Decoración de nanovesículas con péptido de inserción de pH (bajo) (pHLIP) para entrega dirigida

Materiales y métodos

Materiales

Monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20), monolaurato de sorbitán (Span 20), colesterol (Col), sal de Hepes { N - (2-idroxietil) piperazina- N ′ - (ácido 2-etanosulfónico)}, suero humano, Sephadex G-75, calceína y difenilhexatrieno (DPH) se adquirieron de Sigma-Aldrich. 1,2-Dimiristoílo- sn -glicero-3-fosfocolina (DMPC) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N - La sal sódica de [4- (p-maleimidofenil) butiramida] (DSPE-maleimida) se adquirió de Avanti Polar Lipids y el pireno se obtuvo de Fluka. El péptido pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) fue sintetizado y purificado por CS Bio. Todos los demás productos y reactivos eran de calidad analítica.

Síntesis de DSPE-pHLIP

pHLIP se conjugó con lípidos DSPE en metanol mediante la conjugación covalente de DSPE-maleimida con el único residuo de cisteína en el extremo N-terminal de pHLIP, como se describió anteriormente [18, 21, 22]. Brevemente, se mezclaron 5 mg de péptido disueltos en 250 μl de metanol (soplado con argón) y DSPE-maleimida (de una solución madre 9,9 mM) disueltos en cloroformo en una relación molar de 1:1. La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante aproximadamente 2-6 h hasta que se completó la conjugación. El progreso de la reacción en la conjugación de DSPE-malemida con pHLIP se controló mediante RP-HPLC usando un gradiente de acetonitrilo del 25 al 80% en agua que contenía TFA al 0,05% controlando una disminución del pico correspondiente al pHLIP no marcado en la mezcla de reacción. La construcción sintetizada se caracterizó por espectrometría de masas SELDI-TOF. La concentración de conjugado DSPE-pHLIP se determinó por absorbancia usando el coeficiente de extinción molar para pHLIP: ε ₂₈₀ =13,940 M ⁻¹ cm ⁻¹ .

Preparación y purificación de vesículas

El método de evaporación en capa fina se utilizó para preparar vesículas de tensioactivo no iónico (de Tween 20 o Span 20) y de fosfolípidos (de DMPC), con y sin pHLIP. En cada formulación de vesícula, se agregó colesterol en diferentes proporciones molares (Tabla 1) [23].

La composición de la muestra se ha optimizado eligiendo estructuras previamente bien caracterizadas [24, 25] a las que se ha añadido la misma cantidad de pHLIP.

Los componentes lipofílicos se disolvieron primero en CHCl ₃ :CH ₃ Mezcla de OH (3:1); A continuación, el disolvente orgánico se eliminó al vacío a diferentes temperaturas dependiendo de la muestra. La película obtenida se hidrató con 5 mL de tampón Hepes (0,01 M pH 7,4) o solución de calceína sódica 10 ^-2 M. La suspensión se mezcló en vórtice durante aproximadamente 5 min, seguido de sonicación (consulte el archivo adicional 1:Tabla S1, información de apoyo) utilizando una microsonda que funciona a 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, EE. UU.). La sonicación LipoDMPC se realizó en atmósfera inerte para evitar la oxidación.

Después, la suspensión de vesículas se purificó mediante cromatografía de permeación en gel utilizando Sephadex G-75 (columna de vidrio de 50 x 1,2 cm) y tampón Hepes como eluyente. Posteriormente, la suspensión de vesículas purificadas se filtró mediante filtros de celulosa con el diámetro de poro adecuado.

Se utilizó el mismo método de preparación para preparar niosomas y liposomas recubiertos con pHLIP.

Medidas de dispersión de luz dinámica

El tamaño medio y la distribución del tamaño de las vesículas se midieron en T =25 ° C por dispersión dinámica de luz (DLS), utilizando un Malvern NanoZetaSizer ZS90, equipado con un láser HeNe de 5 mW (longitud de onda λ =632,8 nm) y un correlador digital. Las funciones de autocorrelación normalizadas de la intensidad dispersa en un ángulo de 90 ° fueron analizadas por el algoritmo Contin para obtener la distribución del coeficiente de difusión de partículas D , de ahí la distribución del radio hidrodinámico efectivo R _H de las vesículas a través de la relación de Stokes-Einstein R _H = K _B T / 6πη D , donde K _B T es la energía térmica y η es la viscosidad del disolvente. El ancho de la distribución de tamaño de los niosomas / liposomas es bastante pequeño pero no despreciable. Los valores informados en la Tabla 2 corresponden al diámetro hidrodinámico promedio ponderado por intensidad de las partículas [26].

