Terapia Fototérmica con Nanotubos de Carbono Dirigida más Inhibición de Punto de Control: Nueva Estrategia para Cáncer de Mama Metastásico

Resumen

Los mayores contribuyentes a la mortalidad por cáncer son la metástasis y las consecuencias de su tratamiento. Aquí presentamos un tratamiento novedoso de cáncer de mama metastásico que combina terapia fototérmica con nanotubos de carbono de pared única (SWCNTs) dirigidos e inmunoestimulación con inhibidor de punto de control. Encontramos que la ablación fototérmica selectiva de infrarrojo cercano de tumores ortotópicos primarios EMT6 de mama en ratones BALB/cJ singénicos usando un bioconjugado SWCNT funcionalizado con anexina A5 (ANXA5) mejora sinérgicamente una respuesta abscopal dependiente de anti-proteína 4 asociada a linfocito T citotóxico (anti-CTLA-4), resultando en supervivencia aumentada (55%) a 100 días tras inoculación tumoral. En comparación, no hubo supervivencia a 100 días ni para terapia fototérmica sola ni para inmunoestimulación sola. Previo a terapia fototérmica, el bioconjugado SWCNT-ANXA5 se administró sistémicamente a dosis relativamente baja de 1,2 mg/kg, donde se acumuló en vasculatura tumoral mediante unión dependiente de ANXA5. Durante terapia fototérmica, la temperatura máxima promedio en el tumor alcanzó 54 °C (duración 175 s). El mecanismo de supervivencia prolongada resultante de ablación fototérmica combinatoria y estimulación inmune se evaluó mediante cuantificación citométrica de flujo de células efectoras inmunes antitumorales esplénicas y cuantificación de citocinas séricas.

Introducción

La metástasis y las consecuencias de su tratamiento son la causa única más grande de muerte en cáncer [1]. Por ejemplo, cuando el cáncer de mama metastatiza, las tasas de supervivencia a 5 años de pacientes caen por debajo del 25%. Aunque en los últimos 60 años más de 200 nuevos fármacos antineoplásicos han mejorado resultados de pacientes, la supervivencia global sigue siendo pobre en enfermedad metastásica [2]. Aquí se estudia una combinación novedosa de terapia fototérmica facilitada por un bioconjugado SWCNT dirigido a tumor e inhibición de punto de control anti-proteína 4 asociada a linfocito T citotóxico (anti-CTLA-4) para tratar cáncer de mama metastásico en modelo murino ortotópico.

Las propiedades únicas de SWCNTs como nanomaterial han generado interés significativo en su uso como herramienta potencial en la lucha contra el cáncer. Mientras SWCNTs ejercen variedad de efectos biológicos, el uso de SWCNTs en tratamiento de cáncer se ha centrado principalmente en su interacción con luz infrarroja cercana (NIR) y el efecto fototérmico resultante, donde SWCNTs calientan rápidamente el tumor en proceso llamado terapia fototérmica (PTT). Numerosos grupos han investigado el potencial de SWCNTs para usarse en estrategias de tratamiento basadas en PTT en varios modelos de cáncer de mama [3,4,5,6,7,8,9,10]. Estos trabajos se han centrado largely en la capacidad de PTT para tratar tumores primarios a profundidades no mayores a varios mm, donde la atenuación de luz NIR es casi completa.

Anteriormente, mostramos que tumores primarios ortotópicos de mama en ratones singénicos podían eliminarse casi completamente usando luz láser NIR suave en conjunción con un bioconjugado SWCNT mejorador fototérmico [11]. En este bioconjugado, los SWCNTs fueron funcionalizados con la proteína anexina A5 (ANXA5), que se une con alta afinidad al fosfolípido aniónico fosfatidilserina expresado externamente en células tumorales y en células endoteliales de vasculatura tumoral, pero no en células normales en vasculatura [12,13,14]. Este conjugado se visualizó usando microscopía de fuerza atómica (AFM) para mostrar que la altura del conjugado era entre 2,5 y 5,0 nm, similar a otros conjugados SWCNT-proteína [11]. Aunque capaz de erradicar tumores primarios en este modelo metastásico previo, la terapia fototérmica sola solo extendió modestamente la supervivencia. Sin embargo, encontramos evidencia preliminar sugiriendo que tratamiento concomitante con inmunomoduladores como ciclofosfamida era capaz de aumentar supervivencia.

