Nanopartículas de albúmina sérica humana cargadas con resveratrol y dirigidas con PEG–RGD: circulación prolongada, biocompatibilidad mejorada y potente supresión de tumores pancreáticos

Resumen

La albúmina sérica humana (HSA) es un transportador natural, no inmunogénico, que puede encapsular fármacos lipofílicos y mejorar su farmacocinética. Diseñamos nanopartículas de HSA cargadas con resveratrol (RV) conjugadas con arginina–glicina–aspartato (RGD) mediante un enlazador de polietilenglicol (PEG) (NPs HRP–RGD) para lograr administración dirigida a tumores pancreáticos. Las nanopartículas presentan un diámetro uniforme de 120 ± 2,6 nm, una eficiencia de encapsulación de RV del 62,5 ± 4,21 %, y una liberación sensible al pH del 58,4 ± 2,8 % a pH 5,0 y 37 °C. Los recubrimientos de PEG y HSA mejoran notablemente la biocompatibilidad del RV. La imagen confocal muestra una captación del 47,3 ± 4,6 % de NPs HRP–RGD en células PANC‑1, superando a controles no dirigidos. In vivo, las NPs HRP–RGD prolongan la semivida del RV 5,43 veces, logrando una acumulación tumoral 3,01 y 8,1 veces superior a NPs HRP y RV libre, respectivamente. El tratamiento de ratones portadores de tumor con NPs HRP–RGD suprimió completamente el crecimiento tumoral durante 35 días, sin toxicidad sistémica. Estos datos demuestran que las NPs HRP–RGD proporcionan una plataforma robusta y biocompatible para terapia dirigida del cáncer pancreático.

Introducción

El cáncer pancreático sigue siendo una de las neoplasias más letales, con supervivencia media inferior a seis meses y tasa de supervivencia a 5 años por debajo del 6 %. Los tratamientos convencionales —cirugía, radioterapia y quimioterapia convencional— se ven obstaculizados por efectos secundarios graves y eficacia limitada. El resveratrol (RV), un polifenol natural de uvas y soja, muestra actividad anticancerígena en varios tipos de tumores, pero sufre de mala solubilidad, eliminación rápida y distribución no específica. Las estrategias de encapsulación, particularmente usando transportadores endógenos como HSA, pueden mejorar la solubilidad del fármaco, prolongar la circulación y permitir funcionalización para dirección activa. La HSA es no tóxica, no inmunogénica, y posee grupos carboxilo y amino reactivos para conjugación. La PEGilación prolonga aún más el tiempo de residencia en sangre.

Métodos

Materiales

Todos los reactivos provinieron de Sigma Aldrich, Seebio Biotech y Pierce Biotech. Se usó albúmina sérica humana (≥96 % pureza), resveratrol (≥99 %) y péptido RGD (≥97 %) sin purificación adicional.

Síntesis de nanopartículas HSA–RV

Resveratrol (6 mg en 1 mg mL⁻¹ DMSO) se mezcló con HSA (10 mg mL⁻¹) y se agitó durante 6 h a temperatura ambiente para formar coacervados. El entrecruzamiento con glutaraldehído al 0,5 % (100 µL) seguido de diálisis produjo NPs HSA–RV. NPs en blanco se prepararon idénticamente sin RV.

Conjugación de PEG–RGD y formación de NPs HRP–RGD

PEG‑2000‑COOH se activó con SATA y se acopló a RGD en presencia de EDC, formando SATA‑PEG‑RGD. Tras reducción con hidroxilamina, el producto se purificó y reaccionó con NPs HSA–RV activadas con SPDP para obtener NPs HRP–RGD. Los reactivos en exceso se eliminaron por diálisis y filtración.

Caracterización

• Tamaño y polidispersidad: Difusión dinámica de luz (DLS) y SEM.
• Carga de fármaco: Espectrofotometría UV–Vis a 306 nm.
• Cinética de liberación: Bolsa de diálisis (COPM 8–12 kDa) en PBS a pH 5,0, 6,5, 7,4, 9,0, 37 °C.

Biocompatibilidad y hemólisis

Los eritrocitos se incubaron con NPs HRP–RGD (10–200 µg mL⁻¹) durante 3 h a 37 °C. Los ratios de hemólisis se calcularon frente a PBS (control negativo) y agua desionizada (control positivo).

