Entrega dirigida contra el cáncer: decoración de nanovesículas con pHLIP para reconocimiento del microambiente tumoral ácido

Resumen

La acidez en la superficie de células cancerosas es una característica de los microambientes tumorales, que no depende de la perfusión del tumor, por lo que puede servir como biomarcador general para dirigir células tumorales. Usamos el péptido de inserción a pH bajo (pHLIP) para decorar liposomas y niosomas. pHLIP detecta el pH en la superficie de células cancerosas e inserta en la membrana de células objetivo, llevando nanomaterial a proximidad cercana de la membrana celular. Liposomas DMPC y niosomas Tween 20 o Span 20 con y sin pHLIP en su recubrimiento fueron completamente caracterizados para obtener comprensión fundamental sobre características de nanovehículos y facilitar el diseño racional de nanovectores sensibles a la acidez. Se demostró la estabilidad de las muestras a lo largo del tiempo y en presencia de suero. Se investigaron el tamaño, potencial ζ, y morfología de los nanovectores, así como su capacidad para encapsular una sonda hidrofílica y modular su liberación. Las vesículas decoradas con pHLIP podrían ser útiles para obtener liberación prolongada (modificada) de sustancias biológicamente activas para dirigir tumores y otros tejidos enfermos ácidos.

Introducción

Hace aproximadamente un siglo, Paul Ehrlich propuso la idea de realizar "balas mágicas" para entrega específica y más efectiva de fármacos [1]. Las "balas mágicas" deberían proteger el fármaco entregado de un entorno hostil, disminuir efectos secundarios dirigiendo el fármaco a tejido enfermo, mejorar farmacocinética y farmacodinámica del fármaco, y modular su liberación [2].

En 1965, Bangham observó vesículas basadas en fosfolípidos por primera vez [3] y, en años siguientes, Gregory Gregoriadis estableció el concepto de que los liposomas podían encapsular fármacos y usarse como sistemas de liberación. En particular, están compuestos por bicapas cerradas de fosfolípidos (lamelas), donde las cadenas lipofílicas de lípidos están cerradas entre dos capas de grupos cabeza hidrofílicos. La bicapa cerrada rodea un núcleo acuoso, permitiendo la localización de fármacos lipofílicos o hidrofílicos respectivamente [4, 5].

El tamaño del liposoma es parámetro crítico influyendo en el destino del transportador tras administración, en términos de absorción de proteínas plasmáticas, reconocimiento por sistema reticuloendotelial (RES), tiempo de vida medio en circulación, y tráfico celular. Transportadores nanométricos pueden favorecer internalización celular y dirección a tumores, por lo que muchos investigadores se han centrado en la "nanonización" [6-9].

Para obtener nanovehículos más versátiles y económicos, se han empleado surfactantes sintéticos para obtener sistemas de liberación tipo liposoma. Los surfactantes no iónicos son ampliamente usados para este propósito, y pueden autoensamblarse en vesículas unilamelares o multilamelares (liposomas no iónicos, niosomas, o vesículas de surfactante no iónico). Los surfactantes ésteres de sorbitano (Spans®) son sustancias lipofílicas ampliamente usadas en preparación de niosomas. Para prolongar el tiempo de circulación de las vesículas y obtener nanovehículos "sigilosos", la incorporación de polietilenglicol (PEG) es enfoque estándar de oro: mediante esta conjugación, se obtienen surfactantes ésteres de sorbitano etoxietilados (Tweens®). Tanto Span como Tween se caracterizan por diferente valor de balance hidrofílico/lipofílico (HLB) y la elección del surfactante permite preparar niosomas con propiedades deseadas [10]. Además, la adición de colesterol se usa para mejorar la estabilidad de la bicapa estirando las colas del surfactante, afectando la temperatura de transición de fase gel-líquido del surfactante y confiriendo rigidez a la bicapa lipofílica [11, 12]. El nanovehículo "optimizado" se diseña para mejorar formulación y/o mejorar dirección [10].

