Nanotubos de carbono de pared simple dirigidos para terapia fototérmica combinados con inhibición de puntos de control inmunológico para el tratamiento del cáncer de mama metastásico

Resumen

Los mayores contribuyentes a la mortalidad por cáncer son la metástasis y las consecuencias de su tratamiento. A continuación, presentamos un tratamiento novedoso del cáncer de mama metastásico que combina la terapia fototérmica con nanotubos de carbono de pared simple dirigidos (SWCNT) e inmunoestimulación con un inhibidor de punto de control. Encontramos que la ablación fototérmica selectiva en el infrarrojo cercano de tumores de mama EMT6 ortotópicos primarios en ratones BALB / cJ singénicos utilizando un bioconjugado SWCNT funcionalizado con anexina A5 (ANXA5) mejora sinérgicamente una proteína 4 asociada a linfocitos T anti-citotóxica (anti-CTLA- 4) respuesta abscopal dependiente, que da como resultado un aumento de la supervivencia (55%) a los 100 días después de la inoculación del tumor. En comparación, no hubo supervivencia a los 100 días ni para la terapia fototérmica por sí misma ni para la inmunoestimulación por sí misma. Antes de la terapia fototérmica, el bioconjugado SWCNT-ANXA5 se administró sistémicamente a una dosis relativamente baja de 1,2 mg / kg, donde luego se acumuló en la vasculatura del tumor a través de la unión dependiente de ANXA5. Durante la terapia fototérmica, la temperatura máxima promedio en el tumor alcanzó los 54 ° C (duración 175 s). El mecanismo de supervivencia prolongada resultante de la ablación fototérmica combinatoria y la estimulación inmune se evaluó mediante la cuantificación por citometría de flujo de las células efectoras inmunes antitumorales esplénicas y la cuantificación de las citocinas séricas.

Introducción

La metástasis y las consecuencias de su tratamiento son la principal causa de muerte por cáncer [1]. Por ejemplo, cuando el cáncer de mama hace metástasis, las tasas de supervivencia de las pacientes a 5 años caen por debajo del 25%. Aunque en los últimos 60 años más de 200 nuevos fármacos antineoplásicos han mejorado los resultados de los pacientes, la supervivencia global sigue siendo baja en la enfermedad metastásica [2]. Aquí, una nueva combinación de terapia fototérmica facilitada por un bioconjugado de nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) dirigido a tumores y la inhibición del punto de control de la proteína 4 asociada a linfocitos T anticitotóxicos (anti-CTLA-4) se estudia para tratar el cáncer de mama metastásico en un modelo murino ortotópico.

Las propiedades únicas de los SWCNT como nanomaterial han generado un interés significativo en su uso como una herramienta potencial en la lucha contra el cáncer. Si bien los SWCNT ejercen una variedad de efectos biológicos, el uso de SWCNT en el tratamiento del cáncer se ha centrado principalmente en su interacción con la luz del infrarrojo cercano (NIR) y el efecto fototérmico resultante, donde los SWCNT calientan rápidamente el tumor en el proceso llamado terapia fototérmica. (PTT). Numerosos grupos han investigado la posibilidad de que las SWCNT se utilicen en estrategias de tratamiento basadas en PTT en varios modelos de cáncer de mama [3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Estos trabajos se han centrado en gran medida en la capacidad del PTT para tratar tumores primarios a profundidades no superiores a varios mm, donde la atenuación de la luz NIR es casi completa.

Anteriormente, mostramos que los tumores de mama ortotópicos primarios en ratones singénicos podrían eliminarse casi por completo utilizando luz láser NIR suave junto con un bioconjugado SWCNT potenciador fototérmico [11]. En este bioconjugado, los SWCNT se funcionalizaron con la proteína anexina A5 (ANXA5), que se une con alta afinidad al fosfolípido aniónico fosfatidilserina expresado externamente en las células tumorales y en las células endoteliales de la vasculatura tumoral, pero no en las células normales de la vasculatura [ 12,13,14]. Este conjugado se visualizó mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) para mostrar que la altura del conjugado estaba entre 2,5 y 5,0 nm, que es similar a la de otros conjugados SWCNT-proteína [11]. Aunque es capaz de erradicar tumores primarios en este modelo metastásico anterior, la terapia fototérmica por sí sola solo prolongó modestamente la supervivencia. Sin embargo, encontramos evidencia preliminar que sugiere que el tratamiento concomitante con inmunomoduladores como la ciclofosfamida fue capaz de aumentar la supervivencia.

