad celular en células HepG-2 tras combinación de irradiación X-ray y NPs HA-Gd₂O₃. Como se muestra en Fig. 6b, NPs HA-Gd₂O₃ solas no tuvieron influencia dramática en formación de colonias de células HepG-2, pero irradiación X-ray disminuyó formación de colonias de células HepG-2 a 46.7%. Sin embargo, tratamiento con irradiación X-ray y NPs HA-Gd₂O₃ inhibió notablemente viabilidad de formación de colonias a 29.8%. Las imágenes correspondientes verificaron further la radiosensibilización de NPs HA-Gd₂O₃ contra células HepG-2.

La efectividad de radioterapia in vitro nos animó a aplicar NPs HA-Gd₂O₃ combinadas con irradiación para controlar crecimiento tumoral en ratones portadores de tumor. Los volúmenes de tumores en control y tratamientos con NPs HA-Gd₂O₃ solas crecieron rápidamente y ambos aumentaron 180%. Comparado con tratamientos de irradiación sola 58%, NPs HA-Gd₂O₃ combinadas con radiación mostraron inhibición tumoral eficiente por 38% después de 10 días de irradiación (Fig. 6d). El tumor fue fotografiado, y los volúmenes tumorales promedio en cada grupo mostraron que el volumen tumoral promedio en grupo (a) fue el más alto mientras que en grupo (d) fue el más bajo entre todos los grupos (Fig. 6e). Estos resultados revelan que las NPs HA-Gd₂O₃ preparadas son prometedoras para inhibición de crecimiento tumoral bajo irradiación X-ray.

Se realizaron ensayos de citometría de flujo y tinción vivo/muerto para comprender further el mecanismo de radiosensibilización en el tratamiento combinado de NPs HA-Gd₂O₃ y radiación X-ray. Como se muestra en Fig. 7a, fluorescencia verde intensa sin rojo se observó en células HepG-2 tratadas con NPs HA-Gd₂O₃ solas, verificando alta viabilidad celular. Pequeña cantidad de fluorescencia roja se observó tras tratamientos de radiación X-ray, indicando bajo nivel de apoptosis celular. Sin embargo, fuerte fluorescencia roja se observó tras tratamiento combinado de NPs HA-Gd₂O₃ (200 μg/mL) y radiación, demostrando que NPs HA-Gd₂O₃ podían aumentar dramáticamente apoptosis celular inducida por irradiación X-ray. El mecanismo de radiosensibilización de NPs HA-Gd₂O₃ se investigó further usando citometría de flujo. Como se muestra en Fig. 7b, radiación sola y NPs HA-Gd₂O₃ indujeron 27.55% y 19.12% de arresto en fase G2/M, respectivamente. Sin embargo, tratamiento combinado de NPs HA-Gd₂O₃ y radiación aumentó notablemente arresto en fase G2/M, variando de 30.89 a 33.27% de manera dependiente de dosis. Mientras tanto, el tratamiento combinado indujo muerte celular apoptótica de 10.63 a 22.67%, reflejado por proporciones sub-G1 cuando NPs HA-Gd₂O₃ solas y radiación indujeron 3.02% y 13.87%. Para investigar further posible mecanismo de muerte celular, se realizó método Annexin V-EGFP/PI por citometría de flujo. La señal de emisión Annexin V-EGFP se graficó en eje x, mientras que señal de emisión PI se graficó en eje y (Fig. 8). Las cantidades de células necróticas, apoptosis temprana, apoptosis tardía y células vivas se determinaron por porcentaje de Annexin V⁻/PI⁺(Q3), Annexin V⁺/PI⁺ (Q2) y Annexin V⁻/PI⁻ (Q4), respectivamente. El porcentaje apoptótico de células en grupo control y grupo NPs HA-Gd₂O₃ sola (100 μg/mL) fueron menos de 5%, resultando en influencia sutil. Comparado con grupos de tratamiento de radiación sola (8.8%), la tasa de apoptosis de combinación de NPs HA-Gd₂O₃ y radiación aumentó con concentración creciente variando de 50 a 200 μg/mL. Especialmente, la tasa de apoptosis temprana de células aumentó obviamente a 33.2%, y apoptosis temprana y tardía alcanzaron 44.3% cuando concentración es 200 μg/mL. Generalmente, la combinación de NPs HA-Gd₂O₃ y irradiación X-ray tuvo efecto sinérgico en formación de colonias celulares, viabilidad celular de manera dependiente de dosis y efecto de mejora de radiosensibilización. Basado en estos resultados, NPs HA-Gd₂O₃ pueden ser una alternativa eficiente para mejorar radiosensibilización para radioterapia.