Recientemente, el potencial de inmunomoduladores como ciclofosfamida para mejorar sinérgicamente PTT dirigida por SWCNT ha sido tema de mucho interés. Una categoría de agentes inmunomoduladores prometedores son inhibidores de punto de control. Los inhibidores de punto de control son anticuerpos como anti-CTLA-4, anti-PD-1, y anti-PDL-1 que se unen a proteínas celulares críticas responsables de modular la respuesta del cuerpo al cáncer. Estos anticuerpos bloquean "puntos de control" biológicos clave donde el cuerpo puede regular negativamente la respuesta del sistema inmune al cáncer. Estas proteínas normalmente sirven un papel importante en controlar la respuesta inmunológica del cuerpo. Al bloquear la acción de estas proteínas, los inhibidores de punto de control remueven un mecanismo por el cual el sistema inmune normalmente suprime su respuesta antitumoral natural. Recientemente, varios grupos han observado que la combinación de inhibición de punto de control anti-CTLA-4 con PTT mejorada por SWCNT tiene potencial para promover respuesta inmune robusta en cáncer de mama [15, 16].

En el estudio actual, evaluamos la combinación de nuestra modalidad PTT novedosa en conjunción con agente inmunoestimulador anti-proteína 4 asociada a linfocito T citotóxico (anti-CTLA-4). Originalmente aprobado para tratamiento de melanoma metastásico [17], anti-CTLA-4 ahora se está probando para tratar cáncer de mama en ensayos clínicos combinado con otros agentes inmunoestimuladores [18]. Evaluamos el mecanismo de inmunidad antineoplásica mejorada en PTT en combinación con inhibición de punto de control anti-CTLA-4, así como el destino a largo plazo de SWCNTs en órganos diana.

Materiales y Métodos

Materiales

El plásmido codificante ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, se construyó previamente en este laboratorio [11]. Albúmina sérica bovina (BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), y buffer Tris-acetato-EDTA fueron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Fosfato de sodio y dodecilsulfato de sodio (SDS) fueron de Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). Etanol grado HPLC fue de Acros Organics (Waltham, MA). Columnas His-trap fueron de GE Healthcare (Chicago, IL). Buffer de tinción citometría de flujo, buffer de fijación/permeabilización, buffer de permeabilización, kit de cuantificación cromogénica de endotoxina, y casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) fueron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Membranas de diálisis 2 y 100 kDa fueron de Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Medio celular Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) y solución salina balanceada de Hank's fueron de ATCC (Manassas, VA). Suero fetal bovino (FBS) fue de Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Triptona, extracto de levadura, y monosulfato de kanamicina se obtuvieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Hidróxido de sodio, cloruro de potasio, y cloruro de sodio fueron de VWR Inc (Radnor, PA). Proteasa HRV-C3 fue de Sino Biologics (Portland, OR). Anticuerpo monoclonal murino anti-CTLA-4 (clon: 9H10) y kits ELISA de citocinas murinas (TNF-α, IFN-γ, IL-6) se obtuvieron de BioLegend (San Diego, CA). SWCNTs CoMoCAT (diámetro promedio 0,8 ± nm, longitud promedio 1,5 ± 0,5 µm) se obtuvieron de CHASM (Boston, MA). El método CoMoCAT se conoce por rendir SWCNT de pequeño número de quiralidades (n,m) con alta selectividad [19]. La muestra usada en este estudio está altamente enriquecida en SWCNTs [5, 6], que exhibe fuerte absorción de luz NIR a longitud de onda 980 nm. Esta absorción corresponde a transición S₁₁ para este tipo de nanotubo entre singularidad de van Hove ocupada a la correspondiente no ocupada. Por tanto, para maximizar absorción de radiación por SWCNT depositados en tumores, la longitud de onda del láser usado en este estudio fue 980 nm para coincidir exactamente con la transición óptica S₁₁ [20]. La Figura S1 en Archivo adicional 1 muestra espectros de fluorescencia, mostrando claramente emisión NIR S₁₁ tras excitar transición S22 con luz visible.