Recientemente, el potencial de inmunomoduladores tales como ciclofosfamida para mejorar sinérgicamente el PTT dirigido por SWCNT ha sido objeto de mucho interés. Una categoría de agentes inmunomoduladores prometedores son los inhibidores de puntos de control. Los inhibidores de puntos de control son anticuerpos como anti-CTLA-4, anti-PD-1 y anti-PDL-1 que se unen a proteínas celulares críticas responsables de modular la respuesta del cuerpo al cáncer. Estos anticuerpos bloquean "puntos de control" biológicos clave donde el cuerpo puede regular negativamente la respuesta del sistema inmunológico al cáncer. Estas proteínas normalmente cumplen un papel importante en el control de la respuesta inmunológica del cuerpo. Al bloquear la acción de estas proteínas, los inhibidores de los puntos de control eliminan un mecanismo por el cual el sistema inmunológico normalmente suprime su respuesta antitumoral natural. Recientemente, varios grupos han observado que la combinación de inhibición del punto de control anti-CTLA-4 con PTT potenciada con SWCNT tiene el potencial de promover una respuesta inmune robusta en el cáncer de mama [15, 16].

En el estudio actual, evaluamos la combinación de nuestra nueva modalidad de PTT junto con el agente inmunoestimulador anti-proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (anti-CTLA-4). Originalmente aprobado para el tratamiento del melanoma metastásico [17], el anti-CTLA-4 se está probando ahora para tratar el cáncer de mama en ensayos clínicos combinados con otros agentes inmunoestimuladores [18]. Evaluamos el mecanismo de inmunidad antineoplásica mejorada en PTT en combinación con la inhibición del punto de control anti-CTLA-4, así como el destino a largo plazo de SWCNT en órganos diana.

Materiales y métodos

Materiales

El plásmido que codifica ANXA5, pET-30 Ek / LIC / ANX, se construyó previamente en este laboratorio [11]. La albúmina de suero bovino (BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y tampón Tris-acetato-EDTA fueron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). El fosfato de sodio y el dodecilsulfato de sodio (SDS) eran de Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, Nueva Jersey). El etanol de grado HPLC era de Acros Organics (Waltham, MA). Las columnas de his-trap eran de GE Healthcare (Chicago, IL). El tampón de tinción de citometría de flujo, el tampón de fijación / permeabilización, el tampón de permeabilización, el kit de cuantificación de endotoxinas cromogénicas y los casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) fueron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Las membranas de diálisis de 2 y 100 kDa eran de Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). El medio celular del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) y la solución salina balanceada de Hank eran de ATCC (Manassas, VA). El suero fetal bovino (FBS) era de Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). La triptona, el extracto de levadura y el monosulfato de kanamicina se obtuvieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). El hidróxido de sodio, el cloruro de potasio y el cloruro de sodio fueron de VWR Inc (Radnor, PA). La proteasa HRV-C3 era de Sino Biologics (Portland, OR). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-CTLA-4 (clon:9H10) y los kits ELISA de citocina de ratón (TNF-α, IFN-γ, IL-6) se obtuvieron de BioLegend (San Diego, CA). Los SWCNT de CoMoCAT (diámetro medio 0,8 ± nm, longitud media 1,5 ± 0,5 µm) se obtuvieron de CHASM (Boston, MA). Se sabe que el método CoMoCAT produce SWCNT de una pequeña cantidad de ( n , m ) quiralidades con alta selectividad [19]. La muestra utilizada en este estudio está altamente enriquecida en [5, 6] SWCNT, que exhibe una fuerte absorción de luz NIR a una longitud de onda de 980 nm. Esta absorción corresponde a la S ₁₁ transición para este tipo de nanotubos entre una singularidad de van Hove ocupada a la correspondiente desocupada. Por lo tanto, para maximizar la absorción de radiación por el SWCNT depositado en los tumores, la longitud de onda del láser utilizado en este estudio fue de 980 nm para coincidir exactamente con la del S ₁₁ transición óptica [20]. La Figura S1 en el archivo adicional 1 muestra los espectros de fluorescencia, mostrando claramente el S ₁₁ Emisión NIR después de excitar la transición S22 con luz visible.

