Optimización de Hipertermia Desencadenada por NIR con Nanopartículas Cs_0.33WO₃ para Tratamiento de Cáncer Hepático HepG2

Resumen

La hipertermia es uno de los métodos más amigables para el paciente para curar enfermedades cancerígenas debido a su no invasividad, efectos secundarios y toxicidad mínimamente inducidos, y fácil implementación, lo que impulsa el desarrollo de nuevos métodos terapéuticos como sistemas de dosificación activados fototérmicamente. Esta investigación examina las variables de los efectos fototérmicos de nanopartículas (NPs) Cs_0.33WO₃, la duración de irradiación, densidad de potencia óptica y concentración de NPs, sobre la línea celular de cáncer hepático HepG2 in vitro, llevando a la formulación de una dosis térmica irradiada en infrarrojo cercano (NIR). Específicamente, las NPs con tamaños de característica particulada de 120 nm se sintetizaron a través de una serie de reacciones de oxidación-reducción (REDOX), recocido térmico y procesos de molienda en húmedo, y la posterior caracterización de propiedades físicas, composicionales, ópticas y fototérmicas se examinó usando dispersión dinámica de luz (DLS), espectroscopía de rayos X dispersiva en energía (EDS), microscopías electrónicas de barrido y túnel (SEM y TEM), difracción de rayos X (XRD) y fotospectroscopía visible-infrarrojo cercano (VIS–NIR). Se obtuvo la citotoxicidad de las NPs y sus parámetros de irradiación para las células HepG2. Al incubar las células con las NPs, se verificó el estado de endocitosis, y se determinó la dependencia de la tasa de supervivencia celular en los parámetros variables de dosis fototérmica mientras se mantenía la temperatura del medio del plato de cultivo que contenía células a temperatura corporal humana alrededor de 36.5 °C.

Introducción

Globalmente, solo en el año 2018, las feroces enfermedades cancerígenas cobraron alrededor de 10 millones de vidas y agregaron unos 18 millones de nuevos casos [1]. Hasta ahora, aunque la quimioterapia, radiación, extirpación quirúrgica o combinación adaptada de estas tres representan una mejora de la tasa de supervivencia a 5 años ligeramente superior al 40% de pacientes con cáncer tratados [2, 3], la naturaleza tóxica y perjudicial de los químicos y el bombardeo iónico inevitablemente causan numerosos efectos secundarios como pérdida de cabello, cardiotoxicidad, infertilidad, anomalías cromosómicas y muchos más [4, 5]. Tales consecuencias que afectan la vida han instado fuertemente al desarrollo de medicina terapéutica amigable para el paciente incluyendo compuestos incorporados con NPs.

La nanotecnología basada en sistemas de materiales peculiares, estructuras, forma y estequiometría atómica a escala de tamaño por debajo de 100 nm produce propiedades químicas, físicas y bioquímicas sin precedentes mejoradas por los fenómenos de cuantización y ya ha encontrado aplicaciones preclínicas e in vitro en muchas ramas de la ciencia biomédica [6, 7]. A pesar de los inconvenientes de la quimioterapia, las NPs que sirven como transportadores de administración mejoran la selectividad de liberación de fármacos en tumores enfermos, facilitan la captación de fármacos por las células tumorales y reducen en gran medida la toxicidad acumulativa en el tejido sano [8, 9]. Además, la calidad de imagen producida por una serie de modalidades de imagen basadas en NPs se mejora enormemente con mayor sensibilidad, resolución espacial más fina y mejor penetración de profundidad para revelar biodistribución, monitorear captación de fármacos, localizar tumores y evaluar eficacia del tratamiento [10]. Además de la función diagnóstica, las NPs cuando se aprovechan con propiedad física inherente, como ablación por radiofrecuencia (RF) o hipertermia renderizada fototérmicamente, pueden inducir daños adicionales en la ubicación deseada con mayor eficiencia [11,12,13], de las cuales la segunda es comúnmente preferible sobre su dosificación específica del sitio, menor grado de dolor, bajos efectos secundarios y riesgo mucho reducido de quemaduras tisulares.

