Administración dirigida de artemisinina mediante MOF recubierto con Fe(II)-ácido tánico potencia la ferroptosis en cáncer de mama triple negativo

Resumen

La supresión del desarrollo tumoral mediante inducción de ferroptosis puede proporcionar un remedio potencial para el cáncer de mama triple negativo (CMTN), sensible al desequilibrio oxidativo intracelular. Recientemente, la artemisinina (ART) y sus derivados se han investigado como agentes anticancerígenos potenciales para tratamiento de cánceres altamente agresivos vía inducción de ferroptosis por escisión del puente endoperóxido mediada por hierro. Debido a su pobre solubilidad en agua y limitado contenido de hierro intracelular, es difícil su aplicación en terapia antitumoral. Aquí desarrollamos un nanotransportador de suministro ferroso para ART basado en ácido tánico (TA) y ion ferroso (Fe(II)) recubiertos sobre marco zeolítico imidazolato-8 (ZIF) con ART encapsulado (TA-Fe/ART@ZIF) mediante autoensamblaje impulsado por coordinación. Experimentos de liberación de fármaco mostraron que ART apenas se liberó a pH 7,4, mientras que 59 % se liberó a pH 5,0 tras 10 h, demostrando excelente liberación desencadenada por pH. Mientras tanto, un alto nivel de ROS y MDA intracelulares, acompañado de disminución de GSH y GPX4, mostró que el nuevo sistema nano-fármaco potencia marcadamente la ferroptosis. Comparado con monoterapia, experimentos de inhibición tumoral in vitro e in vivo demostraron mayor eficiencia de supresión tumoral de TA-Fe/ART@ZIF. Este trabajo proporciona un enfoque novedoso para potenciar la potencia de nanomedicinas ferroptóticas y nuevas direcciones para terapia de CMTN.

Introducción

La ferroptosis, un subtipo recién descubierto de muerte celular, resulta en acumulación de hidroperóxidos lipídicos dependientes de hierro (LPO), llevando a daño de estructura e integridad celular. Evidencia emergente implica que la activación de ferroptosis por varias moléculas pequeñas es un enfoque efectivo para supresión tumoral en diversos modelos experimentales de cáncer, creando altas expectativas para el potencial de la ferroptosis como nueva terapia anticancerígena. El cáncer de mama triple negativo (CMTN) es el subtipo más agresivo de cáncer de mama, carente de terapias dirigidas y a menudo asociado a recurrencia tumoral, metástasis a distancia y resistencia a terapia. Estudios previos señalan que el antiporter xCT cistina/glutamato está altamente expresado en numerosas células de CMTN, jugando papel importante en mantener niveles de glutatión (GSH) y equilibrio redox. La reducción del contenido intracelular de GSH puede hacer que las células de CMTN sean sensibles a ferroptosis, matando células tumorales. Notablemente, la ferroptosis también puede eludir la resistencia de CMTN a apoptosis programada rutinaria. Por tanto, estrategias o fármacos basados en inducir ferroptosis pueden tener potencial terapéutico para tratamiento clínico de CMTN refractario.

La artemisinina (ART), una lactona sesquiterpénica que contiene grupo peroxido, se aisló de la planta china tradicional Artemisia annua y ha demostrado actividad antitumoral deseable en múltiples líneas celulares de cáncer. Evidencia creciente muestra que células cancerosas contienen significativamente más reserva de hierro intracelular que células normales, mientras que la escisión del puente endoperóxido mediada por hierro permite a ART causar muerte celular selectiva en múltiples líneas cancerosas. La actividad antitumoral dependiente de ion hierro ha atraído creciente atención sobre la ferroptosis regulada por ART. Mecanísticamente, ART puede inducir degradación lisosomal de ferritina de manera independiente de autofagia, aumentando niveles celulares de ion ferroso y sensibilizando células a ferroptosis.