Cultivo celular

Se cultivaron células de cáncer de mama EMT6 de ATCC (Manassas, VA) en medio MB 752/1 de Waymouth con L-glutamina 2 mM suplementado con FBS al 15%. Todas las células se cultivaron a 37 ° C y 100% de humedad bajo 5% de CO ₂ . Todas las células se pasaron usando tripsina al 0,25% (p / v) en EDTA 0,53 mM. El linaje celular y el estado libre de micoplasmas se confirmaron mediante pruebas de STR (Charles River) y se determinó que estaban libres de endotoxinas mediante el ensayo de limulus.

Producción de ANXA5 y SWCNT-ANXA5

El conjugado SWCNT-ANXA5 se preparó utilizando un procedimiento que desarrollamos previamente que da 2,5 mg ANXA5 / mg SWCNT [11]. Brevemente, E. coli transfectados con un plásmido que codifica ANXA5, pET-30 Ek / LIC / ANX, se cultivaron y purificaron mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados con Ni ²⁺ inmovilizado para aislar el ANXA5, que implicó la escisión enzimática para eliminar un (His) ₆ etiqueta. Los SWCNT de CoMoCAT liofilizados se dispersaron en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1% usando dos ciclos de sonicación con sonda a 20 W y centrifugación a 29.600 g durante 30 min cada uno. Los SWCNT suspendidos se caracterizaron por fluorescencia NIR (archivo adicional 1:Figura S1) y luego se conjugaron con un enlazador 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-polietilenglicol-maleimida (DSPE-PEG-maleimida) durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la interacción hidrofóbica entre SWCNT y el grupo funcional DSPE. A continuación, esto fue seguido por una diálisis de 8 h en agua destilada para eliminar el exceso de ligador y SDS. A continuación, el conjugado dializado se hizo reaccionar con ANXA5, que contiene un grupo cisteína, durante 2 hy se bloqueó con 1,5 mg ml ⁻¹ L-cisteína. El producto final, SWCNT-ANXA5, se dializó frente a tampón de fosfato de sodio 20 mM durante 8 h para eliminar el exceso de ANXA5 y L-cisteína. El peso y la pureza de la proteína se caracterizaron mediante SDS-PAGE. El contenido de SWCNT y ANXA5 del bioconjugado se caracterizó por espectroscopia de fluorescencia UV-Vis-NIR, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) análisis Raman y ensayo de Bradford (archivo adicional 1:Figura S2).

Estudios in vivo

Todos los procedimientos cumplieron con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad de Oklahoma. Se utilizaron ratones hembra BALB / cJ de 6 semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Los ratones se alimentaron con una dieta estándar de pienso. Durante la irradiación fototérmica de los tumores con una luz láser NIR, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2% y oxígeno al 98% usando un cono nasal.