Hoy en día, el cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo. Enfoques terapéuticos actuales tienen limitaciones incluyendo entrega no eficiente de fármacos a tumores y falta de dirección tumoral asociada con efectos secundarios indeseables y peligrosos, que enfoques de nanotecnología podrían ayudar a superar [13].

Actualmente, diversos enfoques de dirección están en desarrollo. La mayoría se basan en dirección de biomarcadores particulares sobreexpresados en superficie de células cancerosas. Sin embargo, debido a que los tumores humanos son muy heterogéneos, enfoques más generales de dirección tumoral serán mucho más ventajosos. La acidez en la superficie de células cancerosas es una característica de microambientes tumorales, y no depende de la perfusión del tumor, por lo que puede servir como biomarcador general para dirigir células tumorales [14]. La tecnología pH (bajo) de inserción péptido (pHLIP) se desarrolla rápidamente para dirigir imagen y moléculas terapéuticas pequeñas, así como nanomateriales a tumores. pHLIP detecta pH en superficie de células cancerosas e inserta en membrana de células objetivo [15, 16]. El mecanismo de inserción de pHLIP es desencadenado por protonación de residuos cargados negativamente del péptido a pH bajo (pH < 7,0). Esto lleva a aumento de hidrofobicidad del péptido desplazando el equilibrio hacia partición del péptido en la bicapa [17]. Nanovehículos decorados con pHLIPs son biocompatibles, pueden dirigir tumores, y demuestran internalización celular mejorada por células cancerosas. Entre nanopartículas recubiertas con pHLIP investigadas están nanomateriales basados en lípidos, polímeros y metales [18-21].

El objetivo del presente trabajo es caracterizar completamente nuevos nanovehículos vesiculares decorados por pHLIP para obtener comprensión fundamental sobre características de nanovehículos y facilitar el diseño racional de nanovectores sensibles a la acidez.

Materiales y Métodos

Materiales

Polioxietilensorbitano monolaurato (Tween 20), sorbitano monolaurato (Span 20), colesterol (Chol), sal Hepes {N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etanosulfónico ácido)}, suero humano, Sephadex G-75, calceína, y difenilhexatrieno (DPH) se compraron de Sigma-Aldrich. 1,2-Dimistoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] sal sódica (DSPE-maleimida) se compraron de Avanti Polar Lipids y pireno de Fluka. Péptido pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) fue sintetizado y purificado por CS Bio. Todos los demás productos y reactivos fueron de grado analítico.

Síntesis de DSPE-pHLIP

pHLIP se conjugó con lípidos DSPE en metanol por conjugación covalente de DSPE-maleimida con el único residuo de cisteína en el N-termino de pHLIP, como se describió previamente [18, 21, 22]. Brevemente, 5 mg de péptido disueltos en 250 μL metanol (soplado con argón) y DSPE-maleimida (de solución stock 9,9 mM) disuelta en cloroformo se mezclaron en ratio molar 1:1. La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente por 2-6 h hasta completar la conjugación. El progreso de la conjugación de DSPE-maleimida con pHLIP se monitorizó por RP-HPLC usando gradiente de 25 a 80 % acetonitrilo en agua con 0,05 % TFA monitoreando disminución del pico correspondiente a pHLIP sin etiquetar en la mezcla. El conjugado sintetizado se caracterizó por espectrometría de masas SELDI-TOF. La concentración de conjugado DSPE-pHLIP se determinó por absorbancia usando coeficiente de extinción molar para pHLIP: ε₂₈₀ = 13.940 M⁻¹ cm⁻¹.

Preparación y Purificación de Vesículas

El método de evaporación de capa delgada se usó para preparar vesículas de surfactante no iónico (de Tween 20 o Span 20) y fosfolípido (de DMPC), con y sin pHLIP. En cada formulación de vesícula, colesterol se añadió en diferentes ratios molares (Tabla 1) [23].