Hasta ahora, los sistemas de materiales NP capaces de inducir hipertermia tras foto-irradiación incluyen oro (Au), tungstato de cesio (CsWO₃), óxido de hierro, sulfuro de cobre, grafeno y nanotubos de carbono y demostraron la aplicabilidad de imponer daños letales en células cancerígenas elevando la temperatura extracelular o intracelular in situ [14,15,16,17,18]. Al igual que la ablación RF mejorada con NP, el nivel de densidad de potencia de fuentes fotónicas es un tema crítico para la seguridad clínica y comodidad del paciente [11], y se manifiesta que el límite máximo de exposición para piel humana en el rango de longitud de onda VIS y NIR entre 400 a 980 nm es de 0.2 a 0.726 W/cm² según la Comisión Internacional de Protección contra Radiaciones No Ionizantes (ICNIRP) publicada en 2013 [19]. No obstante, la mayoría de las densidades de potencia óptica reportadas en estudios previos de células cancerígenas in vitro estaban muy por encima del límite de seguridad para tejido cutáneo, lo cual puede ser un asunto grave cuando se trata de tratar tejidos biológicos internos con un umbral bajo de foto-irradiación para vulnerabilidad. Por ejemplo, la densidad de potencia óptica NIR de nanopartículas de oro (Au) que demostraron destrucción efectiva de células cancerígenas varía de 2 a 80 W/cm² cuando se irradian por no más de 10 min [13, 14, 20,21,22]. De manera similar, una variedad de otros sistemas de materiales como óxidos de grafeno [18], platino de hierro (FePt) [23] y nanocristales NaYF₄:Yb,Er [24] requerían no menos de 150 mW/cm² para un despliegue instrumental.

Siendo un material relativamente menos explorado para experimentos in vitro, pocos estudios reportaron aniquilación de células de cáncer cervical (Hela) por NPs CsWO₃ irradiadas con NIR con al menos 0.72 W/cm² [15, 25, 26] que está en la vecindad del límite de exposición de tejido cutáneo de longitud de onda NIR establecido por ICNRP y puede causar efectos perjudiciales para tejidos sanos bajo una duración prolongada de exposición [19]. Además, la temperatura del medio de cultivo engendrada por la combinación de dosis de tratamiento de concentración de NPs, duración de foto-exposición e intensidad óptica, en estudios previos, estaba bien por encima de 40 °C lo cual es intolerable para células humanas sanas, y las tasas de mortalidad de células cancerígenas no fueron delineadas en gran detalle.

La NP CsWO₃ es excepcionalmente absorbente en el rango de longitud de onda NIR de 800 nm hasta 2400 nm [27] y es funcionalmente adecuada para aplicación biomédica. A pesar de sus eficacias demostradas en la eliminación de células cancerígenas, la citotoxicidad sigue siendo largely unknown y la provisión de una fórmula de dosificación de concentración de NPs de baja citotoxicidad, corta duración de irradiación y densidad de potencia óptica dentro del límite de seguridad de foto-exposición para tejido cutáneo sigue faltando.

El estudio de investigación aquí intenta evaluar in vitro la factibilidad de aniquilar células cancerígenas hepáticas HepG2 cultivadas en un plato de Petri con diámetro de 5.2 cm utilizando concentración de NPs no citotóxica y densidad de potencia óptica bien dentro del límite de foto-exposición de tejido cutáneo mientras se mantiene la temperatura del medio de cultivo celular a temperatura corporal humana normal de 36.5 °C. En detalle, NPs Cs_0.33WO₃ con un tamaño de característica promedio centrado alrededor de 120 nm se sintetizaron usando una secuencia de redox, recocido térmico y procesos de molienda en húmedo, y se caracterizaron con su morfología superficial, cristalinidad, y propiedades fototérmicas ópticas y temporales. Además, se examinaron y juzgaron los efectos fototérmicos de parámetros de dosis variables, duración de irradiación, concentración de NPs y densidad de potencia óptica de irradiación NIR operando en la longitud de onda central de 980 nm, sobre la tasa de supervivencia de células cancerígenas HepG2, para idear una combinación de dosis de tratamiento segura.

Métodos

En esta investigación, la línea celular de cáncer hepático HepG2 de 102da generación derivada de tumor primario humano se cultivó como modelo experimental para evaluar la citotoxicidad impuesta por NPs Cs_0.33WO₃ caseras irradiadas con NIR y evaluar las eficacias terapéuticas de diversas dosis térmicas bien dentro del límite de seguridad para exposición de tejido cutáneo y a una concentración de NPs no tóxica.