Los tumores se indujeron mediante una inyección ortotópica de 10 ⁶ Células de cáncer de mama de ratón EMT6 en 100 µl de PBS en la almohadilla de grasa mamaria intravenosa. Se permitió que los tumores crecieran durante 12 días y cuando alcanzaron un volumen de 60 mm ³ (~ 5 mm de diámetro), los ratones recibieron una vía i.v. inyección de 1,2 mg / kg de SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT por kg de peso corporal) bioconjugado a través de la vena lateral de la cola. Después de 3 h, se irradió una región de 5 mm por encima del límite del tumor con luz NIR (980 nm) a un nivel de energía y potencia de 175 J / cm ² y 1 W / cm ² , respectivamente (tiempo de 175 s; láser Diodevet-50 NIR, B&W Tek Inc., Newark, DE). La inhibición del punto de control se logró mediante i.p. administración de 200 µg de anticuerpo anti-CTLA-4 en 100 µl de PBS los días 8, 11 y 16 después de la inoculación del tumor. El volumen del tumor se calculó con la fórmula elipsoide modificada \ (V =\ frac {1} {2} \ times {\ text {length}} \ times {\ text {width}} ^ {2} \) usando medidas de calibre de dimensión más larga y ancho perpendicular. La temperatura del tumor se controló con una cámara térmica portátil FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, Reino Unido) configurada para escaneo automático para la temperatura máxima detectada. Los órganos diana se recolectaron para la evaluación de la toxicidad y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, y se prepararon portaobjetos fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE) y se tiñeron con hematoxilina y eosina para el análisis de toxicidad.

Detección Ex Vivo SWCNT

Los ratones recibieron una inyección sistémica de 1,2 mg / kg de SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT / kg de peso corporal) a través de la vena lateral de la cola. En determinados momentos, los ratones ( n =3) se sacrificaron, se les practicó la necropsia y se extrajeron los órganos diana para su análisis. Las muestras de tejido se prepararon como se describió anteriormente [21]. A continuación, se determinó la presencia de SWCNT en muestras de tejido ex vivo mediante espectroscopia de fluorescencia NIR relativa utilizando un NanoSpectralyzer NS3 (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Citometría de flujo

Los ratones se sacrificaron 14 días después del tratamiento y se cuantificaron las células efectoras inmunitarias antitumorales esplénicas como se describió anteriormente [21].

Detección de citocinas

Después del tratamiento como se describe anteriormente, los ratones ( n =4-5) fueron sacrificados 7 días después de la terapia fototérmica para la recolección de sangre. La concentración del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interferón gamma (IFN-γ) e interleucina 6 (IL-6) en muestras de suero diluido se cuantificó mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del proveedor.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron con el software Graphpad Prism. La significación estadística se evaluó mediante un ANOVA de una vía y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. La significación estadística de las curvas de supervivencia se determinó mediante la prueba de rango logarítmico de Mantel-Haenszel. La significación estadística de la concentración sérica de citoquinas se analizó mediante ANOVA unidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Las comparaciones múltiples se corrigieron mediante el umbral de Bonferroni. El error se representa gráficamente como el error estándar de la media, a menos que el error no supere el tamaño del símbolo del punto medio trazado, en cuyo caso las barras se excluyeron para mayor claridad.

Resultados

Cinética térmica

Usando una dosis de 1.2 mg / kg SWCNT-ANXA5, se registró la temperatura máxima de los tumores durante el curso del tratamiento con luz NIR, como se indica en la Fig. 1. Los ratones que recibieron SWCNT-ANXA5 antes de la irradiación tuvieron temperaturas tumorales más altas para el todo el tratamiento con luz NIR en comparación con los ratones que recibieron solución salina fisiológica. La temperatura media del tumor para los ratones que recibieron SWCNT-ANXA5 fue significativamente diferente de la de los ratones que recibieron solución salina fisiológica (54 ° C frente a 37 ° C, p <0,05). Como resultado de esta terapia fototérmica mejorada, solo en el grupo SWCNT-ANXA5 se produjo la ablación del tumor visible. La ablación del tumor se caracterizó por una rápida decoloración, seguida de una contractura de la piel y la aparición de arrugas. En 48 h, se formó una escara significativa en el sitio de la ablación fototérmica. El recrecimiento completo de la piel tomó varias semanas.