Conclusiones

En conclusión, desarrollamos NPs HA-Gd₂O₃ bifuncionales para imagen RM efectiva y radiosensibilización de tumores en un proceso hidrotérmico one-pot. Tras recubrimiento con HA, las NPs HA-Gd₂O₃ sintetizadas exhibieron dispersibilidad favorable en agua, excelente biocompatibilidad. Las NPs HA-Gd₂O₃ resultantes encapsulando átomos Gd no solo exhibieron efectivamente alta relajividad longitudinal (r₁) para RM como agente de contraste T₁, sino que también mejoraron la radiosensibilidad de tumores induciendo apoptosis celular y bloqueando ciclo celular como radiosensibilizador. Así, las novedosas NPs HA-Gd₂O₃ muestran potencial prometedor para diagnóstico y radioterapia de tumores.

Materiales y Métodos

Materiales

Diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI) se adquirieron de Sigma (Nueva York, NY, EE. UU.). GdCl₃·6H₂O, glicol etileno (99%) se compraron de Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, República Popular China). El Kit de Conteo Celular-8 (CCK-8) se compró de Dojindo (Kumamoto, Japón). NaH₂PO₄, Na₂HPO₄ y H₂SO₄ se obtuvieron de Guangfu Fine Chemical Research Institute (Nankai, Tianjin, República Popular China). Suero fetal bovino y medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) se compraron de Invitrogen China Limited (Shanghai, República Popular China). Todos los químicos fueron de grado analítico y se utilizaron sin purificación adicional.

Síntesis de NPs HA-Gd₂O₃

Las NPs HA-Gd₂O₃ se prepararon usando enfoque hidrotérmico one-pot como sigue: Primero, 0.1 g de HA se disolvió en 20 mL de agua bajo agitación vigorosa a temperatura ambiente durante la noche. Posteriormente, 0.1 g de GdCl₃·6H₂O y 0.5 mL de NaOH (1 M) se agregaron, respectivamente. Luego, la mezcla se agitó por 5 min más para formar una solución clara homogénea y se transfirió a un autoclave de 50 mL, sellado e hidrotérmicamente tratado a 120 °C por 6 h. Tras enfriarse a temperatura ambiente naturalmente, la suspensión transparente se filtró con membrana de 0.22 μm para remover cualquier aglomeración de gran tamaño. La solución preparada se dializó contra agua por 3 días en bolsa de diálisis con corte de peso molecular 14 kDa. La solución de diálisis se recolectó y liofilizó usando secador por congelación al vacío. Los polvos de NPs HA-Gd₂O₃ así obtenidos se guardaron para further caracterización.

Instrumentación y Caracterizaciones

Las morfologías de NPs HA-Gd₂O₃ se examinaron por microscopía electrónica de transmisión de alta resolución en microscopio JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Japón) bajo voltaje acelerador 200 kV. La composición elemental de NPs HA-Gd₂O₃ se determinó por mediciones XPS en espectrómetro de fotoelectrones MK II, usando Al-Ka (1486.6 eV) como fuente de rayos X y espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, EE. UU.). La estructura cristalina de NPs HA-Gd₂O₃ se caracterizó mediante patrones de difracción de rayos X (XRD) en difractómetro Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Japón) equipado con Cu Kα (λ = 0.15405 nm) radiación a velocidad de barrido 4°/min en rango 5 a 80°.