La composición de muestra se optimizó eligiendo estructuras bien caracterizadas previamente [24, 25] a las que se añadió la misma cantidad de pHLIP.

Los componentes lipofílicos se disolvieron primero en mezcla CHCl₃:CH₃OH (3:1); el disolvente orgánico se eliminó luego bajo vacío a diferentes temperaturas según la muestra. La película obtenida se hidrató con 5 mL de tampón Hepes (0,01 M pH 7,4) o solución de calceína sódica 10⁻² M. La suspensión se vortex-mezcló por ~5 min, seguida de sonicación (ver Archivo adicional 1: Tabla S1, información de apoyo) usando micro-sonda operando a 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). La sonicación de LipoDMPC se realizó bajo atmósfera inerte para prevenir oxidación.

La suspensión de vesículas se purificó luego por cromatografía de permeación en gel usando Sephadex G-75 (columna de vidrio 50 × 1,2 cm) y tampón Hepes como eluyente. Después, la suspensión de vesículas purificada se filtró mediante filtros de celulosa con diámetro de poro apropiado.

El mismo método de preparación se usó para preparar niosomas y liposomas recubiertos con pHLIP.

Mediciones de Dispersión Dinámica de Luz

El tamaño promedio y distribución de tamaño de las vesículas se midieron a T = 25 °C por dispersión dinámica de luz (DLS), usando Malvern NanoZetaSizer ZS90, equipado con láser HeNe de 5 mW (longitud de onda λ = 632,8 nm) y correlacionador digital. Las funciones de autocorrelación normalizadas de la intensidad dispersada a ángulo de 90° se analizaron por algoritmo Contin para obtener distribución del coeficiente de difusión D de las partículas, y por tanto distribución del radio hidrodinámico efectivo R_H de las vesículas vía relación Stokes-Einstein R_H = K_B T/6πηD, donde K_B T es la energía térmica y η la viscosidad del disolvente. El ancho de la distribución de tamaño de niosomas/liposomas es pequeño pero no despreciable. Los valores reportados en Tabla 2 corresponden al diámetro hidrodinámico promedio ponderado por intensidad de las partículas [26].

Mediciones de Potencial ζ

Las mediciones de movilidad electroforética se realizaron por técnica de electroforesis láser Doppler, usando aparato Malvern NanoZetaSizer ZS90. La movilidad u se convirtió en potencial ζ usando relación de Smoluchowski ζ = uη/ε, donde η y ε son la viscosidad y permitividad de la fase disolvente, respectivamente [27].

Dispersión de Rayos X a Pequeño Ángulo

Experimentos de dispersión de rayos X a pequeño ángulo (SAXS) se realizaron en European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, Francia). El uso de la línea de haz ID02 de alto brillo permitió realizar medidas en soluciones diluidas en región de transferencia de momento 0,1 nm⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm⁻¹, q = (4π/λ)sen(θ/2), donde θ es ángulo de dispersión y λ = 0,1 nm la longitud de onda de rayos X. La escala de longitud investigada está entre 1 y 60 nm, adecuada para acceder a estructura interna de vesículas niosomales y liposomales. Todos los experimentos se realizaron a T = 25 °C con tiempo de irradiación corto, 0,1 s, para prevenir daño por radiación. Para cada muestra, la intensidad dispersada a diferentes ángulos fue capturada en detector 2D, luego reagrupada angularmente, restada por contribuciones de fondo y disolvente, y analizada para obtener información sobre forma y estructura interna de vesículas en solución.

En caso de vesículas unilamelares, la bicapa cerrada se modeló con tres capas concéntricas correspondientes a grupos cabeza externos, cadenas hidrofóbicas, y grupos cabeza internos. Se asumió distribución de Schulz para el tamaño de vesícula.