Cinética térmica resultante de la radiación de tumores con luz NIR a 980 nm. Se inyectaron ratones BALB / cJ que portaban tumores EMT6 por vía intravenosa. en la vena de la cola con 1,2 mg / kg de SWCNT-ANXA5. Después de esperar 3 h para permitir la eliminación de SWCNT de la circulación, los tumores se irradiaron con un láser NIR a una densidad de energía y potencia de 175 J / cm ² y 1 W / cm ² , respectivamente ( t =175 s). La temperatura máxima del tumor se registró en función del tiempo. La temperatura de los tumores de los ratones que recibieron SWCNT fue significativamente más alta que la de los ratones que recibieron solución salina fisiológica a t =175 s ( p <0,05). Los datos se presentan como media ± SE ( n =3)

Terapia fototérmica e inhibición de puntos de control

En la figura 2 se muestran los resultados de combinar la terapia fototérmica con la inhibición del punto de control utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4. tratamiento de la metástasis del cáncer de mama. Con el fin de superar las deficiencias del tratamiento antineoplásico fototérmico NIR localizado, exploramos la combinación de esta modalidad de tratamiento terapéutico único con la inhibición sistémica del punto de control (Fig. 2). Mientras que la terapia fototérmica sobresalió en la destrucción de tumores EMT6 primarios (Fig. 2a), este tratamiento fracasó en erradicar la metástasis y solo aumentó modestamente la supervivencia de los ratones que portaban tumores ortotópicos EMT6 (Fig. 2b). Por el contrario, la inhibición del punto de control con anti-CTLA-4 mejoró la supervivencia general pero solo retrasó temporalmente el crecimiento del tumor primario. Si bien ninguna de las terapias por sí sola produjo aumentos en la supervivencia general, la combinación de la terapia fototérmica mejorada con SWCNT-ANXA5 y la inhibición del punto de control anti-CTLA-4 mejoró la supervivencia general, lo que llevó a una supervivencia del 55% a los 100 días posteriores a la inoculación del tumor.

Resultados de la terapia fototérmica combinatoria (PTT) y la inhibición del punto de control (anti-CTLA-4) en tumores EMT6. Ratones con tumores singénicos ortotópicos bien desarrollados ( d ≥ 5 mm) se les administró una vía i.v. dosis sistémica de 1,2 mg / kg SWCNT-ANXA5. un A continuación, se controlaron los volúmenes de los tumores después de la irradiación (flecha) con luz láser NIR durante 175 sa una densidad de potencia de 1 W / cm ² el día 12 después de la inoculación. Además de PTT, grupos seleccionados recibieron anti-CTLA-4 (100 µg) los días 8, 11 y 16. Los ratones del grupo de control se inyectaron i.v. con suero fisiológico. El volumen del tumor se muestra como media ± SE ( n =7). La significancia en comparación con el control está indicada por * ( p <0,05). b La combinación de terapia fototérmica e inhibición de los puntos de control inmunológico aumentó significativamente la supervivencia en comparación con los controles ( p <0.05, n =7). c , d Solo cuando los ratones recibieron terapia fototérmica junto con la inhibición del punto de control anti-CTLA-4 aumentaron significativamente los números relativos de CD4 ⁺ y CD8 ⁺ esplenocitos observados 2 semanas después de la PTT. Los esplenocitos se muestran como media ± SE ( n =3). La significancia está indicada por *** ( p <0,005)

El análisis citométrico de las células efectoras esplénicas después del tratamiento reveló un mecanismo putativo de supervivencia mejorada en ratones que recibieron terapia fototérmica combinatoria e inhibición de puntos de control. Los ratones se inocularon con EMT6 y se trataron como se describió anteriormente. Dos semanas después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se cuantificaron tanto los porcentajes como el número relativo de múltiples tipos de efectores inmunes. Se evaluaron las poblaciones de células T colaboradoras, células T citotóxicas, neutrófilos, monocitos de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), células T reguladoras FoxP3 y macrófagos (archivo adicional 1:Figura S3). El análisis de estas poblaciones reveló diferencias significativas entre las poblaciones de tratamiento y los controles solo en ratones que recibieron la combinación de terapia fototérmica e inhibición del punto de control anti-CTLA-4 juntas. En aquellos animales que recibieron esta combinación, observamos un aumento en el número relativo de células T colaboradoras (CD4 ⁺ ) y células T citotóxicas (CD8 ⁺ ), (Fig. 2c, d). Incrementos en CD4 ⁺ y CD8 ⁺ los recuentos de células se correlacionaron con los aumentos brutos en el tamaño del bazo observados después de la necropsia.