Sin embargo, si ART induce ferroptosis en CMTN permanece incierto. Además, factores como pobre solubilidad en agua e insuficiente disponibilidad de iones ferrosos intracelulares limitan la aplicación de ART en terapia antitumoral. Se espera que nanocomplejos de ART se usen exitosamente como sistema prospectivo de administración de nanofármacos para fármacos antitumoral basados en ART. En años recientes, marcos orgánico-metálicos (MOF), clase de material polimérico poroso, atraen atención por demostraciones de grandes tamaños de poro, altas áreas superficiales aparentes y captación selectiva de moléculas pequeñas. Como representativo de materiales tipo MOF, el marco zeolítico imidazolato (ZIF-8) se usa ampliamente en desarrollo de nanomedicinas con características de respuesta a pH, alta carga de fármaco y buena biocompatibilidad. Además, la capacidad de incorporar superficie ajustable en MOF permite controlar propiedades superficiales y dotarlas de multifuncionalidades. El autoensamblaje supramolecular de un recubrimiento de coordinación metal-fenólico en la superficie del MOF ha atraído interés recientemente por propiedades deseables como desensamblaje responsivo a estímulos, estabilidad coloidal y biocompatibilidad. Los materiales de coordinación metal-fenólico en el MOF podrían ser vehículo ideal para administrar ART hidrofóbico.

Inspirados por esto, desarrollamos un nanosistema de coordinación de ion ferroso-ácido tánico recubierto sobre ZIF-8 encapsulando ART (TA-Fe/ART@ZIF) para regular ferroptosis en células de CMTN, demostrado en Fig. 1. ZIF-8 se seleccionó como nanotransportador para encapsular ART por su buena biocompatibilidad y liberación responsiva a pH. El recubrimiento de coordinación Fe(II)-TA se inmovilizó en la superficie de ART@ZIF para estabilidad de dispersión y suministro de iones ferrosos (Fe(II)). Tras la internalización del nanosistema en células, la degradación ácida de los vehículos facilitaría la liberación de ART y acumulación de Fe(II). La regulación al alza de niveles de Fe(II) en células descompondría ART en radicales mediante escisión del puente endoperóxido mediado por hierro, potenciando marcadamente los efectos de ferroptosis. Conclusivamente, el descubrimiento de ferroptosis mediada por TA-Fe/ART@ZIF puede ofrecer nuevas perspectivas para desarrollo de tratamientos novedosos contra CMTN.

Materiales y métodos

Reactivos

Artemisinina (99 %), 2-metilimidazol (98 %), nitrato de zinc (ZnNO₃; 98 %), TA (98 %), sulfato ferroso (FeSO₄; 98 %) y metanol anhidro fueron proporcionados por Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China).

Fabricación de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF

Para preparación de nanopartículas ART@ZIF, 200 mg de ART se disolvieron en 1 mL de metanol anhidro, y 2 g de 2-metilimidazol (disolvente 8 mL metanol absoluto) se añadieron lentamente a la solución de ART obtenida. Bajo agitación magnética, 0,2 g de nitrato de zinc (disolvente 1 mL metanol absoluto) se añadió lentamente. Finalmente, el volumen de la solución se ajustó a 15 mL y se agitó 10 min para obtener solución blanca clara. Tras centrifugación a 10 000 rpm, la muestra se lavó tres veces con metanol. El sobrenadante midió contenido de ART, mientras que el precipitado se liofilizó para obtener estado sólido para uso posterior.

Para preparación de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF, solución de TA (40 mg/mL en agua desionizada, 2 mL) se añadió lentamente a solución ART@ZIF (10 mg/mL, 4 mL). Tras agitar 20 min, se añadió lentamente 5 mg/mL de FeSO₄ a la solución anterior. Tras agitar repetidamente 30 min, se obtuvo solución púrpura oscura. Finalmente, el precipitado se recogió por centrifugación a 10 000 rpm. El precipitado se lavó tres veces con agua desionizada y se liofilizó para obtener TA-Fe/ART@ZIF para uso posterior.

Caracterización

TEM (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Japón) se usó para determinar morfología y composición elemental de cada parte de la nanopartícula. Dispersión dinámica de luz y potencial zeta (DLS; Zetasizer Nano system Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) evaluaron tamaño de partícula y estabilidad eléctrica. Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Alemania) y análisis termogravimétrico analizaron composición de constituyentes. Mediciones de fotoelectrónica de rayos X (XPS) se tomaron con PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). La composición elemental del material TA-Fe/ART@ZIF se realizó mediante EDX (Carl Zeiss Modelo: Neon-40).

Medición de eficiencia de encapsulación y capacidad de carga

Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) midió cantidad de ART en sobrenadante. La carga y eficiencia de encapsulación de ART se calculan como:

Carga de fármaco (%) = (Cantidad real de fármaco encapsulado en NP / Cantidad de NP) × 100 %

Eficiencia de encapsulación (%) = (Cantidad real de fármaco encapsulado en NP / Cantidad inicial de fármaco usado) × 100 %

Liberación in vitro y respuesta a pH de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF

La membrana de diálisis tratada envuelta con 2 mg de nanopartículas se colocó en 50 mL de solución salina fosfatada (PBS) con pH 7,4 y 5,0 respectivamente, y se agitó continuamente a 37 °C. La solución fuera de la membrana se muestreó a 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 10 h tras inicio. Los contenidos de ART en solución tampón se midieron por HPLC.