Cultivo Celular

Células de cáncer de mama EMT6 de ATCC (Manassas, VA) se cultivaron en medio Waymouth's MB 752/1 con 2 mM L-glutamina suplementado con 15% FBS. Todas las células crecieron a 37 °C y 100% humedad bajo 5% CO₂. Todas las células se pasaron usando 0,25% (p/v) tripsina en 0,53 mM EDTA. Linaje celular y estado libre de micoplasma se confirmaron vía prueba STR (Charles River) y se ensayaron libres de endotoxina por ensayo limulus.

Producción de ANXA5 y SWCNT-ANXA5

El conjugado SWCNT-ANXA5 se preparó usando procedimiento que desarrollamos previamente que da 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT [11]. Brevemente, E. coli transfestado con plásmido codificante ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, se creció y purificó usando cromatografía de afinidad de metal inmovilizado con Ni²⁺ inmovilizado para aislar ANXA5, que involucró escisión enzimática para remover etiqueta (His)₆. SWCNTs CoMoCAT liofilizados se dispersaron en 1% dodecilsulfato de sodio (SDS) usando dos ciclos de sonicación con sonda a 20 W y centrifugación a 29.600 g por 30 min cada uno. Los SWCNTs suspendidos se caracterizaron por fluorescencia NIR (Archivo adicional 1: Figura S1) y luego se conjugaron a un enlazador 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-poliéter-glicol-maleimida (DSPE-PEG-maleimida) por 30 min a temperatura ambiente para permitir interacción hidrofóbica entre SWCNTs y grupo funcional DSPE. Esto fue seguido por diálisis de 8 h en agua destilada para remover enlazador exceso y SDS. El conjugado dializado se reaccionó luego con ANXA5, que contiene un grupo cisteína, por 2 h y se bloqueó con 1,5 mg ml⁻¹ L-cisteína. El producto final, SWCNT-ANXA5, se dializó contra buffer fosfato sódico 20 mM por 8 h para remover ANXA5 y L-cisteína exceso. Peso y pureza de proteína se caracterizaron vía SDS-PAGE. El contenido de SWCNT y ANXA5 del bioconjugado se caracterizó por espectroscopía UV-Vis-NIR fluorescencia, análisis Raman transformada de Fourier infrarroja (FT-IR), y ensayo Bradford (Archivo adicional 1: Figura S2).

Estudios In Vivo

Todos los procedimientos cumplieron con protocolo aprobado por Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Universidad de Oklahoma. Ratonas BALB/cJ de 6 semanas de edad se usaron (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Ratones se alimentaron con dieta estándar. Durante irradiación fototérmica de tumores con luz láser NIR, ratones se anestesiaron con 2% isoflurano y 98% oxígeno usando cono nasal.