Síntesis de NPs Cs_0.33WO₃

El panel izquierdo de la Fig. 1 ilustra el diagrama de flujo diagrammático del procedimiento de síntesis para material de óxido de tungsteno de cesio (Cs_0.33WO₃) NP. En resumen, los químicos precursores, ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, 99.9% pureza) y CsCl (Alfa Aesar, 99.9% pureza) se disolvieron por separado en 100 ml de agua DI y luego se mezclaron juntos a 25 °C bajo agitación constante a 250 revoluciones por minuto (rpm) utilizando un agitador magnéticamente actuado por una hora (hr). Después de que se terminó la agitación, la temperatura del matraz que contenía la mezcla de solución se ajustó a 180 °C y se horneó hasta que el contenido de agua de la solución se evaporó completamente. El polvo blanco seco resultante fue el precursor final del material Cs_0.33WO₃. Con el enfriador encendido, el barco de cuarzo que contenía el polvo precursor se cargó en el centro de un tubo de horno de alta temperatura, y la presión dentro del tubo de horno se llevó a 0.08 torr. Después, el precursor se calentó a 500 °C junto con la introducción de una entrada de una combinación de gases, H₂ y N₂, en una proporción de 90 a 10 centímetros cúbicos estándar por minuto (SCCM) para facilitar la reacción redox. Después de 1 h, la entrada de gas H₂ se apaga, el flujo de gas N₂ se ajusta a 100 SCCM, y la temperatura del horno se eleva a 800 °C para recocido térmico por una hora. Después de que se completaron los procesos, el enfriador y el horno controlado por temperatura se apagaron, y el barco de cuarzo se enfrió hasta que alcanzó temperatura ambiente y se retiró del tubo de horno. El polvo azul oscuro resultante obtenido del barco de cuarzo es el polvo Cs_0.33WO₃ de tamaño micrónico (µ). Para reducir aún más el tamaño de característica de los gránulos de polvo, se preparó 150 g de una solución de mezcla compuesta por 15 g de µpolvo, 3.8 g de un agente dispersante basado en copolímero para prevenir la agregación de partículas, 10 μl de agente antiespumante y agua D.I., se vertió en un cuenco de muestra que contenía 600 g de cuentas de zirconia y se montó en la cámara de un equipo de nanorrectedor (Justnanotech Co., Taiwan). Con la velocidad y temperatura establecidas a 2400 revoluciones por minuto (RPM) y 15 °C, las NPs se producen moliendo el µpolvo con cuentas ZrO₂ de 0.1 mm por 4 h, y con cuentas ZrO₂ de 0.05 mm por otras 4 h. La duración total de cada proceso de molienda no excede 4 h para evitar viscosidad excesiva del fluido así como cualquier cambio errático de los tamaños físicos del material. La solución final después del proceso de molienda se tamizó a través de un filtro de poro de 0.22 μm para toda caracterización y experimento subsiguiente. La versión fluorescente de NPs Cs_0.33WO₃ (fNPs) se hizo usando el siguiente protocolo. Se preparó una solución hecha de 2 ml de fluoresceína a concentración de 28 mg/ml y 2 ml de solución de NPs Cs_0.33WO₃ a 1.5 mg/ml en un matraz y se colocó en el cuenco de un agitador ultrasónico por 15 min. Posteriormente, la solución de NPs y el dispersante se mezclaron en una proporción de 1:1.25 y se sometieron a agitación ultrasónica por 15 min. La solución resultante se lavó luego con agua D.I. y centrifugó a 10,000 rpm por 15 min. y se repitió dos veces antes de cualquier uso.

Ilustración esquemática de procedimientos experimentales para síntesis de material, incubación celular con NPs y ensayo fototérmico sobre células cancerígenas. BCL, TEn y PD son las abreviaturas que significan lente bi-cóncava, recinto térmico y plato de Petri, respectivamente; la flecha roja indica la ubicación para la medición del perfil del haz