ζ-Mediciones de potencial

Las medidas de movilidad electroforética se realizaron mediante la técnica de electroforesis láser Doppler, utilizando el aparato Malvern NanoZetaSizer ZS90. La movilidad u se convirtió en el ζ -potencial utilizando la relación de Smoluchowski ζ =uη / є, donde η y є son la viscosidad y la permitividad de la fase disolvente, respectivamente [27].

Dispersión de rayos X de ángulo pequeño

Se llevaron a cabo experimentos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) en la Instalación de Radiación Sincrotrón Europea (ESRF, Grenoble, Francia). El uso de la línea de luz de alto brillo ID02 permitió realizar medidas en soluciones diluidas en la región de transferencia de impulso 0,1 nm ⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm ⁻¹ , q =(4π / λ) sin (θ / 2), donde θ es el ángulo de dispersión y λ =0,1 nm la longitud de onda de los rayos X. La correspondiente escala de longitud investigada está entre 1 y 60 nm, adecuada para acceder a la estructura interna de vesículas niosomales y liposomales. Todos los experimentos se realizaron en T =25 ° C con un tiempo de irradiación corto, 0,1 s, para evitar daños por radiación. Para cada muestra, la intensidad de dispersión en diferentes ángulos de dispersión se capturó en un detector 2D, luego se reagrupó angularmente, se restaron las contribuciones de fondo y de solvente, y se analizó para obtener información sobre la forma y estructura interna de las vesículas en solución.

En el caso de vesículas unilaminares, la bicapa cerrada se modeló con tres conchas concéntricas correspondientes a los grupos de cabeza externos, las cadenas hidrofóbicas y los grupos de cabeza internos. Se asumió una distribución de Schulz para el tamaño de la vesícula.

Cryo-TEM

La solución de la vesícula (gota de 5 μl) se extendió sobre una rejilla de microscopía electrónica de carbón / forma de Lacey y se conservó en un estado hidratado congelado mediante una congelación rápida en etano líquido. El proceso de vitrificación se realizó mediante el sistema FEI Vitrobot con el ajuste de una sola mancha de 3 s, un offset de 1 y un tiempo de drenaje y espera de 1 s. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) (JEOL 2100) con un voltaje de aceleración de 200 kV a aumentos en el rango de × 10,000 a × 150,000 para obtener imágenes de vesículas.

Estudios de estabilidad

Los estudios de estabilidad física de niosomas y liposomas, preparados con y sin pHLIP, se llevaron a cabo a dos temperaturas de almacenamiento diferentes (25 ° C y 4 ° C). El objetivo era evaluar si se producen cambios significativos en el tamaño y el potencial ζ de la dispersión de las vesículas durante un período de 90 días. Se extrajeron muestras de cada lote a intervalos de tiempo definidos (1, 30, 60 y 90 días) y se determinaron el tamaño de las vesículas y el potencial ζ como se describió anteriormente.

De manera similar, también se investigó la estabilidad de las vesículas en presencia de fluidos biológicos, como suero humano. Las suspensiones se pusieron en contacto con un 45% de suero humano a 37 ° C. A intervalos de tiempo definidos (0, 30 min, 1 h, 2 h y 3 h), se determinaron las variaciones en el tamaño de las vesículas y el potencial ζ como se describe.

Caracterización de dos capas

Se accedió a la fluidez y microviscosidad-polaridad de las bicapas niosomales y liposomales mediante mediciones de fluorescencia de dos sondas fluorescentes, difenilhexatrieno (DPH) y pireno, respectivamente, ubicadas en la región hidrófoba de la membrana bicapa. Se añadieron tanto DPH (2 mM) como pireno (4 mM), 220 µL y 2,5 mg respectivamente, al tensioactivo o mezcla de fosfolípidos / colesterol antes de la preparación de la vesícula [28]. Posteriormente, las vesículas cargadas con pireno se purificaron como se describió anteriormente, mientras que las vesículas cargadas con DPH se filtraron a través de un tamaño de poro progresivamente más pequeño (de 5.0 a 0.22 μm).