Cryo-TEM

Solución de vesícula (gota de 5 μL) se extendió en rejilla de microscopía electrónica Lacey formar/carbono y se preservó en estado vitrificado-hidratado por congelación rápida en etano líquido. El proceso de vitrificación se realizó usando sistema FEI Vitrobot con configuración de un solo secado de 3 s, offset de 1, y tiempo de drenaje y espera de 1 s. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) (JEOL 2100) con voltaje de aceleración 200 kV en aumentos de ×10.000 a ×150.000 se usó para imaginar vesículas.

Estudios de Estabilidad

Estudios de estabilidad física de niosomas y liposomas, preparados con y sin pHLIP, se realizaron a dos temperaturas de almacenamiento (25 °C y 4 °C). El objetivo era evaluar si ocurren cambios significativos en tamaño y potencial ζ de la dispersión de vesículas en período de 90 días. Muestras de cada lote se retiraron en intervalos definidos (1, 30, 60, y 90 días) y se determinaron tamaño y potencial ζ de las vesículas como se describió.

Similarmente, la estabilidad de las muestras se investigó también en presencia de fluidos biológicos, como suero humano. Las suspensiones se contactaron con 45 % de suero humano a 37 °C. En intervalos definidos (0, 30 min, 1 h, 2 h, y 3 h), variaciones en tamaño y potencial ζ de vesículas se determinaron como se describió.

Caracterización de Bicapa

La fluidez y microviscosidad-polaridad de bicapas niosomales y liposomales se accedieron por mediciones de fluorescencia de dos sondas fluorescentes, difenilhexatrieno (DPH) y pireno, respectivamente, localizadas en región hidrofóbica de la membrana bicapa. Tanto DPH (2 mM) como pireno (4 mM), 220 μL y 2,5 mg respectivamente, se añadieron a la mezcla de surfactante o fosfolípido/colesterol antes de preparación de vesículas [28]. Después, vesículas cargadas con pireno se purificaron como se describió, mientras vesículas cargadas con DPH se filtraron a través de poros progresivamente menores (de 5,0 a 0,22 μm).

Las mediciones de anisotropía de fluorescencia se realizaron a temperatura ambiente usando espectrofluorómetro LS55 (PerkinElmer, MA, USA) a λ_exc = 400 nm y λ_em = 425 nm y la anisotropía de fluorescencia (A) de las muestras se calculó según la ecuación [29]:

$$ A=\frac{I_{vv}-I_{vh} \times G}{I_{vv}+2I_{vh} \times G} $$

donde I_vv e I_vh son las intensidades de fluorescencia emitida (unidades arbitrarias), respectivamente, paralela y perpendicular a la dirección de la luz de excitación polarizada verticalmente. El factor de corrección G = I_hv/I_hh es la relación entre componentes de emisión polarizada vertical y horizontalmente cuando la luz de excitación es polarizada horizontalmente. Los valores de anisotropía de fluorescencia son inversamente proporcionales a la fluidez de membrana. Por tanto, alto valor de anisotropía corresponde a alto orden estructural y/o baja fluidez de membrana [30].

Para evaluar microviscosidad y micropolaridad de la bicapa de vesícula, experimentos de fluorescencia con pireno se realizaron con espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS55 a λ_exc = 330 nm, registrando espectro de emisión en rango 350 < λ_em < 550 nm [28]. La estructura fina de fluorescencia de pireno presenta cinco picos. La relación entre intensidades de la primera (372 nm) y tercera (382 nm) bandas vibracionales del espectro de fluorescencia de pireno, I₁/I₃, está relacionada con la polaridad del entorno de pireno [31]. En efecto, valores bajos de relación I₁/I₃ corresponden a entorno no polar. Además, moléculas de pireno incorporadas en bicapa de vesícula pueden formar excímeros intramoleculares y este proceso es sensible a la viscosidad del microentorno de la sonda [32]. Por tanto, la relación de intensidad de fluorescencia excímero/monómero, I_E/I_M, está relacionada con microviscosidad.