Caracterización de Materiales

Después, la caracterización de NPs Cs_0.33WO₃ incluyendo tamaños de característica estadísticos de NPs, estructura cristalina, morfología estructural, forma de contorno, foto-absorbancia VIS–NIR se realizó usando análisis de potencial zeta (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Germany), SEM (SU-5000, Hitachi, Japan) junto con espectrometría dispersiva en energía integrada (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan), dispersión dinámica de luz (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, U.S.A.), espectrómetro UV–VIS–NIR (V-750, Jasco, Japan), respectivamente. Los espectros XRD se adquirieron escaneando el rayo X sobre las muestras dentro de un rango angular de 20° a 80° a una tasa de escaneo de 4° por min. La señal de difracción dependiente del ángulo de escaneo desde la muestra se determinó y comparó con el espectro XRD estándar de Cs_0.32WO₃ del Comité Conjunto de Estándares de Difracción de Polvos (JCPDS) tarjeta No. 83-1334. Para confirmar la dependencia temporal de la propiedad fototérmica de la NP, se configuró un aparato experimental simple compuesto por láser NIR de 980 nm de longitud de onda y una sonda de medición de temperatura para sondear el estado de temperatura engendrado por la solución irradiada con NIR. Las soluciones de examen incluyen la solución de NPs diluida en agua D.I. y la mezcla de solución de NPs en medio de cultivo celular. El diámetro del haz óptico para muestras en platos de Petri se expandió para cubrir toda la superficie del plato de Petri, produciendo 0.05 W/cm² en densidad de potencia óptica estimada, de lo contrario permaneció intacto a 2 W/cm². Se utiliza una configuración óptica mostrada en el panel derecho de la Fig. 1 para realizar irradiación NIR. En el corazón del sistema óptico hay un haz láser NIR dirigido hacia una lente bi-cóncava que expande el diámetro del haz de 4 mm a 5.2 cm, equivalente al diámetro de superficie de un plato de Petri colocado en una placa caliente establecida a 36.8 °C, que es una temperatura fisiológica para crecimiento celular; también, el plato de Petri está rodeado por un recinto cilíndrico de plástico para ayudar a equilibrar la temperatura del ambiente y el medio. Archivo adicional 1: Fig. S1 ilustra el mapeo de intensidad óptica del haz láser NIR medido en la salida de la abertura del haz que se indica por una flecha roja junto al haz láser en la Fig. 1. El perfil del haz presenta distribución 3D de intensidad óptica y verifica la uniformidad del campo de luz sobre toda la apertura del plato de Petri.

Ensayo de Citotoxicidad y Fototérmico

Para comenzar los ciclos de cultivo celular, se prepararon 500 ml de solución de medio compuesta por 440 ml de mezcla de nutrientes Ham's F-12 y medio esencial modificado de Dulbecco's Eagle (HDMEM), 50 ml de suero fetal bovino (FBS), 5 ml de L-glutamina y 5 ml de P/S (Penicilina-Estreptomicina), que fue esterilizado por un filtro de malla con tamaño de poro de 0.22 μm. Los platos de Petri que contenían células, de 10 cm o 5.2 cm de diámetro, correspondientemente llenos con 8 ml y 2 ml de medio se usaron para cultivo primario y subcultivo e incubados en una incubadora condicionada con 5% CO₂ y a temperatura de 37 °C. La observación del crecimiento celular y una renovación del medio de cultivo se hicieron una vez cada dos días.

Para obtener las tasas de supervivencia para los casos de ensayos celulares que incluyen (1) control sin entrada externa, (2) única irradiación NIR, (3) incubación con NPs, y (4) incubación con NPs junto con una irradiación NIR posterior, el medio de cultivo en el plato de cultivo se aspiró, y 0.4 ml de tripsina se agregó al plato de cultivo y se colocó en la incubadora por unos 10 min. Una vez confirmada la desprendimiento de células de las paredes del plato, 10 μl del medio que contenía células se extrajo del plato de cultivo y se agregó a 10 μl de solución de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga, y una eliminación de NPs flotantes remanentes se hizo a través de varios lavados con solución de tampón fosfato (PBS). Después, el conteo celular se realizó llenando una placa de conteo con 10 μl de la solución celular teñida a través de un orificio de inyección, y las células pueden observarse en el plano focal de un estereomicroscopio y contarse por un contador manual; cada punto de datos presentado en todas las figuras concernientes a la tasa de supervivencia celular fue un promedio de tres ensayos experimentales (N = 3) más el margen de desviación estándar.

Para prepararse para la evaluación de la citotoxicidad de la NP y sus efectos fototérmicos en la tasa de supervivencia celular, el medio en el plato de 5.2 cm se removió, se rellenó con la cantidad adecuada de solución de NPs en el nuevo medio para hacer un array de concentraciones de prueba, 2 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1 mg/ml y 0.5 mg/ml, y luego se incubó por un día antes del experimento.