Además del análisis citométrico de las células efectoras esplénicas, se determinó la concentración de citocinas en suero 7 días después de la PTT para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad antitumoral. Los niveles de las citocinas proinflamatorias IL-6, IFN-γ y TNF-α se presentan en la Fig. 3. Ni el tratamiento con SWCNT ni con anti-CTLA-4 solos aumentaron significativamente los niveles de citocinas en comparación con el grupo de control no tratado. Sin embargo, el tratamiento con PTT solo pudo aumentar significativamente el TNF-α. La adición adicional de anti-CTLA-4 al tratamiento con PTT aumentó significativamente los niveles de TNF-α, IL-6 e IFN-γ.

Concentración de citocinas en suero. La cuantificación de los niveles de citocinas en suero de ratón 7 días después de PTT mostró un aumento significativo de los niveles de IL-6, IFN-γ y TNF-α en ratones después de PTT junto con la inhibición del punto de control (anti-CTLA-4). Los resultados se muestran para el control no tratado, solo tratamiento SWCNT, solo tratamiento anti-CTLA-4, tratamiento PTT y tratamiento PTT + anti-CTLA-4. Los datos se presentan como media ± SE ( n =4-5). Se analizó la significación estadística para los grupos tratados en comparación con el grupo de control no tratado mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. La significancia estadística está indicada por * ( p <0.05) y **** ( p <0,0001)

Biodistribución y toxicidad de SWCNT-ANXA5

La biodistribución de SWCNT-ANXA5 después de la administración para la mejora de la terapia fototérmica en varios órganos se controló con cuantificación fluorescente de SWCNT en lisados de tejido ex situ en comparación con los estándares (archivo adicional 1:Figura S4). Se siguió la biodistribución en los órganos diana durante un período de 4 meses después de la administración i.v. inyección de 1,2 mg / kg de SWCNT-ANXA5 en ratones sanos (Fig. 4a, b). Por el contrario, la acumulación de SWCNT-ANXA5 en ratones portadores de tumor EMT6 después de la administración, según el protocolo de inyección descrito anteriormente, se determinó a las 3 h después de la administración. (El momento en el que se realizó la terapia fototérmica en el estudio de tratamiento). Durante el período de 4 meses anterior a la extracción de órganos, se controló a los ratones para detectar efectos secundarios físicos y comportamiento anormal. No se observaron efectos secundarios en ningún ratón inyectado con SWCNT-ANXA5 durante este período de tiempo. No se observó toxicidad histopatológica durante el examen de secciones de FFPE teñidas con hematoxilina y eosina de los órganos diana al final del estudio (archivo adicional 1:Figura S5).

Biodistribución de SWCNT-ANXA5 medida como% de la dosis inyectada ( a ) y concentración tisular en g / L ( b ). El conjugado SWCNT-ANXA5 fue i.v. inyectado en ratones Balb / cJ a una dosis de 1,2 mg / kg. La concentración de SWCNT se midió en varios órganos de ratones sin tumores después de 1, 2, 3 y 4 meses (de izquierda a derecha). Para los ratones con tumores, la concentración de SWCNT se midió en ese momento como sería inmediatamente antes del tratamiento con terapia fototérmica. Los datos se muestran como media ± SE ( n =3)

Discusión

Los datos presentados aquí respaldan la eficacia de la combinación de la terapia fototérmica dirigida y la inhibición del punto de control inmunológico para el tratamiento del cáncer de mama metastásico. Este fenómeno se conoce como "efecto abscopal", que describe la capacidad de la radiación localizada para iniciar una respuesta antitumoral que suprime el crecimiento tumoral distante del objetivo principal. Ya en la década de 1950, los investigadores observaron que la irradiación tumoral localizada tenía un efecto significativo sobre los tumores distantes [22]. Los estudios han establecido que la naturaleza sistémica del efecto abscopal se debe a la respuesta inmunitaria del huésped [23,24,25]. Si bien la irradiación γ ha sido el foco principal de la mayoría de las investigaciones abscopales, un creciente cuerpo de trabajo demuestra que la terapia fototérmica también puede inducir un efecto abscopal. Numerosos estudios han demostrado que la ablación térmica en combinación con el inhibidor del punto de control anti-CTLA-4, produce una respuesta inmunitaria intensificada [16, 26, 27, 28, 29]. Observamos una respuesta abscopal similar después de la ablación fototérmica dirigida y el bloqueo anti-CTLA-4 en el modelo EMT6 de cáncer de mama.