Estos estudios se realizaron en vesículas preparadas tanto con como sin pHLIP y los resultados obtenidos se compararon.

Estudios de Liberación de Calceína

Vesículas de surfactante no iónico o fosfolípido se cargaron con calceína a concentración 10⁻² M. A esta concentración, la fluorescencia de calceína es auto-amortiguada [33]. Medidas de desamortiguamiento se usaron para determinar liberación de calceína del núcleo acuoso de la vesícula. La sonda fluorescente se cargó en las vesículas durante hidratación de la película delgada por adición de 5 mL de solución acuosa de calceína. Las suspensiones de vesículas se purificaron por cromatografía de permeación en gel, contactaron con 45 % suero humano o Hepes, y luego se cargaron dentro de bolsa de diálisis de membrana de celulosa (corte peso molecular 8.000 Da de Spectra/Por®). Los experimentos de liberación se realizaron a 37 °C, bajo agitación magnética en tampón Hepes (10 mM, pH 7,4) como medio externo. Alícuotas del medio externo se retiraron en diferentes tiempos sobre 0-24 h. De vez en cuando, las alícuotas retiradas se reintrodujeron en el sistema [34].

La liberación de calceína se monitorizó midiendo fluorescencia del medio usando espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS50B con λ_ex = 492 y λ_em = 520 nm. El valor de referencia F_∞ (unidades arbitrarias), correlacionado a cantidad total de calceína atrapada en vesículas [35], se determinó tras disrupción de vesículas usando alcohol isopropílico (1:1 v/v). Los porcentajes de liberación (F%) en cada punto de tiempo se obtuvieron usando la ecuación:

$$ F\% = \frac{F_t}{F_{\infty}} \times 100 $$

donde F_t (unidades arbitrarias) es la fluorescencia leída en punto de tiempo específico t.

Análisis Estadístico

ANOVA de una vía se usó para análisis estadístico. Prueba t de Bonferroni a posteriori se realizó para evaluar significancia estadística de prueba ANOVA. Valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Resultados son promedio de tres experimentos ± desviación estándar.

Resultados y Discusión

Vesículas Tween20-, Span20-, y DMPC-, preparadas con y sin DSPE-pHLIP, fueron caracterizadas para tamaño y potencial ζ (Tabla 2).

Según resultados en Tabla 2, las muestras analizadas no muestran variaciones significativas en tamaño ni potencial ζ, independientemente de la presencia de pHLIP.

Los rangos de tamaño reportados fueron confirmados mediante técnica de análisis diferente, como cryo-TEM (Fig. 1).

Imágenes representativas cryo-TEM de niosomas y liposomas recubiertos con pHLIP. Imágenes de niosomas NioSpan20-pHLIP (a) y liposomas LipoDMPC-pHLIP (b) obtenidas a ×10.000 aumentos y liposomas LipoDMPC-pHLIP (c) a ×40.000 aumentos

La estructura interna de niosomas/vesículas con y sin DSPE-pHLIP se determinó por experimentos SAXS. Los espectros de intensidad SAXS, presentados en Fig. 2, son diferentes, indicando que cada sistema tiene características peculiares.

Espectros SAXS. Espectros de intensidad de niosomas/vesículas sin (símbolos abiertos negros) y con DSPE-pHLIP (símbolos de color)

Los niosomas basados en Tween20 son unilamelares, mientras que vesículas DMPC muestran cierto grado de multilamelariedad (como liposomas), como muestra la presencia del pico característico en q ≅ 1 nm⁻¹, correspondiente a distancia interlamelar de 6 nm (aproximadamente 5 nm bicapa lipídica y 1 nm agua). Las vesículas basadas en Span20 son definitivamente multilamelares, con pico característico en q = 1,6 nm⁻¹ correspondiente a distancia interlamelar de 3,8 nm, coincidiendo con el doble de longitud de molécula Span20. Resultados indican que la cubierta multicapa de vesículas Span20 está compuesta de bicapas adyacentes con casi nada de agua interlamelar.