Antes del ensayo fototérmico, la evaluación de citotoxicidad se llevó a cabo para examinar la respuesta de las células a un array de concentración de NPs y se hizo como sigue. El medio que contenía las células y NPs se sacó de la incubadora y se aspiró. Un mililitro de PBS precalentado se usó para lavar las células cancerígenas y aspirar NPs CsWO₃ flotantes remanentes que no sufrieron endocitosis, el procedimiento del cual se repite varias veces para asegurar que cualquier mortalidad celular potencial no sea causada por el aumento de temperatura inducido por NPs en el nuevo medio. Después del tratamiento fototérmico, el procedimiento de conteo se implementó entonces para el ensayo de citotoxicidad y fototérmico en las células.

Resultados

La absorbancia óptica y las propiedades fototérmicas de nanomateriales Cs_0.33WO₃ dependen altamente de la estructura cristalina, temperatura de post-recocido, estequiometría atómica y tamaños de característica particulada [28, 29].

Para caracterizar la morfología superficial del µpolvo Cs_0.33WO₃, se adquirieron imágenes SEM con aumento de 10,000X para confirmación visual de la estructura icónica de hexágono columnar indicada por una flecha roja en la Fig. 2a. Además, las imágenes TEM exhiben la forma de contorno y tamaños de característica del gránulo de µpolvo en la Fig. 2b donde su tamaño de característica es alrededor de 1 μm o menos. La geometría en forma de varilla de las NPs y el histograma de distribución DLS de tamaño de característica nanoscópica centrado alrededor de 120 nm también se verificaron y se presentan en la Fig. 2c y la imagen TEM correspondiente en el recuadro. También, la caracterización cristalina del µpolvo y NPs con XRD se presenta en la Fig. 2d. Como se puede observar del espectro XRD del µpolvo en el panel superior, los planos icónicos de cristalización a lo largo de (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) y (224) coinciden bien con el espectro estándar de Cs_0.32WO₃ del Comité Conjunto de Estándares de Difracción de Polvos (JCPDS) tarjeta No. 83-1334. Cuando el tamaño de característica del µpolvo se reduce a 120 nm, las intensidades de todos los picos de difracción se reducen monótonamente, y algunos picos característicos que indican fuerte absorción NIR, como los planos (102) y (220), se enanizan invisiblemente en el espectro. Asimismo, la identificación de los constituyentes atómicos, cesio (Cs), tungsteno (W) y oxígeno (O), mostrada en la Fig. 2e, no solo confirma su presencia atómica, sino que también autentica la relación de porcentajes atómicos de Cs a W, 0.315, pareciendo estrechamente a la estequiometría inicialmente diseñada.

Caracterización física y de materiales. a SEM y b imágenes TEM del µpolvo, c histograma de distribución DLS de tamaño de característica de NPs, d espectros XRD de µpolvo y NPs de 120 nm, y e espectro EDS con porcentaje de composición atómica se presentan. Las barras de escala en a, b, c son 1.5 μm, 200 nm y 100 nm, respectivamente

Además de la caracterización de materiales, los espectros de absorbancia óptica de las NPs y la modulación fototérmica en curso de tiempo en temperatura se midieron y presentan en la Fig. 3. En (a, b), se representan la dependencia de absorbancia NIR y los perfiles de aumento de temperatura inducidos por solución de NPs irradiada con NIR en función de la concentración de NPs, donde el gráfico de temperatura en curso de tiempo de 1 mg/ml, por ejemplo, supera 40 °C, y permanece estable por al menos 1 h confirmando la estabilidad y durabilidad fototérmica de los materiales. Asimismo, el perfil de temperatura en curso de tiempo en la Fig. 3c ilustra 5 ciclos repetitivos dentro de 190 min, verificando la responsividad fototérmica del material NP. En la Fig. 3d, los perfiles de temperatura temporal del medio de cultivo y medio de cultivo incorporado con NPs, sacados de la incubadora, colocados en la placa caliente y sometidos a irradiación NIR, se estabilizan alrededor de 37 °C en el transcurso de 10 min., y la temperatura de la solución pura de NPs irradiada con NIR sube de 24.6 °C a 33.6 °C después de 10 min. Por tanto, en consideración de la funcionalidad fototérmica de la NP, la irradiación NIR para el siguiente experimento se realizó por 10 min, 30 min y 60 min, manteniendo la robustez de las NPs durante la sesión experimental y siendo potencialmente aplicable a estudios preclínicos.