Las mediciones de anisotropía de fluorescencia se llevaron a cabo a temperatura ambiente utilizando un espectrofluorómetro LS55 (PerkinElmer, MA, EE. UU.) En λ _exc =400 nm y λ _em =425 nm y la anisotropía de fluorescencia ( A ) de las muestras se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación [29]:

donde yo _vv y yo _vh son las intensidades de la fluorescencia emitida (unidades arbitrarias), respectivamente, paralela y perpendicular a la dirección de la luz de excitación polarizada verticalmente. El factor de corrección G =I _hv / I _hh es la relación entre los componentes de emisión polarizados verticalmente y horizontalmente cuando la luz de excitación está polarizada horizontalmente. Los valores de anisotropía de fluorescencia son inversamente proporcionales a la fluidez de la membrana. Por lo tanto, un valor alto de anisotropía de fluorescencia corresponde a un orden estructural alto y / o una fluidez de membrana baja [30].

Para evaluar la microviscosidad y la micropolaridad de la bicapa vesicular, se llevaron a cabo experimentos de fluorescencia con pireno con un espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS55 a λ _exc =330 nm, registrando el espectro de emisión en el rango 350 <λ _em <550 nm [28]. La fina estructura de la fluorescencia del pireno presenta cinco picos. La relación entre las intensidades de la primera (372 nm) y la tercera (382 nm) bandas vibratorias del espectro de fluorescencia del pireno, I ₁ / Yo ₃ , está relacionado con la polaridad del medio pireno [31]. De hecho, los valores bajos de I ₁ / Yo ₃ La relación corresponde a un entorno no polar. Además, las moléculas de pireno incorporadas en la bicapa de la vesícula pueden formar excímeros intramoleculares y este proceso es sensible a la viscosidad del microambiente de la sonda [32]. Por lo tanto, la relación de intensidad de fluorescencia de excímero / monómero, I _E / Yo _M , está relacionado con la microviscosidad.

Estos estudios se realizaron en las vesículas preparadas con y sin pHLIP y luego se compararon los resultados obtenidos.

Estudios de liberación de calceína

Se cargaron vesículas de fosfolípidos o tensioactivo no iónico con calceína a una concentración de 10 ^-2 M. A esta concentración, la fluorescencia de la calceína se apaga automáticamente [33]. A continuación, se utilizaron medidas de extinción para determinar la liberación de calceína del núcleo acuoso de la vesícula. La sonda fluorescente se cargó en las vesículas durante la hidratación de la película fina mediante la adición de 5 ml de la solución acuosa de calceína. Las suspensiones de vesículas se purificaron mediante cromatografía de permeación en gel, se pusieron en contacto con suero humano al 45% o Hepes, y luego se cargaron dentro de una bolsa de diálisis de membrana de celulosa (peso molecular de corte 8.000 Da de Spectra / Por®). Los experimentos de liberación se llevaron a cabo a 37 ° C, bajo agitación magnética en tampón Hepes (10 mM, pH 7,4) como medio externo. Se retiraron alícuotas del medio externo en diferentes momentos durante 0-24 h. De vez en cuando, las alícuotas retiradas se reintroducían en el sistema [34].

La liberación de calceína se controló midiendo la fluorescencia del medio usando un espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS50B con λ _ex =492 y λ _em =520 nm. El valor de referencia F _∞ (unidades arbitrarias), correlacionadas con la cantidad total de calceína atrapada en las vesículas [35], se determinó después de la rotura de las vesículas usando alcohol isopropílico (1:1 v / v ). Los porcentajes de liberación ( F %) en cada punto de tiempo se obtuvieron utilizando la siguiente ecuación:

donde F _t (unidades arbitrarias) es la fluorescencia leída en un punto de tiempo específico t .

Análisis estadístico

Se utilizó un ANOVA de una vía para el análisis estadístico. A posteriori Bonferroni t Se realizó una prueba para evaluar la significancia estadística de la prueba ANOVA. A p valor <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los resultados son el promedio de tres experimentos ± desviación estándar.

Resultados y discusión

Las vesículas Tween20, Span20 y DMPC, preparadas con y sin DSPE-pHLIP, se caracterizaron por tamaño y potencial ζ (Tabla 2).

De acuerdo con los resultados presentados en la Tabla 2, las muestras analizadas no muestran variaciones significativas ni en tamaño ni en potencial ζ, independientemente de la presencia de pHLIP.

Los rangos de tamaño informados anteriormente se confirmaron mediante una técnica de análisis diferente, como el crio-TEM (Fig. 1).