Tumores se indujeron por inyección ortotópica de 10⁶ células de cáncer de mama murino EMT6 en 100 µL PBS en almohadilla grasa mamaria IV. Tumores se permitieron crecer por 12 días, y cuando alcanzaron volumen de 60 mm³ (~5 mm de diámetro), ratones recibieron inyección sistémica i.v. de 1,2 mg/kg bioconjugado SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT por kg peso corporal) vía vena cola lateral. Tras 3 h, una región 5 mm en exceso del límite tumoral se irradi con luz NIR (980 nm) a nivel de energía y potencia de 175 J/cm² y 1 W/cm², respectivamente (tiempo 175 s; láser NIR Diodevet-50, B&W Tek Inc., Newark, DE). La inhibición de punto de control se logró por administración serial i.p. de 200 µg anticuerpo anti-CTLA-4 en 100 µl PBS en días 8, 11 y 16 tras inoculación tumoral. Volumen tumoral se calculó con fórmula elipsoide modificada \(V = \frac{1}{2} \times {\text{longitud}} \times {\text{ancho}}^{2}\) usando mediciones con calibre de dimensión más larga y ancho perpendicular. Temperatura tumoral se monitorizó con cámara térmica portátil FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK) configurada en autoscaneo para temperatura máxima detectada. Órganos diana se recolectaron para evaluación de toxicidad y fijaron en formalina neutra bufferizada 10%, y láminas de parafina fijada en formalina (FFPE) teñidas se prepararon y tiñeron con hematoxilina y eosina para análisis de toxicidad.

Detección Ex Vivo de SWCNT

Ratones recibieron inyección sistémica de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg peso corporal) vía vena cola lateral. En puntos temporales selectos, ratones (n = 3) fueron eutanasiados, necropsiados, y órganos diana removidos para análisis. Muestras de tejido se prepararon como se describió previamente [21]. La presencia de SWCNTs en muestras de tejido ex vivo se determinó luego por espectroscopía de fluorescencia NIR relativa usando NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Citometría de Flujo

Ratones fueron eutanasiados 14 días post-tratamiento, y células efectoras inmunes antitumorales esplénicas se cuantificaron como se describió previamente [21].

Detección de Citocinas

Tras tratamiento como se describió arriba, ratones (n = 4–5) fueron eutanasiados 7 días tras terapia fototérmica para recolección de sangre. La concentración de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interferón gamma (IFN-γ), e interleucina 6 (IL-6) en muestras de suero diluido se cuantificó por ELISA según protocolo del proveedor.

Análisis Estadístico

Datos se analizaron con software Graphpad Prism. Significancia estadística se evaluó usando ANOVA de una vía y prueba de comparaciones múltiples Tukey-Kramer. Significancia estadística de curvas de supervivencia se determinó por prueba log-rank Mantel-Haenszel. Significancia estadística de concentración sérica de citocinas se analizó por ANOVA de una vía y prueba de comparaciones múltiples Dunnett. Comparaciones múltiples se corrigieron por umbral Bonferroni. Error se representa gráficamente como error estándar de la media a menos que el error no excediera el tamaño del símbolo de punto medio trazado, en cuyo caso las barras se excluyeron para claridad.

Resultados

Cinética Térmica

Usando dosis de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5, la temperatura máxima de tumores se registró durante tratamiento con luz NIR, como se indica en Fig. 1. Ratones que recibieron SWCNT-ANXA5 previo a irradiación tuvieron temperaturas tumorales más altas durante todo el tratamiento con luz NIR comparados con ratones que recibieron suero fisiológico. La temperatura promedio del tumor para ratones recibiendo SWCNT-ANXA5 fue significativamente diferente que para ratones recibiendo suero fisiológico (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Como resultado de esta terapia fototérmica mejorada, solo en grupo SWCNT-ANXA5 ocurrió ablación tumoral visible. La ablación tumoral se caracterizó por decoloración rápida, seguida por contracción de piel y aparición de arrugas. Dentro de 48 h, se formó escara significativa en sitio de ablación fototérmica. La regeneración completa de piel tomó varias semanas.