Propiedades ópticas y fototérmicas. a Espectros de absorbancia óptica y los perfiles de temperatura en curso de tiempo de solución de NPs irradiada con NIR en b, c una cubeta y en d un plato de Petri se representan. El símbolo Ex simboliza los perfiles de casos de haz expandido; concentración de NPs de 1.5 mg/ml y densidad de potencia óptica de 50 mW/cm² se usaron en (d); la duración de irradiación NIR por ciclo en c es 15 min

Subsecuentemente, la dosis no tóxica de parámetros experimentales incluyendo la duración de irradiación NIR y concentración de NPs se determinó irradiando las células por 1 h y 2 h a 50 mW/cm² y a través de interacción directa con NPs de 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml y 2 mg/ml en concentración, que se representan en la Fig. 4a, b, respectivamente. La tasa de supervivencia celular permanece bien por encima del 95% en el transcurso de 2 h de irradiación NIR, confirmando no toxicidad de las células para una exposición a largo plazo al fotón de 980 nm, y también, la concentración no tóxica de NPs por debajo de 1.5 mg/ml se determinó.

Ensayo de citotoxicidad de parámetros experimentales. La tasa de supervivencia de células HepG2 cuando se dosifican con a la duración de irradiación NIR, b NPs de 120-nm de varias concentraciones se presentan. La duración de incubación de NPs fue un día; la desviación estándar de tres ensayos experimentales (N = 3) para cada punto de datos se indica

El propósito de dosificar las células cancerígenas a 1.5 mg/ml o menor, que tiene apenas efecto dañino en células HepG2, es examinar los efectos de la dosis fototérmica en las células cancerígenas sin la implicación de la toxicidad inherente de la NP. Para examinar si las NPs irradiadas con NIR pueden ser una solución viable para eliminar células cancerígenas, las células se incubaron con NPs a 1.5 mg/ml por un día, y posteriormente, se sometieron a radiación NIR por 1 h. Como se puede ver en las imágenes ópticas de campo brillante (BF) de la Fig. 5d–f, el número de células se reduce claramente cuando el tiempo de exposición dura 1 h (e) o 2 h (f). Cuantitativamente, la tasa de supervivencia disminuye monótonamente de 84.2% a 58.4% a medida que la duración de irradiación aumenta de 10 min. a 1 h, y una línea de tendencia lineal se ajusta bien entre los puntos de datos dispersos, lo que predice 20% de tasa de supervivencia cuando la irradiación dura 2 h. Además, la Fig. 5h indica que para 1 h de irradiación, la tasa de supervivencia disminuye de 73 a 58% a medida que la densidad de potencia óptica aumenta de 12.5 a 50 mW/cm², confirmando la funcionalidad de las NPs irradiadas con NIR como disparador fototérmico en la destrucción de células cancerígenas.

Ensayo fototérmico. La tasa de supervivencia de células HepG2 cuando se dosifican con concentración de NPs de 1.5 mg/ml junto con irradiación NIR. Las respectivas barras de escala en las a–c filas superiores y d–f filas inferiores de imágenes ópticas BF son 200 μm y 100 μm. La desviación estándar de tres ensayos experimentales (N = 3) para cada punto de datos se indica

Además, la incertidumbre sobre si tal acción fototérmica ocurrió de manera intracelular o extracelular se abordó preparando las fNPs, realizando el mismo procedimiento de lavado e incubación, y observando cualquier presencia intracelular de las fNPs. La Figura 6 ilustra imágenes confocal BF (b, e) y fluorescencia (a, d) y sus compuestos superpuestos (c, f) de células incubadas con y sin las fNPs. Evidentemente, las células sin incubación de fNPs como control exhiben fluorescencia verde insignificante, que se atribuye principalmente a la autofluorescencia celular, en marcado contraste con la experimental donde la distribución de fluorescencia verde es omnipresente dentro de todo el citoplasma encontrado en la imagen. Las intensidades promedio de fluorescencia en las imágenes de muestras de control y experimentales también se cuantificaron y presentan en el histograma de la Fig. 6g donde la fluorescencia de fNPs que sufrieron endocitosis es al menos nueve veces más fuerte que el control.