Imágenes representativas de crio-TEM de niosomas y liposomas recubiertos con pHLIP. Imágenes de niosomas NioSpan20-pHLIP ( a ) y liposomas LipoDMPC-pHLIP ( b ) obtenido a × 10,000 aumentos y liposomas LipoDMPC-pHLIP ( c ) obtenido a × 40.000 aumentos

La estructura interna de los niosomas / vesículas con y sin DSPE-pHLIP se determinó mediante experimentos SAXS. Los espectros de intensidad SAXS, presentados en la Fig. 2, son diferentes, lo que indica que cada sistema tiene características peculiares.

Espectros SAXS. Espectros de intensidad de niosomas / vesículas sin (símbolos negros abiertos) y con DSPE-pHLIP (símbolos de color)

Los niosomas basados ​​en Tween20 son unilaminares, mientras que las vesículas de DMPC muestran un cierto grado de multilamelaridad (como liposomas), como lo muestra la presencia del pico característico en q ≅ 1 nm ⁻¹ , correspondiente a una distancia interlaminar de 6 nm (aproximadamente 5 nm de bicapa lipídica y 1 nm de agua). Las vesículas basadas en Span20 son definitivamente multilaminares, con un pico característico en q =1.6 nm ⁻¹ correspondiente a una distancia interlaminar de 3,8 nm, que coincide con el doble de la longitud de la molécula Span20. Los resultados indican que la capa de múltiples capas de las vesículas Span20 está compuesta por bicapas adyacentes casi sin agua interlaminar.

La presencia de DSPE-pHLIP (menos del 1% de fracción molar) no afecta drásticamente a los sistemas. La intensidad dispersa en todos los q investigados El rango es bastante similar, lo que indica una fracción comparable de material estructurado y un tamaño total comparable de las partículas vesiculares.

Las vesículas basadas en DMPC muestran un ligero aumento en el número de bicapas dentro del liposoma, deducible por el aumento de intensidad del pico de Bragg en q =1 nm ⁻¹ . La inserción de una pequeña fracción de cadenas DSPE C18, unidas a cada molécula de péptido, no cambia el grosor de la bicapa lipídica y está principalmente dictada por la gran fracción de colesterol con respecto a DMPC (alrededor del 40-50%). A esta concentración de colesterol, las cadenas lipídicas se organizan en la fase líquida ordenada (Lo) y se caracterizan por el desacoplamiento del orden posicional lateral débil de las cadenas con respecto al orden de orientación alto a lo largo de las cadenas y capaces de albergar pocos C18- cadenas sin ningún cambio estructural [36]. Además, las vesículas multicapa basadas en Span20 no muestran cambios en su estructura interna.

En el sistema Tween20 + pHLIP, está presente una pequeña cantidad de cristalitos de colesterol, como lo muestra el pico agudo típico en q =1,84 nm ⁻¹ (distancia característica de 3,41 nm) y la estructura de la vesícula no se ve afectada. La presencia de pocos microcristalitos se ha encontrado a menudo asociada con niosomas basados ​​en Tween [37] en cantidad que depende de la composición, el procedimiento de preparación y la purificación. En la Fig. 2, los dos espectros experimentales de vesículas Tween20 y Tween20 + pHLIP se muestran junto con las curvas de ajuste obtenidas modelando la bicapa esférica cerrada con tres capas concéntricas:los grupos de cabeza externos, las cadenas y los grupos de cabeza internos. El tamaño medio de ajuste de las vesículas es de aproximadamente 168 nm en ambos sistemas, de acuerdo con los resultados de DLS. Los parámetros estructurales son los mismos para las dos bicapas cerradas (consulte el archivo adicional 1:Figura S1 y Tabla S2) excepto para la capa externa:en presencia de DSPE-pHLIP, una ligera disminución (5%) de la densidad electrónica de los grupos de cabeza se observa (de 0,42 a 0,40 e / Å ³ ), junto con un aumento de la rugosidad de la capa. Este resultado indica que la adición de DSPE-pHLIP afecta principalmente a la capa externa de las vesículas. Esto concuerda con una imagen en la que las cadenas DSPE C18 se insertan en la bicapa y anclan el péptido a la superficie de la vesícula, entre los grupos de cabeza de polietilenglicol ramificados y extendidos. Observamos que la capacidad del péptido pHLIP en sí (no unido a las moléculas de lípidos) para interactuar con la superficie externa de las vesículas a pH alto e insertarse en la bicapa a pH bajo ha sido observada recientemente por SAXS en el caso de bicapas de fosfolípidos insaturados [38 ]. En el presente estudio, la fracción molar del péptido es significativamente menor y el péptido está vinculado a los lípidos, ya que el objetivo es diseñar nanovectores de fármacos sensibles al pH recubiertos con pHLIP. La asociación pHLIP es impulsada por la interacción hidrofóbica de las cadenas conjugadas DSPE C18 que se insertan en la región hidrofóbica del nanovector. El péptido pHLIP está anclado y se encuentra en la región del grupo de cabeza externo, propenso a interactuar con las membranas objetivo a pH ácido y / o liberar el contenido de nanovectores después del reordenamiento bicapa en un entorno de pH bajo.