Ensayo de Viabilidad Celular

La influencia de NPs HA-Gd₂O₃ en viabilidad celular se estudió vía ensayo Kit de Conteo Celular CCK-8 (ensayo CCK-8). Células HepG2 (hepatocarcinoma humano, Número ATCC: HB-8065) y VSMCs (células musculares lisas vasculares) se sembraron en placa de 96 pozos a densidad 3 × 10³ células/pozo y cultivadas a 37 °C en incubadora 5% CO₂ por 24 h, luego usando DMEM conteniendo diferentes concentraciones de NPs HA-Gd₂O₃ (0, 25, 50, 100, 200 μg/mL) reemplazando medio de crecimiento. Tras incubación por 4 h más, agregando 10 μL solución CCK-8 a cada pozo, células se incubaron por 4 h en lugar oscuro. La absorbancia se midió a 490 nm usando lector de microplacas Multi-Modo Synergy HT (Bio Tek, Winooski, VT, EE. UU.). Células no tratadas (en DMEM) usadas como control, y viabilidad celular relativa (media DS, n = 5) se expresó como Abs_muestra/Abs_control × 100%.

Ensayo de Hemólisis

Brevemente, ratonas BALB/c de 19-21 g, edades 6 semanas fueron preparadas amablemente por Reglas de Manejo Animal del Ministerio de Salud de la República Popular China. Tres mililitros de sangre estabilizada con heparina sódica se obtuvieron removiendo globos oculares. Luego, se centrifugó para remover sobrenadante con 1200 rpm, 15 min según literatura. Después, lavando sedimentación con PBS cinco veces para obtener glóbulos rojos de ratón (MRBCs), luego tomando ~3 mL sangre removiendo globo ocular, estabilizada con heparina sódica, centrifugada (1,200 rpm, 15 min) para remover sobrenadante según literatura, lavada con PBS cinco veces para obtener MRBCs. Diluir diez veces con PBS, 0.1 mL MRBCs se transfirieron a tubos de 1.5 mL prellenados con 0.9 mL PBS conteniendo diferentes concentraciones de partículas (50-200 μg/mL) de NPs HA-Gd₂O₃, 0.9 mL agua (control positivo) y 0.9 mL PBS (control negativo), respectivamente. La mezcla se incubó por 2 h a temperatura ambiente tras agitación suave, luego centrifugada a 12,000 rpm por 1 min. Finalmente, se tomaron fotografías de todas las muestras y la absorbancia del sobrenadante (hemoglobina) se midió por espectrofotómetro UV-2450 UV-Vis. Los porcentajes de hemólisis de diferentes muestras se calcularon dividiendo la diferencia en absorbancia entre muestra, control positivo y negativo a 541 nm.

Estudio de Fantasma RM In Vitro e In Vivo

Imágenes RM in vitro e in vivo se adquirieron en escáner RM 3 Tesla (Magnetom Trio Tim, Siemens, Alemania). Para estudiar imágenes fantasma T₁ in vitro, solución de NPs HA-Gd₂O₃ con diferentes concentraciones 0 a 16 mM se agregó a placa de cultivo 96 pozos, usando Magnevist (agente de contraste RM comercial, Gd-DTPA) como control. Para imagen RM in vivo, elegimos ratones BALB/c normales como modelo (n = 4). Experimentos con animales se ajustaron estrictamente a Reglas de Manejo Animal del Ministerio de Salud de la República Popular China. Diez mg/kg de NPs HA-Gd₂O₃ filtrados a través de filtros de membrana esterilizados (tamaño poro 0.22 μm) se inyectaron intravenosamente en los animales, luego investigados inmediatamente con escáner RM. Estas muestras para imagen RM in vitro y animales in vivo se imaginaron con parámetros: TR/TE = 300/10 ms, matrices 256 × 256, cortes = 5, espesor = 2 mm, promedios = 2, FOV = 80 × 80.

Efecto Radiosensibilizador In Vitro

Ensayo CCK-8 se usó para evaluar actividad radiosensibilizadora de NPs HA-Gd₂O₃ in vitro. Células se sembraron en cinco placas de 96 pozos a densidad 3 × 10³ células/pozo, y cada placa se trató en misma condición: cultivadas a 37 °C en incubadora 5% CO₂ por 24 h, luego usando DMEM conteniendo diferentes concentraciones de NPs HA-Gd₂O₃ (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL) reemplazando medio de crecimiento. Tras incubación por 4 h, cinco placas se irradiaron a diferentes dosis de rayos X (0, 3, 6, 9 Gy), 300 cGy/min, respectivamente. Tras radiación, todas las placas se incubaron por 4 h, luego midiendo absorbancia bajo mismos parámetros.