Imágenes confocal ópticas. La a, d fluorescencia, b, e BF y c, f imágenes ópticas compuestas de las células HepG2 incubadas con y sin las fNPs, como los grupos experimental y de control correspondientes, se presentan en las a–c filas superiores y d–f filas inferiores junto con g un histograma de las intensidades promedio de fluorescencia. Las barras de escala representan 20 μm; la longitud de onda de excitación láser es 488 nm

Discusión

El concepto de hipertermia terapéutica usando ondas electromagnéticas para curar enfermedades cancerígenas data de principios de 1900s y tuvo éxito en retroceder algunas formas de malignidades, pero sin embargo, decayó debido a la utilidad de agentes antibacterianos inductores de fiebre y la falta de accesibilidad precisa a tumores locales de interés in situ [30]. No hasta los años 1980s, el interés se revivió con varios estudios in vitro que descubrieron muchos aspectos de cambios metabólicos, alteración de microcirculación tumoral y acidólisis después del tratamiento de hipertermia produciendo efectos letales en células cancerígenas [31]. Mecanísticamente, además de citotoxicidad directa en la cual células cancerígenas sufren necrosis con una apoptosis decreciente cuando la temperatura aplicada es > 42 °C, la tasa de flujo sanguíneo reducida en asociación con menor capacidad de enfriamiento y pH bajo (< 6.8) hacen que las células cancerígenas sean más susceptibles al calentamiento y consecuentemente, una mayor tasa de muerte celular [32, 33]. Sin embargo, clínicamente, debido al inconveniente centenario de localización imprecisa no específica, la hipertermia solo encontró eficacia terapéutica mejorada cuando se aplicó concurrentemente con quimio- o radioterapias [34, 35].

Los materiales basados en NPs que permiten targeting preciso y monitoreo, y tienen una amplia gama de propiedades físicas como carga superficial, fluorescencia, conversión fototérmica, encajan perfectamente en el nicho de tal imprecisión en aplicación de hipertermia. Sin embargo, a pesar de la utilidad probada de muchos materiales NP irradiados con NIR en estudios de células cancerígenas, el límite de seguridad de foto-exposición a menudo no se examina bien como en el caso de NPs CsWO₃. Las NPs CsWO₃, aunque, como se muestra en la Fig. 4b, tiene citotoxicidad relativamente baja a 1.5 mg/ml cuando se compara con un puñado de materiales NP populares, como Ag, Au, grafeno, cuyos umbrales están en la escala de 1 μg/ml [18, 36, 37], aún requiere 0.7 W/cm² para una destrucción efectiva de células Hela a pesar de su fuerte absorción NIR en el rango de longitud de onda de 800 nm hasta 2400 nm [15, 25, 26].

Este estudio de investigación intenta idear una fórmula de dosificación térmica Cs_0.33WO₃ NP-based desencadenada por irradiación NIR efectiva para células cancerígenas HepG2 in vitro como función de concentración de NPs, duración de irradiación y densidad de potencia óptica bien dentro del límite de exposición NIR para tejido cutáneo.

El experimento comienza con la síntesis de las NPs, donde se describe un procedimiento sintético paso a paso incluyendo reacción redox, proceso de recocido y método de molienda en húmedo en la Fig. 1. La reacción redox incorpora grandes elementos ternarios, Cs en este caso, en anillos de estructura octaédrica de WO₆ en un entorno físico adecuado, permitiendo formación de estructura cristalina peculiar e incorporación de electrón libre en el compuesto molecular metálico, que es la razón intrínseca para fuerte conversión fototérmica tras absorción NIR [26, 27]. Además, los subsecuentes procesos de recocido y molienda en húmedo ayudaron a refinar la formación cristalina y reducir el tamaño de característica particulada que mejora aún más la conversión fototérmica NIR. Después, la solución de NPs sintetizada procedió con una serie de caracterización física y de material que verifica un tamaño de característica promedio de 120 nm, una optimización crítica de absorción NIR, y autentica la composición atómica (Fig. 2). Además, la medición correspondiente de potencial zeta para 0.5 mg/ml, 1 mg/ml y 1.5 mg/ml son − 53.2 mV, − 54.3 mV, − 60.1 mV. Generalmente, el proceso de endocitosis es la principal vía de entrada para la mayoría de tipos de NPs, y la tasa de captación de NPs catiónicos e iónicos para células no fagocíticas es mayor que entidades neutras, aunque el primero funciona mejor que el segundo [38]. Además, muchos reportes previos encontraron NPs cargadas negativamente menos tóxicas para células no fagocíticas [39, 40], lo cual es un mérito beneficioso cuando se considera una acumulación intracelular excesiva de NPs para dosis fototérmica acompañada con baja toxicidad.