La presencia de DSPE-pHLIP (menos de 1 % fracción molar) no afecta dramáticamente los sistemas. La intensidad dispersada en todo el rango q investigado es bastante similar, indicando fracción comparable de material estructurado y tamaño general comparable de partículas vesiculares.

Las vesículas basadas en DMPC muestran ligero aumento en número de bicapas dentro del liposoma, deducible por aumento de intensidad del pico de Bragg en q = 1 nm⁻¹. La inserción de baja fracción de cadenas DSPE C18, unidas a cada molécula de péptido, no cambia el espesor de la bicapa lipídica, dictado principalmente por la gran fracción de colesterol respecto a DMPC (aproximadamente 40-50 %). A esta concentración de colesterol, las cadenas lipídicas están organizadas en fase líquido-ordenada (Lo), caracterizada por desacoplamiento del débil orden posicional lateral de las cadenas respecto al alto orden orientacional a lo largo de las cadenas y capaces de alojar pocas cadenas C18 sin cambio estructural [36]. También vesículas multilamelares basadas en Span20 no muestran cambios en su estructura interna.

En el sistema Tween20 + pHLIP, hay pequeña cantidad de cristalitos de colesterol, como muestra el pico agudo típico en q = 1,84 nm⁻¹ (distancia característica de 3,41 nm), y la estructura de vesícula no se ve afectada. La presencia de pocos microcristalitos se ha encontrado a menudo asociada con niosomas basados en Tween [37] en cantidad dependiente de composición, procedimiento de preparación y purificación. En Fig. 2, los dos espectros experimentales de Tween20 y Tween20 + pHLIP se muestran junto con curvas de ajuste obtenidas modelando la bicapa cerrada esféricamente con tres capas concéntricas: grupos cabeza externos, cadenas, y grupos cabeza internos. El tamaño promedio de ajuste de vesículas es ~168 nm en ambos sistemas, en concordancia con resultados DLS. Parámetros estructurales son los mismos para las dos bicapas cerradas (ver Archivo adicional 1: Figura S1 y Tabla S2) excepto para la capa externa: en presencia de DSPE-pHLIP, se observa ligera disminución (5 %) de la densidad electrónica de los grupos cabeza (de 0,42 a 0,40 e/ų), junto con aumento de rugosidad de la capa. Este resultado indica que adición de DSPE-pHLIP afecta principalmente la capa externa de las vesículas. Esto es consistente con una imagen donde las cadenas C18 de DSPE se insertan en la bicapa y anclan el péptido a la superficie de la vesícula, entre los grupos cabeza de polietilenglicol extendidos y ramificados. Notamos que la capacidad del péptido pHLIP en sí (no unido a moléculas lipídicas) para interactuar con superficie externa de vesículas a pH alto e insertar en bicapa a pH bajo ha sido observada recientemente por SAXS en caso de bicapas de fosfolípidos insaturados [38]. En el presente estudio, la fracción molar de péptido es significativamente menor y el péptido está unido a lípidos, ya que el objetivo es diseñar nanovectores de fármacos sensibles a pH recubiertos con pHLIP. La asociación de pHLIP es impulsada por interacción hidrofóbica de las cadenas C18 de DSPE conjugadas insertando en región hidrofóbica del nanovector. El péptido pHLIP está anclado y yace en región de grupos cabeza externos, propenso a interactuar con membranas objetivo a pH ácido y/o liberar contenido del nanovector tras reorganización de bicapa en entorno de pH bajo.