Ensayo de supervivencia clonogénica también se realizó para estudiar efecto radiosensibilizador in vitro. Células HepG2 se sembraron en placas de 6 pozos a 4.0 × 10⁴ células/pozo y permitidas crecer por 16 h. Las células se incubaron con NPs HA-Gd₂O₃ diluidas en medio de cultivo celular por 6 h. Las células se irradiaron a 6 Gy usando acelerador lineal clínico (Oncor, Siemens, Alemania) con irradiación 6 MeV usando campo de radiación 10 cm × 10 cm a distancia fuente-piel (SSD) 100 cm para cubrir todas las células. Luego, estas células irradiadas se permitieron crecer por 14 días, fijadas con 4% paraformaldeído a temperatura ambiente por 40 min, teñidas con 1% violeta de cristal después de lavar células.

Ensayo de Tinción Vivo-Muerto y Citometría de Flujo

Para estudiar efecto radiosensibilizador de NPs HA-Gd₂O₃, células HepG2 se sembraron en placas de 6 pozos a densidad 4.0 × 10⁴ células/pozo y permitidas crecer por 12 h y se establecieron seis grupos (control, NPs HA-Gd₂O₃, radiación, radiación + 50 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃, radiación + 100 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃ y radiación + 200 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃). Cuando células crecieron a 80% en placas, primer grupo sin tratamiento, segundo grupo incubado con 100 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃ por 24 h, tercer grupo solo irradiado, y cuarto a sexto grupos irradiados e incubados con diferentes concentraciones de NPs HA-Gd₂O₃ (50, 100, 200 μg/mL) por 24 h, respectivamente. Tras eso, buffers de trabajo FDA y PI se agregaron para tinción celular. La fluorescencia de células teñidas se observó bajo microscopio de fluorescencia (×20), células vivas mostraron color verde y muertas rojo. Además, células por diferentes tratamientos se lavaron tres veces con PBS, digeridas, recolectadas y centrifugadas a velocidad 2000 rpm por 5 min, luego fijadas con 70% etanol a -20 °C durante la noche seguido por tinción PI. Fragmentación de ADN cuantificada por intensidad de fluorescencia de PI en citómetro de flujo (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analizada por software (FLOWJO 7.6.2) para clarificar distribución de ciclo celular.

Efecto Radiosensibilizador In Vivo

Ratonas BALB/c con pesos corporales 19-21 g y edades 6 semanas se obtuvieron de Yangzhou University Laboratory Animal Center bajo condiciones estándar. Experimentos con animales cumplieron con Reglas de Manejo Animal del Ministerio de Salud de la República Popular China. Modelo de tumor subcutáneo se estableció como sigue: Primero, 1 × 10⁶ células HepS se inocularon en ratones intraperitonealmente, y el ascitis se recolectó después de 5 días. Luego, estos ascitis se inyectaron subcutáneamente. Cuando tamaños tumorales alcanzaron ~100 mm³, modelos de tumor subcutáneo se establecieron y aplicaron a siguientes experimentos.

Ocho ratones con tumores subcutáneos por grupo se trataron con radiación a 3 Gy por fracción a dosis total 9 Gy dentro de 7 días. La radioterapia se realizó tras 3 h inyección intravenosa de NPs HA-Gd₂O₃ (10 mg/Kg), en acelerador lineal clínico Siemens Primus (6 MeV) usando dispositivo autofabricado para cubrir todo el tumor. Estos ratones fueron anestesiados por 1% pentobarbital (50 mg/kg) para asegurar inmovilidad durante irradiación. El volumen se midió y registró cada día, determinado por medición con calibrador, calculado por fórmula: V = 0.5 × a × b², donde V (mm³) es volumen del tumor, a (mm) y b (mm) son largo y ancho del tumor, respectivamente. Volúmenes tumorales relativos normalizados a tamaños iniciales. Cada grupo se realizó en ocho ratones, análisis estadístico realizado usando prueba t de Student de dos colas (*p < 0.05, **p < 0.001).

Disponibilidad de Datos y Materiales

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