Cultivo celular

Líneas celulares MDA‐MB‐231 y L929 se adquirieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron a 37 °C y 5 % CO₂ en medio RPMI-1640 (Solarbio, Beijing, China), suplementado con 10 % suero fetal bovino (Cyclone, Utah, EE. UU.), 100 µg/mL piruvato sódico, penicilina y estreptomicina (Solarbio Beijing, China).

Prueba de toxicidad celular in vitro

La viabilidad celular se determinó mediante ensayo MTT según procedimientos bibliográficos. Células MDA-MB-231 y L929 se cultivaron en medios estándar en placas de 96 pocillos (5000 células/pocillo) e incubaron en 5 % CO₂ a 37 °C por 24 h. El fluido del pocillo se descartó, y se añadieron 100 µL por pocillo de medio libre de suero con PBS y diferentes concentraciones de ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, deferoxamina (DFO), Z-VAD-FMK y ferrostatin-1 (Fer1). Tras 48 h, se añadieron 10 µL de MTT (5 mg/mL) e incubaron 4 h más. Finalmente, un lector de enzimas automático (BioTek Instruments Inc., EE. UU.) midió absorbancia en cada pocillo. Resultados se expresaron como porcentaje de viabilidad celular.

Ensayo de tinción Calcein-AM

Células MDA-MB-231 se cultivaron en placas de 24 pocillos (2 × 10⁴ células/pocillo) e incubaron 24 h. Posteriormente, se trataron con diferentes concentraciones de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF por 24 h. Tras descartar medio, las células se tiñeron con Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) en oscuridad a 4 °C por 20 min y observaron bajo microscopio de fluorescencia invertido (Olympus, Tokyo, Japón).

Citometría de flujo para apoptosis

Células MDA-MB-231 se colocaron en placa de 6 pocillos a densidad 2,5 × 10⁵ células/pocillo bajo mismas condiciones. Tras tratamiento con PBS, ART, TA-Fe/ZIF y TA-Fe/ART@ZIF por 24 h, las células se centrifugaron y recogieron. Tras doble tinción con yoduro de propidio y Annexin-V (Kit Annexin V‐FITC; Beckman Coulter, Marsella, Francia), se usó citometría de flujo para detectar.

Determinación in vitro de especies reactivas de oxígeno (ROS)

El contenido de ROS en células se realizó usando sonda de fluorescencia ROS (dicloro-dihidro-fluoresceína diacetato (DCFH-DA), Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Células MDA-MB-231 se cultivaron en placas de 6 pocillos (2,5 × 10⁵ células/pocillo) e incubaron en 5 % CO₂ a 37 °C por 24 h. El fluido de pocillos se descartó, y las células se trataron: grupo control en blanco (medio libre de suero), grupo control positivo, y grupo experimental (diferentes concentraciones de nanopartículas). Tras incubar 8 h a 37 °C, se añadió 0,1 % DCFH-DA a cada pocillo e incubó 30 min. Células no responsivas a DCFH-DA se removieron con PBS y observaron bajo microscopio de fluorescencia invertido (Olympus, Tokyo, Japón).

Determinación de contenido de malondialdehído (MDA) y GSH

Kit de ensayo MDA (método TBA; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China) y kit de ensayo GSH (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) midieron niveles intracelulares de MDA y GSH. Tras tratamiento con PBS, ART, TA-Fe/ZIF y TA-Fe/ART@ZIF, células MDA-MB-231 se recogieron y contaron. El contenido intracelular de MDA y GSH se determinó según instrucciones de los kits.

Análisis por Western Blot

Células MDA-MB-231 tratadas con diferentes nanopartículas se lizaron con tampón de lisis RIPA. Tras determinar concentración de proteína, las proteínas de diferentes muestras se separaron usando gel SDS-PAGE al 10 % y transfirieron a membrana de nitrocelulosa. La membrana cargada con proteínas de muestra se bloqueó con solución de proteína BSA al 0,5 % por 1 h, y la membrana e anticuerpos primarios incubaron 24 h a 4 °C. Se enjuagaron anticuerpos primarios con TBST y continuaron con anticuerpos secundarios correspondientes a temperatura ambiente por 2 h. Tras lavar anticuerpos secundarios, la membrana se usó con solución quimioluminiscente y observó bajo sistema de imagen de gel.