Terapia Fototérmica e Inhibición de Punto de Control

Los resultados de combinar terapia fototérmica con inhibición de punto de control usando anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 se muestran en Fig. 2. Mientras terapia fototérmica sola erradicó fácilmente neoplasia primaria de cáncer de mama, la incapacidad de luz láser NIR para penetrar más allá de pocos mm limitó tratamiento de metástasis de cáncer de mama. Para superar deficiencias de tratamiento antineoplásico fototérmico NIR localizado, exploramos combinación de esta modalidad terapéutica única con inhibición sistémica de punto de control (Fig. 2). Mientras terapia fototérmica destacó en destruir tumores primarios EMT6 (Fig. 2a), este tratamiento falló en erradicar metástasis y solo aumentó modestamente supervivencia de ratones portadores de tumores ortotópicos EMT6 (Fig. 2b). En contraste, inhibición de punto de control con anti-CTLA-4 mejoró supervivencia global pero solo retrasó temporalmente crecimiento tumoral primario. Mientras ninguna terapia sola rindió aumentos en supervivencia global, la combinación de ambas terapia fototérmica mejorada SWCNT-ANXA5 e inhibición de punto de control anti-CTLA-4 mejoró supervivencia global, llevando a 55% supervivencia a 100 días post-inoculación tumoral.

El análisis citométrico de células efectoras esplénicas tras tratamiento reveló un mecanismo putativo de supervivencia mejorada en ratones recibiendo terapia fototérmica combinatoria e inhibición de punto de control. Ratones fueron inoculados con EMT6 y tratados como se describió antes. Dos semanas tras tratamiento, ratones fueron sacrificados y tanto porcentajes como números relativos de múltiples tipos de efectoras inmunes se cuantificaron. Poblaciones de células T auxiliares, células T citotóxicas, neutrófilos, monocitos de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), células T reguladoras FoxP3, y macrófagos se evaluaron (Archivo adicional 1: Figura S3). El análisis de estas poblaciones reveló diferencias significativas entre poblaciones de tratamiento y controles solo en ratones que recibieron combinación de ambas terapia fototérmica e inhibición de punto de control anti-CTLA-4 juntas. En aquellos animales que recibieron esta combinación, observamos aumento en números relativos de células T auxiliares (CD4⁺) y células T citotóxicas (CD8⁺), (Fig. 2c, d). Aumentos en conteos CD4⁺ y CD8⁺ correlacionaron con aumentos brutos en tamaños de bazo observados tras necropsia.

Además del análisis citométrico de células efectoras esplénicas, la concentración de citocinas séricas se determinó 7 días tras PTT para ayudar elucidar mecanismos de inmunidad antitumoral. Los niveles de citocinas proinflamatorias IL-6, IFN-γ, y TNF-α se presentan en Fig. 3. Ni tratamiento SWCNT solo ni anti-CTLA-4 solo aumentaron significativamente niveles de citocinas comparado a grupo control no tratado. Sin embargo, tratamiento PTT solo pudo aumentar TNF-α significativamente. La adición adicional de anti-CTLA-4 a tratamiento PTT aumentó significativamente niveles TNF-α, IL-6, e IFN-γ.

Biodistribución y Toxicidad de SWCNT-ANXA5

La biodistribución de SWCNT-ANXA5 tras administración para mejora de terapia fototérmica en varios órganos se monitorizó con cuantificación fluorescente de SWCNT en lisados de tejido ex situ comparados a estándares (Archivo adicional 1: Figura S4). La biodistribución en órganos diana se siguió por período de 4 meses tras inyección i.v. de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 en ratones sanos (Fig. 4a, b). En contraste, la acumulación de SWCNT-ANXA5 en ratones portadores de tumores EMT6 tras administración, según protocolo de inyección descrito previamente, se determinó a 3 h tras administración. (El momento en que se realizó terapia fototérmica en estudio de tratamiento.) Durante el período de 4 meses previo a recolección de órganos, ratones se monitorizaron para efectos secundarios físicos y comportamiento anormal. No se observaron efectos secundarios en ningún ratón inyectado con SWCNT-ANXA5 durante este período. No se observó toxicidad histopatológica durante examen de secciones FFPE teñidas con hematoxilina y eosina de órganos diana al concluir el estudio (Archivo adicional 1: Figura S5).