Estudios celulares

Células PANC‑1 se cultivaron en DMEM con 10 % FBS. NPs HRP–RGD marcadas con FITC se incubaron durante 5 h, seguido de imagen confocal y citometría de flujo para evaluar captación. La citotoxicidad se evaluó mediante ensayo CCK‑8 en concentraciones de 0–200 µg mL⁻¹. La morfología apoptótica se confirmó con tinción Hoechst 33258.

Experimentos en animales

Ratones Balb/c nu/nu se inyectaron subcutáneamente con 1 × 10⁶ células PANC‑1. Cuando los tumores alcanzaron ~80 mm³, los ratones se aleatorizaron (n = 5) en grupos: suero salino, RV, NPs HRP, o NPs HRP–RGD (10 mg kg⁻¹ equivalente RV). El volumen tumoral y peso corporal se monitorizaron cada 3 días durante 35 días. La biodistribución se evaluó a 24 h mediante análisis UV–Vis de tejido tumoral. La histopatología de órganos principales se realizó post-mortem.

Resultados y Discusión

Fabricación y propiedades fisicoquímicas de nanopartículas

Las NPs HRP–RGD mostraron una distribución de tamaño estrecha y unimodal (120 ± 2,6 nm) con morfología esférica homogénea. Los espectros UV–Vis confirmaron la encapsulación de RV, mientras que la emisión de fluorescencia a 325 nm corroboró la retención de RV dentro de las partículas.

Carga de fármaco y liberación sensible al pH

La eficiencia de encapsulación alcanzó un máximo del 62,5 ± 4,21 %. Los estudios de liberación mostraron una liberación acumulada del 58,4 ± 2,8 % tras 60 h a pH 5,0, comparado con tasas significativamente menores a pH fisiológico, destacando la liberación específica en tumor.

Estabilidad y biocompatibilidad mejoradas

A diferencia del RV libre cristalino, las NPs HRP–RGD permanecieron coloidalmente estables en PBS, DMEM y FBS durante 4 semanas. La intensidad de fluorescencia permaneció >96 % tras 4 semanas, mientras que el RV libre cayó al 12 %. Los ensayos de hemólisis revelaron <5 % hemólisis hasta 200 µg mL⁻¹, igualando controles de PBS.

Captación celular dirigida

La citometría de flujo cuantificó una captación del 58,5 ± 3,5 % de NPs HRP–RGD por células PANC‑1, marcadamente superior a NPs HRP no dirigidas (16,2 ± 4,9 %) y controles con bloqueo de RGD (7,1 ± 5,1 %). La imagen confocal corroboró la entrega intracelular eficiente.

Potente actividad antitumoral in vitro

Las NPs HRP–RGD exhibieron citotoxicidad dependiente de dosis, reduciendo la viabilidad de PANC‑1 a <30 % a 50 µg mL⁻¹, superando al RV libre y NPs HRP. La tinción Hoechst reveló condensación nuclear apoptótica característica.

Circulación prolongada y acumulación tumoral

Las NPs HRP–RGD extendieron la semivida plasmática del RV a 6,57 ± 0,9 h (frente a 1,21 ± 0,09 h para RV libre). A 24 h, el contenido de RV en tumor en el grupo HRP–RGD fue 3,01 y 8,1 veces superior a NPs HRP y RV libre, respectivamente, indicando dirección efectiva mediante efecto EPR y mediada por RGD.

Supresión tumoral in vivo y seguridad

El tratamiento con NPs HRP–RGD detuvo completamente el crecimiento tumoral durante 35 días, sin recaída. Los pesos corporales permanecieron estables en todos los grupos. La histología de corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón no mostró cambios patológicos, confirmando seguridad sistémica.

Conclusiones

Las NPs HRP–RGD representan una plataforma clínicamente relevante que supera las limitaciones de solubilidad, farmacocinética y dirección del resveratrol libre. Al combinar encapsulación en HSA, PEGilación y dirección con RGD, estas nanopartículas logran circulación sostenida, acumulación específica en tumor y eficacia antitumoral robusta con toxicidad mínima. Este estudio apoya su desarrollo posterior como modalidad terapéutica potente para cáncer pancreático.

Abreviaturas

• CCK‑8: Kit de Conteo Celular‑8
• FBS: Suero Fetal Bovino
• FITC: Fluoresceína Isotiocianato
• HSA: Albúmina Sérica Humana
• PEG: Polietilenglicol
• RGD: Arginina–Glicina–Aspartato
• RV: Resveratrol
• PBS: Salino Fosfato Amortiguado