Para investigar si la presencia de pHLIP podría afectar las propiedades microrreológicas bicapa (fluidez, microviscosidad y polaridad), se llevó a cabo una caracterización de capa lipófila. Los estudios de caracterización se realizaron utilizando la sonda fluorescente pireno, añadida a las muestras al inicio del procedimiento de preparación. Debido a su naturaleza lipofílica, se inserta en la bicapa de la vesícula y proporciona información sobre la polaridad y microviscosidad del entorno de la membrana.

Como se muestra en la Tabla 3, en los tres conjuntos de muestras, los valores de polaridad disminuyen ligeramente en presencia de pHLIP en comparación con la vesícula homóloga sin pHLIP, mientras que los valores de microviscosidad muestran un aumento de tres veces, para todas las vesículas.

La bicapa se caracterizó además mediante mediciones de anisotropía de fluorescencia de otra sonda fluorescente lipófila, DPH, incorporada en lípidos. Estas medidas reflejan el movimiento de la sonda y su orientación dentro de la bicapa, lo que proporciona información sobre la fluidez de la bicapa que puede afectar la capacidad de las vesículas para liberar su contenido [29]. Los valores de anisotropía de fluorescencia son inversamente proporcionales a la fluidez de la membrana. Por lo tanto, un valor de anisotropía de fluorescencia alto corresponde a un orden estructural alto y / o una fluidez de membrana baja, como en la fase de orden líquido [30].

Los valores de anisotropía para cada muestra se muestran en la Tabla 3. Los datos indican que la presencia de DSPE-pHLIP en las vesículas aumenta la fluidez de la membrana, ya que la anisotropía de fluorescencia disminuyó. Es bien sabido que la fluidez bicapa se ve afectada no sólo por el orden y la organización lateral de las cadenas apolares, sino también por los grupos de cabezas polares [31]. Los resultados de SAXS en los tres sistemas diferentes muestran que las moléculas de DSPE-pHLIP afectan principalmente a la región del grupo de cabezas, causando eventualmente un empaquetamiento diferente de las cabezas polares. Los resultados estructurales parecen coincidir con las propiedades microrreológicas de las bicapas en presencia de DSPE-pHLIP asociado, como lo revela la inserción de dos sondas diferentes. Los resultados muestran un aumento de la microviscosidad según lo revelado por el pireno, una sonda que podría insertarse cerca de la región exterior (pireno log P es 4,88). Por otro lado, se supone que la DPH está incrustada en el núcleo de las bicapas, orientada paralelamente al eje de la cadena de lípidos acilo o restringida en el centro de la bicapa, paralela a la superficie. Es muy sensible a la reorientación angular de las cadenas de acilo anfifilo [39]. El aumento de fluidez, como lo reveló DPH, podría estar relacionado tanto con el efecto de la inserción de cadenas DSPE entre las otras cadenas de acilo como con el efecto de la partición pHLIP en la región de los grupos de cabeza polares, cambiando las propiedades de empaquetamiento de los tensioactivos. (Figura 3).

Representación de las interacciones de pHLIP con la membrana de la vesícula

Se realizaron más estudios de caracterización de las preparaciones examinadas. Todas las muestras, preparadas con y sin pHLIP, se almacenaron durante 90 días a 4 ° C de temperatura para evaluar la estabilidad de las vesículas en el tiempo, midiendo su tamaño y variaciones de potencial ζ (Archivo adicional 1:Figura S2). No se observaron variaciones significativas en tamaño y potencial ζ a lo largo del experimento; por lo tanto, todas las preparaciones examinadas resultaron estables si se almacenaron a una temperatura de 4 ° C.

Además, se examinó la estabilidad de las muestras en presencia del 90% ( v / v ) suero humano y se almacenó a 37 ° C durante 3 h (archivo adicional 1:Figura S3).