Discusión

Los datos presentados aquí apoyan la efectividad de combinar terapia fototérmica dirigida e inhibición de punto de control inmune para tratamiento de cáncer de mama metastásico. Este fenómeno se conoce como "efecto abscopal", que describe la capacidad de radiación localizada para iniciar respuesta antitumoral que suprime crecimiento tumoral distante al objetivo primario. Ya en 1950s, investigadores observaron que irradiación tumoral localizada tenía efecto significativo en tumores distantes [22]. Estudios han establecido que la naturaleza sistémica del efecto abscopal se debe a respuesta inmune del huésped [23,24,25]. Mientras γ-irradiación ha sido foco principal de la mayoría de investigaciones abscopales, un cuerpo creciente de trabajo demuestra que terapia fototérmica puede inducir efecto abscopal también. Numerosos estudios han demostrado que ablación térmica en combinación con inhibidor de punto de control anti-CTLA-4 produce respuesta inmune intensificada [16, 26,27,28,29]. Observamos respuesta abscopal similar tras ablación fototérmica dirigida y bloqueo anti-CTLA-4 en modelo EMT6 de cáncer de mama.

El efecto abscopal se ilustra por datos en Fig. 2a, b. Tumores ortotópicos EMT6 crecen rápidamente y han metastatizado para cuando son tratados por terapia fototérmica. Esta es la razón por la que ratones con tumores tratados solo con terapia fototérmica tuvieron solo ligero aumento en supervivencia comparados a ratones control no tratados, aunque el tumor primario había sido completamente ablado. La administración de anti-CTLA-4 solo retrasó crecimiento tumoral comparado a control y aumentó tiempo de supervivencia a 68 días pero no llevó a cura. Un resultado similar de crecimiento tumoral EMT6 retrasado fue observado por Jure-Kunkel et al. cuando se administró anti-CTLA-4 [30]. Para la combinación de terapia fototérmica y anti-CTLA-4, 55% de ratones tratados sobrevivieron a 100 días tras inoculación tumoral y es probable que estén curados.

La comprensión del mecanismo de inmunidad antitumoral se evaluó usando citometría de flujo para cuantificar poblaciones de células efectoras inmunes en bazo. Comparado a terapia fototérmica o anti-CTLA-4 solos, la terapia combinatoria resultó en aumento siete veces en células T auxiliares CD4⁺ y aumento tres veces en células T citolíticas CD8⁺, ambos resultados altamente estadísticamente significativos (p < 0,005). Estos resultados proporcionan más evidencia de respuesta abscopal potencial por combinación de fototerapia y terapia de co-estimulación de células T con inhibición de punto de control inmune.

Los aumentos en conteos CD4⁺ y CD8⁺ correlacionaron con aumentos en tamaños de bazo observados durante necropsia. El aumento de tamaño de bazo indica respuesta inmune intensificada. El bazo comprende múltiples tipos celulares, los más comunes de los cuales son de linajes CD4⁺, CD8⁺, y células B [31, 32]. Aunque no explorado en este cuerpo de trabajo, esperaríamos que conteos de células B aumentaran junto con conteos de células T CD4⁺ y CD8⁺ [33]. Las células T auxiliares CD4⁺ asisten inmunidad humoral facilitando otras células inmunes por estimulación de citocinas e interacciones célula-célula directas. Las células T citolíticas CD8⁺ matan directamente células tumorales. Los aumentos en conteos CD4⁺ y CD8⁺ son indicativos de respuesta inmune abscopal sistémica.

La presencia de respuesta inmune abscopal sistémica tras tratamiento combinatorio es apoyada además por aumentos en niveles de citocinas proinflamatorias en suero murino (Fig. 3). TNF-α activa macrófagos asociados a tumor para presentar efectos antitumorales [34, 35]. IFN-γ juega papel importante en vigilancia tumoral [36, 37]. IL-6 promueve proliferación de macrófagos y linfocitos [38]. El aumento significativo en estas moléculas efectoras en suero murino 7 días tras tratamiento PTT combinado con anti-CTLA-4 apoya más la existencia de respuesta inmune antitumoral.