Experimento antitumoral in vivo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por Comité de Ética de Universidad Médica de Weifang. Ratones nu/nu hembras sanas (edad: 4 semanas; peso: 13–17 g; Vital River, Beijing, China) se administraron 5 × 10⁶ células MDA-MB-231 en 150 µL de PBS. Cuando volumen tumoral aumentó a 70–120 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos. Cada grupo se trató separadamente con PBS, ART (20 mg/kg), TA-Fe/ZIF (80 mg/kg) y TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg). Cada ratón recibió inyección intraperitoneal cada tres días. Tras 14 días, todos los ratones fueron sacrificados. Tejidos tumorales y órganos importantes se recogieron para tinción hematoxilina-eosina.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Todos los datos se analizaron estadísticamente usando software SPSS versión 22.0 (IBM Corp., Armonk, EE. UU.). Resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Valores p < 0,05 denotaron significancia estadística.

Resultados y discusión

Caracterización de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF

Primero, nanopartículas ART@ZIF se sintetizaron a temperatura ambiente desde metanol, acetato de zinc, 2-metilimidazol y ART según procedimientos bibliográficos. Películas supramoleculares estables de metal-polifenol se formaron rápidamente alrededor de plantillas ART@ZIF por vortex de TA e iones ferrosos. Comparado con nanopartículas magnéticas reportadas, TA-Fe/ART@ZIF se preparó vía método de autoensamblaje formateando membrana TA-Fe en superficie de MOF sin reacciones químicas duras o hidrotérmicas. Más importante, el nanotransportador TA-Fe/ART@ZIF puede ser desencadenado por pH bajo para liberar ART y Fe(II), que es catalizado por el endoperóxido de ART para generar radicales libres centrados en carbono, potenciando marcadamente la ferroptosis. La eficiencia de encapsulación, medida por HPLC usando sobrenadante de la primera centrifugación, fue 66,7 %. El sobrenadante obtenido por nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF dio carga calculada de ART de 11,4 %. Según espectroscopía FTIR (Fig. 2a), picos de absorción característicos de ART, enlace carbonilo a 1738 cm⁻¹ y puente peróxido a 724 cm⁻¹, se observaron en nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF, indicando encapsulación exitosa. Los resultados de análisis termogravimétrico revelaron que ART se abolió completamente al aumentar temperatura a ~400 °C (Fig. 2b). Comparado con nanopartículas TA-Fe/ZIF, se halló que ART representa 7,1 % del peso total de TA-Fe/ART@ZIF, consistente con análisis HPLC.

Resultados de TEM mostraron que ZIF-8 y ART@ZIF exhibieron configuración hexagonal uniforme similar, y distribución de tamaño ~100 nm (Fig. 3a, b). Nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF exhibieron configuración esférica, distribución de tamaño 150 nm. Comparado con ART@ZIF completo, TA-Fe/ART@ZIF recubierto con Fe(II) y TA demostró obvia estructura núcleo-cáscara convencional, y tamaño de membrana TA-Fe ~30 nm (Fig. 3a). Además, realizamos análisis de mapeo elemental de área de nanopartículas formadas. El mapeo confirmó que la periferia de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF estaba rodeada por elemento Fe, indicando recubrimiento exitoso de Fe(II) y TA (Fig. 3b). Mediciones XPS investigaron composición elemental superficial e interacción en compuesto TA-Fe/ART@ZIF. El espectro XPS de barrido amplio se muestra en Archivo Adicional 1: Fig. 1s. Picos principales en ~285, 408, 531, 737 y 1036 eV correspondieron a C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p y Zn 2p, demostrando formación de nanocompuesto TA-Fe/ART@ZIF. Imágenes de mapeo EDS se muestran en Archivo Adicional 1: Fig. 2s. Se halló claramente que picos correspondientes a carbono (C), nitrógeno (N), oxígeno (O), hierro (Fe) y zinc (Zn) concuerdan con espectro XPS. Al aumentar cantidad de Fe(II), el diámetro hidrodinámico de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF aumentó (Archivo Adicional 1: Fig. 3s). Para confirmar recubrimiento, medimos potencial zeta de varias nanopartículas. La formación de capa TA–Fe(II) en partículas ART@ZIF desplazó potencial zeta superficial de +21 mV a −19,5 mV por naturaleza ácida de TA (Archivo Adicional 1: Fig. 4s). Como reportó literatura previa, abundantes grupos polifenol en estructura de TA no solo otorgan capacidad de recubrimiento al sustrato, sino que coordinan con iones de metales de transición (Fe, Zn) para formar complejo metal-fenólico. Cuando Zn²⁺ y Hmim se mezclan para formar solución, masa de iones Zn²⁺ coordinarían en superficie de partículas ART@ZIF; así, potencial zeta de ART@ZIF es +21 mV. Grupos fenólicos de TA (pKa 8,5) se desprotonaron negativamente y pudieron interactuar con Zn²⁺ cargado positivamente, promoviendo crecimiento de película TA–Fe en superficie ART@ZIF. Como la administración de fármacos favorece transportadores, la estabilidad es factor importante para aplicación medicinal. La estabilidad de nanopartículas se demostró dispersando en PBS por una semana. Como se muestra en Archivo Adicional 1: Fig. 5s, el tamaño de partícula presentó tamaño y estabilidad deseables en curso de tiempo.