Para investigar si la presencia de pHLIP podría afectar propiedades microreológicas de la bicapa (fluidez, microviscosidad y polaridad), se realizó caracterización de capa lipofílica. Los estudios de caracterización se realizaron usando sonda fluorescente pireno, añadida a las muestras al inicio del procedimiento de preparación. Debido a su naturaleza lipofílica, se inserta en la bicapa de vesícula y proporciona información sobre polaridad y microviscosidad del entorno de membrana.

Como se muestra en Tabla 3, en los tres conjuntos de muestras, los valores de polaridad disminuyen ligeramente en presencia de pHLIP comparado con vesícula contraparte sin pHLIP, mientras los valores de microviscosidad muestran aumento triple, para todas las vesículas.

La bicapa se caracterizó además por mediciones de anisotropía de fluorescencia de otra sonda fluorescente lipofílica, DPH, incorporada en lípidos. Estas mediciones reflejan movimiento de la sonda y su orientación dentro de la bicapa dando información sobre fluidez de bicapa que puede afectar capacidad de vesículas para liberar su contenido [29]. Los valores de anisotropía de fluorescencia son inversamente proporcionales a la fluidez de membrana. Por tanto, alto valor de anisotropía corresponde a alto orden estructural y/o baja fluidez de membrana, como en fase líquido-ordenada [30].

Los valores de anisotropía para cada muestra se muestran en Tabla 3. Los datos indican que la presencia de DSPE-pHLIP en las vesículas aumenta fluidez de membrana, ya que la anisotropía de fluorescencia disminuyó. Es bien conocido que la fluidez de bicapa se ve afectada no solo por orden y organización lateral de cadenas apolares sino también por grupos cabeza polares [31]. Resultados SAXS en los tres sistemas muestran que moléculas DSPE-pHLIP afectan principalmente región de grupos cabeza, eventualmente causando diferente empaquetamiento de cabezas polares. Resultados estructurales parecen coincidir con propiedades microreológicas de bicapas en presencia de DSPE-pHLIP asociado reveladas por inserción de dos sondas diferentes. Resultados muestran microviscosidad aumentada revelada por pireno, sonda que podría insertar cerca de región externa (log P de pireno es 4,88). Por otro lado, DPH se asume incrustado en el núcleo de las bicapas, orientado paralelo al eje de cadena acilo de lípido o restringido en centro de bicapa, paralelo a la superficie. Es largamente sensible a la reorientación angular de cadenas acilo de anfifilos [39]. La fluidez aumentada, revelada por DPH, podría relacionarse tanto con efecto de inserción de cadenas DSPE entre otras cadenas acilo como con efecto de partición de pHLIP en región de grupos cabeza polares, cambiando propiedades de empaquetamiento de surfactantes. (Fig. 3).

Representación de interacciones de pHLIP con membrana de vesícula

Estudios de caracterización adicionales se realizaron en los preparados examinados. Todas las muestras, preparadas con y sin pHLIP, se almacenaron por 90 días a 4 °C para evaluar estabilidad de vesículas a lo largo del tiempo, midiendo variaciones en tamaño y potencial ζ (Archivo adicional 1: Figura S2). No se observaron variaciones significativas en tamaño y potencial ζ a lo largo del experimento; por tanto, todos los preparados examinados resultaron estables si se almacenan a 4 °C.

Además, la estabilidad de las muestras se examinó en presencia de 90 % (v/v) suero humano y almacenadas a 37 °C por 3 h (Archivo adicional 1: Figura S3).

En contacto con suero humano, vesículas Tween20 mostraron aumento en tamaño, aunque permanecieron bajo 300 nm. El tamaño y valores PDI se midieron constantes a lo largo del experimento de 3 h, sugiriendo que las vesículas en suspensión permanecieron intactas durante todo el experimento.