Al concluir irradiación de ratones que recibieron SWCNT, la temperatura máxima promedio tumoral fue 54 °C; esta temperatura fue suficiente para ablación completa del tumor (Fig. 1). Esto está dentro del rango 45–60 °C en que ocurre inactivación enzimática y lesión mitocondrial [39]. La temperatura de tumores en grupo control salino permaneció por debajo de 40 °C, temperatura que proporciona beneficio terapéutico mínimo [39,40,41].

Observamos la mayoría de acumulación SWCNT-ANXA5 basada en concentración fue principalmente en hígado, corazón, bazo, riñones, pulmones, y tumor (Fig. 4a). En ratones con tumores EMT6, observamos que la concentración SWCNT-ANXA5 era similar a la de hígado y riñones (Fig. 4a, b). Cantidades traza de SWCNT-ANXA5 se detectaron en cerebro, intestinos gruesos, e intestinos delgados. Es importante notar que la biodistribución de SWCNT en base a % de dosis inyectada (ID) no correlaciona bien con la concentración absoluta de SWCNT dentro de un tejido diana. Esto se debe principalmente a diferencias entre pesos de órganos. Por instancia, un dado % ID dentro de un órgano corresponderá a mayor concentración dentro de órganos menores, y menores concentraciones dentro de órganos mayores. Comparando muestras en base a concentración SWCNT revela que la mayor concentración está en riñón, seguida de cerca por hígado y bazo (Fig. 4a).

Hay evidencia de degradación de SWCNTs en varios órganos durante el período del estudio de biodistribución (Fig. 4a, b). La degradación de SWCNTs en órganos se espera basada en hallazgo previo que nanotubos de carbono de pared múltiple se degradan en macrófagos [42]. Los SWCNTs usados en nuestro estudio tienen diámetro promedio 0,8 nm y longitud promedio 1500 µm. Este tamaño no se predice citotóxico basado en estudio de Zhu et al. [43], quienes clasificaron potencial de daño de bicapa lipídica por toxicidad de nanotubos de carbono basado en longitud y diámetro. Según esta clasificación, los SWCNTs que usamos están en categoría "biológicamente suave", minimizando citotoxicidad, consistente con nuestras observaciones en estudios en ratones donde no observamos efectos secundarios ni toxicidad histopatológica como resultado de administrar conjugado SWCNT-ANXA5.

Conclusiones

Aquí demostramos una modalidad de tratamiento combinatorio novedosa donde obtenemos una tasa de supervivencia relativamente alta en ratones con cáncer de mama metastásico agresivo usando terapia fototérmica con bioconjugado SWCNT-ANXA5 combinada con inhibición de punto de control basada en anti-CTLA-4. El uso de proteína de vasculatura tumoral dirigidente ANXA5 minimizó la cantidad de SWCNT administrados sistémicamente necesaria para erradicar tumores primarios en una dosis única baja. Curiosamente, notamos aumento en supervivencia de ratones con cáncer metastásico tratados con terapia combinatoria, aunque solo el tumor primario fue irradiado. Un estudio mecanicista cuantificando números de importantes células efectoras antitumorales esplénicas reveló que solo la combinación de ambas modalidades de tratamiento aumentó el número de células T auxiliares CD4⁺ y citotóxicas CD8⁺. Hipotetizamos que este aumento en células T refleja respuesta abscopal, donde células efectoras antitumorales suprimieron metástasis tumoral. Aunque SWCNTs aún se encontraron presentes en órganos 4 meses tras administración, no se observaron efectos secundarios ni toxicidad tisular aparente durante el curso de experimentos.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricción.

Abreviaturas

SWCNT:

Nanotubo de carbono de pared única

ANXA5:

Anexina A5

anti-CTLA-4:

Anti-proteína 4 asociada a linfocito T citotóxico

EDTA:

Ácido etilendiaminotetraacético

SDS-PAGE:

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

DSPE:

1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

PTT:

Terapia fototérmica