El efecto abscopal se ilustra con los datos de la Fig. 2a, b. Los tumores EMT6 ortotópicos crecen rápidamente y han hecho metástasis cuando son tratados con terapia fototérmica. Esta es la razón por la que los ratones con tumores tratados solo con terapia fototérmica tuvieron solo un ligero aumento en la supervivencia en comparación con los ratones de control no tratados, a pesar de que el tumor primario había sido completamente extirpado. La administración de anti-CTLA-4 solo retrasó el crecimiento del tumor en comparación con el control y aumentó el tiempo de supervivencia a 68 días, pero no condujo a la curación. Jure-Kunkel et al. Observaron un resultado similar de retraso en el crecimiento del tumor EMT6. cuando se administró anti-CTLA-4 [30]. Para la combinación de terapia fototérmica y anti-CTLA-4, el 55% de los ratones tratados sobrevivieron 100 días después de la inoculación del tumor y probablemente se curaron.

Se evaluó la comprensión del mecanismo de la inmunidad antitumoral utilizando citometría de flujo para cuantificar las poblaciones de células efectoras inmunes en el bazo. En comparación con la terapia fototérmica o anti-CTLA-4 solo, la terapia de combinación resultó en un aumento de siete veces en CD4 auxiliar ⁺ Células T y un aumento de tres veces en CD8 citolítico ⁺ Células T, siendo ambos resultados altamente estadísticamente significativos ( p <0,005). Estos resultados proporcionan más pruebas de una posible respuesta abscopal mediante la combinación de fototerapia y terapia de coestimulación de células T con inhibición del punto de control inmunológico.

Incrementos en CD4 ⁺ y CD8 ⁺ recuentos de células correlacionados con aumentos en el tamaño del bazo observados durante la necropsia. El aumento del tamaño del bazo indica una mayor respuesta inmune. El bazo está compuesto por múltiples tipos de células, las más comunes son las CD4 ⁺ , CD8 ⁺ y linajes de células B [31, 32]. Si bien no se explora en este cuerpo de trabajo, esperaríamos que los recuentos de células B aumentaran junto con CD4 ⁺ y CD8 ⁺ Recuento de células T [33]. Ayudante CD4 ⁺ Las células T ayudan en la inmunidad humoral al facilitar otras células inmunes mediante la estimulación de citocinas y las interacciones directas entre células. CD8 citolítico ⁺ Las células T matan directamente las células tumorales. Incrementos en CD4 ⁺ y CD8 ⁺ los recuentos de células son indicativos de una respuesta inmune abscopal sistémica.

La presencia de una respuesta inmune abscopal sistémica después del tratamiento de combinación se ve reforzada por aumentos en los niveles de citocinas proinflamatorias en suero de ratón (Fig. 3). El TNF-α activa los macrófagos asociados a tumores para presentar efectos antitumorales [34, 35]. El IFN-γ juega un papel importante en la vigilancia de tumores [36, 37]. IL-6 promueve la proliferación de macrófagos y linfocitos [38]. El aumento significativo de estas moléculas efectoras en el suero de ratón 7 días después del tratamiento con PTT combinado con anti-CTLA-4 respalda aún más la existencia de una respuesta inmune antitumoral.

Al final de la irradiación de los ratones que recibieron SWCNT, la temperatura media máxima del tumor fue de 54 ° C; esta temperatura fue suficiente para extirpar completamente el tumor (Fig. 1). Esto está dentro del rango de 45-60 ° C en el que se produce la inactivación enzimática y la lesión mitocondrial [39]. La temperatura de los tumores en el grupo de control con solución salina se mantuvo por debajo de los 40 ° C, una temperatura que proporciona un beneficio terapéutico mínimo [39,40,41].