Para establecer un tono para el ensayo fototérmico sobre células HepG2, se demostró la evaluación de la robustez de las NPs como calentador fototérmico, su estabilidad a largo plazo a temperatura de saturación en equilibrio con el ambiente por más de una hora y la repetibilidad para 5 ciclos consecutivos dentro de 3 h (Fig. 3b, c). Además, para cuantificar la efectividad de la hipertermia de la NP per se en dosificar células cancerígenas descartando la influencia de temperatura ambiente (nominalmente a 25 °C), se implementó una calibración del aparato experimental estableciendo una placa caliente a 37 °C, sobre la cual se realizaron todos los ensayos celulares, y las características fototérmicas temporales del medio de cultivo puro y medio de cultivo incorporado con NPs permanecieron a 37.1 °C (Fig. 3d). Posteriormente, se examinó por separado la dependencia de la citotoxicidad en la duración de irradiación y concentración de NPs y se presenta en la Fig. 4 indicando menos del 5% de muerte celular por más de 2 h de irradiación NIR y 1.5 mg/ml como punto pivotal hacia concentración letal. Fijando la concentración de NPs a 1.5 mg/ml, que se usó en el resto del ensayo fototérmico, la dosis térmica para hipertermia médica se definió como funciones de duración de dosificación variable y densidad de potencia óptica. La Figura 5 ilustra la acción de muerte celular con aumento bajo (a–c) y alto (d–f) cuando se implementó irradiación NIR por 0 h, 1 h y 2 h, el número aparentemente reducido en las células refleja bien el análisis cuantitativo de tasa de supervivencia celular como se muestra en (g), y la línea de tendencia lineal predice 80% de muerte celular para 2 h de irradiación. Asimismo, la disminución en la tasa de supervivencia celular tras el incremento de densidad de potencia óptica también se demuestra en (h). Por último, como se representa claramente por las imágenes BF, fluorescencia y compuestas superpuestas en la Fig. 6, en la cual se presentó un histograma de análisis de fluorescencia, se verificó la endocitosis de las fNPs.

Conclusión

En resumen, este estudio presenta síntesis y caracterización de materiales de NPs Cs_0.33WO₃, examina ensayos de citotoxicidad in vitro de la interacción directa de NPs, y por separado, con irradiación NIR, y prueba la endocitosis de las NPs así como la efectividad de las NPs irradiadas con NIR sobre la destrucción de células cancerígenas HepG2. Además, este estudio sugiere una dosis combinada de la solución de NPs Cs_0.33WO₃ irradiada con NIR para células cancerígenas HepG2, 1.5 mg/ml de concentración de NPs, la duración de irradiación entre 30 min. a 1 h, y densidades de potencia óptica de irradiación NIR bajo 50 mW/cm² que está bien por debajo del límite de seguridad de exposición NIR para tejido cutáneo mientras permite tasa de mortalidad de células cancerígenas cercana al 40% y puede ser potencialmente aplicable al desarrollo de medicina personalizada y amigable para el paciente. Tales estudios en un entorno clínico requerirán medidas adicionales como modificación de superficie con moléculas que reconocen receptores de superficie de tipos específicos de células cancerígenas.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin ninguna restricción.

Abreviaturas

NPs:

Nanopartículas

fNPs:

Versión fluorescente de nanopartículas Cs_0.33WO₃

NIR:

Infrarrojo cercano

UV–VIS–NIR:

Ultravioleta–visible–infrarrojo cercano

REDOX:

Oxidación-reducción

DLS:

Dispersión dinámica de luz

XRD:

Difracción de rayos X

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

EDS:

Espectroscopía de rayos X dispersiva en energía

RF:

Radiofrecuencia

ICNRP:

Comisión Internacional de Protección contra Radiaciones No Ionizantes

MIN:

Minutos

SCCM:

Centímetros cúbicos estándar por minuto

μ:

Micrón

RPM:

Revoluciones por minuto

JCPDS:

Comité Conjunto de Estándares de Difracción de Polvos

DI:

Desionizado

BF:

Campo brillante