Ambas muestras Span20 en contacto con suero humano mostraron aumento en tamaño, especialmente en preparación con pHLIP, mientras valores PDI sugieren distribución de tamaño homogénea (datos no mostrados). Este evento puede deberse a absorción de proteínas plasmáticas en superficie niosomal, como resultado de interacciones electrostáticas, sin incurrir en disrupción de vesículas. Esta hipótesis es apoyada por disminución de potencial ζ tras contacto de vesículas con suero humano. Este fenómeno ocurre cuando el potencial ζ alcanza valores ligeramente negativos, alrededor de región de neutralidad, haciendo el sistema inestable, y las vesículas comienzan a agregarse.

Al igual que Tween20, vesículas DMPC muestran aumento en tamaño comparado con muestra pre-contacto. Sin embargo, esta variación resultó no significativa y los valores de tamaño se mantuvieron bajo 280 nm (DMPC) o bajo 240 nm (DMPC + pHLIP).

La capacidad de liberación se evaluó para muestras preparadas con y sin pHLIP siguiendo cantidad de calceína (sonda hidrofílica) liberada de las vesículas a lo largo del tiempo.

Los estudios se realizaron a temperatura de 37 °C por período de 24 h, exponiendo muestras purificadas con tampón HEPES o suero humano. Como se muestra en Fig. 4, perfiles de liberación de calceína resultan muy similares para tanto Tween20 como Tween20-pHLIP en tampón HEPES o suero humano.

Perfil de liberación de calceína. NioTween20 y NioTween20-pHLIP contactados con tampón HEPES (a) o suero humano (b)

La cantidad liberada de calceína estuvo entre 30 y 50 % indicando ninguna diferencia en capacidades de liberación entre muestras preparadas con y sin pHLIP.

Mismos resultados se obtuvieron para muestras Span y DMPC (datos no mostrados).

Perfiles de liberación comparables se han reportado para diferentes nanovehículos responsivos a estímulos, como cubosomas termosensibles [40] o nanovehículos autoensamblados poliméricos (SANs) [41, 42].

En conclusión, las diferencias fisicoquímicas observadas en términos de microviscosidad y fluidez para muestras preparadas con y sin pHLIP (Tabla 3) no afectan sus capacidades de liberación (Fig. 4), de acuerdo con evidencia de que inserción de moléculas DSPE-pHLIP afecta principalmente región de grupos cabeza. Estos datos concuerdan con resultados previos reportados mostrando que a pH neutro y alto, pHLIP está unido a superficie de liposomas hechos por 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) y no induce fusión ni fuga de membrana.

Conclusión

Este estudio confirma la posibilidad de preparar vesículas decoradas con pHLIP. Las muestras son estables si se almacenan a 4 °C por al menos 3 meses y en presencia de suero. Además, los nanovectores propuestos son capaces de encapsular una sonda hidrofílica y modular su liberación.

Las vesículas pHLIP fueron completamente caracterizadas para obtener comprensión fundamental sobre características de nanovehículos y facilitar el diseño racional de nanovectores sensibles a la acidez.

La asociación de pHLIP es impulsada por interacción hidrofóbica de las cadenas C18 de DSPE conjugadas insertando en región hidrofóbica del nanovector. El péptido pHLIP está anclado y yace en región de grupos cabeza externos, propenso a interactuar con membranas objetivo a pH ácido y/o liberar contenido del nanovector tras reorganización de bicapa en entorno de pH bajo.

Según estos hallazgos, las vesículas decoradas con pHLIP propuestas podrían ser útiles para obtener liberación prolongada (modificada) de sustancias biológicamente activas para dirigir tumores y otros tejidos enfermos ácidos.

Abreviaturas

Chol:

Colesterol

Cryo-TEM:

Microscopía electrónica de transmisión criogénica

DLS:

Dispersión dinámica de luz

DMPC:

1,2-Dimistoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DPH:

Difenilhexatrieno

pHLIP:

Péptido de inserción a pH bajo

SAXS:

Dispersión de rayos X a pequeño ángulo

Span20:

Sorbitano monolaurato

Tween20:

Polioxietilensorbitano monolaurato