Observamos que la mayor parte de la acumulación de SWCNT-ANXA5 basada en la concentración se encontraba principalmente en el hígado, el corazón, el bazo, los riñones, los pulmones y el tumor (Fig. 4a). En ratones con tumores EMT6, observamos que la concentración de SWCNT-ANXA5 era similar a la del hígado y los riñones (Fig. 4a, b). Se detectaron trazas de SWCNT-ANXA5 en el cerebro, el intestino grueso y el intestino delgado. Es importante señalar que la biodistribución de SWCNT sobre la base del% de la dosis inyectada (ID) no se correlaciona bien con la concentración absoluta de SWCNT dentro de un tejido diana. Esto se debe principalmente a las diferencias entre los pesos de los órganos. Por ejemplo, un% ID dado dentro de un órgano corresponderá a una concentración más alta dentro de órganos más pequeños y concentraciones más pequeñas dentro de órganos más grandes. La comparación de muestras sobre la base de la concentración de SWCNT revela que la concentración más alta se encuentra dentro del riñón, seguida de cerca por el hígado y el bazo (Fig. 4a).

Existe alguna evidencia de degradación de SWCNT en los diversos órganos durante el período del estudio de biodistribución (Fig. 4a, b). Se espera la degradación de los SWCNT en los órganos basándose en un hallazgo previo de que los nanotubos de carbono de paredes múltiples se degradan en los macrófagos [42]. Los SWCNT utilizados en nuestro estudio tienen un diámetro medio de 0,8 nm y una longitud media de 1500 µm. No se prevé que este tamaño sea citotóxico según un estudio de Zhu et al. [43], que clasificó el potencial de daño de la bicapa lipídica por la toxicidad de los nanotubos de carbono basándose en la longitud y el diámetro. Según esta clasificación, los SWCNT que usamos están en la categoría "biológicamente blandos", minimizando la citotoxicidad, lo cual es consistente con nuestras observaciones en los estudios en ratones donde no observamos ningún efecto secundario o toxicidad histopatológica como resultado de la administración del SWCNT. -Conjugado ANXA5.

Conclusiones

Aquí, demostramos una nueva modalidad de tratamiento combinatorio en la que obtenemos una tasa de supervivencia relativamente alta en ratones con cáncer de mama metastásico agresivo utilizando terapia fototérmica con el bioconjugado SWCNT-ANXA5 combinado con inhibición del punto de control basado en anti-CTLA-4. El uso de la proteína de dirección vascular del tumor ANXA5 minimizó la cantidad de SWCNT administrada sistémicamente necesaria para erradicar los tumores primarios en una dosis baja única. Curiosamente, notamos un aumento en la supervivencia de los ratones con cáncer metastásico tratados con terapia combinatoria, aunque solo se irradió el tumor primario. Un estudio mecanicista que cuantificó el número de células efectoras antitumorales esplénicas importantes reveló que solo la combinación de ambas modalidades de tratamiento aumentó el número de CD4 ⁺ helper y CD8 ⁺ Células T citotóxicas. Presumimos que este aumento en las células T refleja una respuesta abscopal, donde las células efectoras antitumorales suprimieron la metástasis tumoral. Aunque se encontró que los SWCNT todavía estaban presentes en los órganos 4 meses después de la administración, no se observaron efectos secundarios ni toxicidad aparente en los tejidos durante el curso de los experimentos.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricciones.

Abreviaturas

SWCNT:: Nanotubos de carbono de pared simple
ANXA5:: Anexo en A5
anti-CTLA-4:: Proteína 4 asociada a linfocitos T anticitotóxicos
EDTA:: Ácido etilendiaminotetraacético
SDS-PAGE:: Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis
DSPE:: 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
PTT:: Terapia fototérmica

Preparación del fotoanodo de nanotubos SnIn4S8 / TiO2 y su protección fotocatódica para acero al carbono Q235 bajo luz visible Emisión UV mejorada de ZnO en matrices de nanopartículas de plata por el efecto de resonancia de plasma superficial

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