En contacto con suero humano, las vesículas Tween20 mostraron un aumento de tamaño, aunque permanecieron por debajo de 300 nm. Se midió que el tamaño y los valores de PDI eran constantes a lo largo del experimento de 3 h, lo que sugiere que las vesículas en suspensión permanecieron intactas durante todo el experimento.

Ambas muestras de Span20 en contacto con suero humano mostraron un aumento de tamaño, especialmente en la preparación con pHLIP, mientras que los valores de PDI sugieren una distribución de tamaño homogénea (datos no mostrados). Este evento puede deberse a la absorción de proteínas plasmáticas en la superficie niosomal, como resultado de interacciones electrostáticas, sin embargo, sin incurrir en la rotura de vesículas. Esta hipótesis está respaldada por la disminución del potencial ζ después del contacto de las vesículas con el suero humano. Este fenómeno ocurre cuando el potencial ζ alcanza valores ligeramente negativos, alrededor de la región de neutralidad, lo que hace que el sistema sea inestable y las vesículas comienzan a agregarse.

Además de Tween20, las vesículas de DMPC muestran un aumento de tamaño en comparación con la muestra previa al contacto. Sin embargo, esta variación resultó no ser significativa y los valores de tamaño se mantuvieron por debajo de 280 nm (DMPC) o por debajo de 240 nm (DMPC + pHLIP).

Se evaluó la capacidad de liberación para las muestras preparadas con y sin pHLIP siguiendo la cantidad de calceína (sonda hidrófila) liberada de las vesículas a lo largo del tiempo.

Los estudios se llevaron a cabo a una temperatura de 37 ° C durante un período de tiempo de 24 h, exponiendo las muestras purificadas con tampón HEPES o suero humano. Como se muestra en la Fig. 4, los perfiles de liberación de calceína resultan ser muy similares para Tween20 y Tween20-pHLIP en tampón HEPES o suero humano.

Perfil de liberación de calceína. NioTween20 y NioTween20-pHLIP entraron en contacto con tampón HEPES ( a ) o suero humano ( b )

La cantidad liberada de calceína estuvo entre el 30 y el 50%, lo que indica que no hay diferencias en las capacidades de liberación entre las muestras preparadas con y sin pHLIP.

Se han obtenido los mismos resultados para las muestras de Span y DMPC (datos no mostrados).

Se han informado perfiles de liberación comparables para diferentes nanoportadores que responden a estímulos, como los cubosomas termosensibles [40] o los nanoportadores poliméricos autoensamblados (SAN) [41, 42].

En conclusión, las diferencias fisicoquímicas observadas en términos de microviscosidad y fluidez para las muestras preparadas con y sin pHLIP (Cuadro 3) no afectan su capacidad de liberación (Fig.4), de acuerdo con la evidencia de que la inserción de DSPE-pHLIP Las moléculas afectan principalmente a la región del grupo de la cabeza. Estos datos están de acuerdo con los resultados informados anteriormente que muestran que a pH neutro y alto, pHLIP se une a la superficie de los liposomas producidos por 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (POPC) y no induce fusión ni fuga de la membrana.

Conclusión

Este estudio confirma la posibilidad de preparar vesículas decoradas con pHLIP. Las muestras son estables si se almacenan a una temperatura de 4 ° C durante al menos 3 meses y en presencia de suero. Además, los nanovectores propuestos pueden atrapar una sonda hidrófila y modular su liberación.

pHLIP vesicles were fully characterized in order to obtain fundamental understanding on nanocarrier features and facilitate the rational design of acidity sensitive nanovectors.

The pHLIP association is driven by the hydrophobic interaction of the conjugated DSPE C18-chains inserting in the hydrophobic region of the nanovector. The pHLIP peptide is anchored and lies in the external headgroup region, prone to interact with target membranes at acidic pH and/or to release the nanovector content after bilayer rearrangement in low pH environment.

According to these findings, proposed pHLIP decorated vesicles could be useful to obtain a prolonged (modified) release of biological active substances for targeting tumors and other acidic diseased tissues.

Abreviaturas

Chol:

Cholesterol

Cryo-TEM:

Cryo-transmission electron microscopy

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMPC:

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPH:

Diphenylhexatriene

pHLIP:

pH (low) insertion peptide

SAXS:

Small angle X-ray scattering

Span20:

Sorbitan monolaurate

Tween20:

Polyoxyethylenesorbitan monolaurate

Transmisión de diodo óptico dicroico en dos rejillas metálicas paralelas dislocadas Detección basada en nanopartículas de oro de AGE de bajo peso molecular a partir de muestras in vitro de hemoglobina glicosilada A0