Liberación y citotoxicidad de TA-Fe/ART@ZIF in vitro

Para estudiar si TA-Fe/ART@ZIF tenía comportamiento de descomposición responsivo a pH, examinamos liberación de ART de nanopartículas en condiciones neutras y ácidas. Como se muestra en Fig. 4a, en condiciones ácidas, nanopartículas liberan rápidamente ~58 % de ART en 1 h. Sin embargo, en condiciones neutras, solo liberan lentamente una cantidad minúscula. Además, durante tratamiento de solución externa de membrana de diálisis con hidróxido de sodio, la solución del grupo pH = 5,0 reaccionó con hidróxido de sodio produciendo precipitado blanco considerable. Este fenómeno no se observó en grupo pH = 7,4.

Según nuestra hipótesis, el precipitado blanco es precipitado de hidróxido de zinc formado por disociación de iones zinc y álcali de nanopartículas en condiciones ácidas. Colectivamente, esta evidencia muestra exitosamente que nuestras nanopartículas tienen capacidad de disociarse en condiciones ácidas.

En el diseño del nanosistema TA-Fe/ART@ZIF, las estructuras TA-Fe(II) y ZIF se ablan para liberar ART y Fe(II) encapsulados en condiciones ácidas del microambiente tumoral. La regulación al alza de Fe(II) en células descompondría ART en radicales mediante escisión del puente endoperóxido mediado por hierro, potenciando marcadamente ferroptosis. En consecuencia, se realizaron ensayos MTT para estudiar citotoxicidad del nanosistema a células MDA-MB-231 y L929. Comparado con ART, nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF mostraron mayor citotoxicidad a MDA-MB-231 (Fig. 4b) y baja citotoxicidad a células normales (Fig. 4c). TA-Fe/ART@ZIF inhibió actividad de MDA-MB-231 en 53,9 %, mientras ART a misma concentración inhibió solo 24,1 %. Resultados experimentales de tinción Calcein-AM confirmaron que cantidad de células viables MDA-MB-231 descendió gradualmente al aumentar concentración de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF (Fig. 4d).

TA-Fe/ART@ZIF potencia generación de ROS en células MDA-MB-231

Se sabe que ART ejerce actividad anticancerígena vía generación de ROS producida por escisión del puente endoperóxido mediada por hierro. Por tanto, examinamos eficiencia de TA-Fe/ART@ZIF para inducir generación de ROS mediante sonda 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCHF-DA). Como se muestra en Fig. 5, señal de fluorescencia ligeramente más fuerte se observó en células tratadas con ART y TA-Fe/ZIF comparado con grupos sin tratar, indicando que ART e iones Fe(II) podían inducir generación de ROS. Por contraste, señal de fluorescencia fuerte expuesta a nanofármaco TA-Fe/ART@ZIF se halló en células como evidencia de rendimiento de ROS deseado, generado por escisión del endoperóxido de ART mediado por Fe(II). El nanosistema preparado en células se degradaría y acumularía Fe(II), potenciando notablemente generación de ROS. El efecto anticancerígeno de ART y derivados se atribuye a su capacidad para inducir apoptosis por diversos procesos celulares, desde respuesta a daño de DNA, proceso catabólico lisosomal macroautofagia, y estrés oxidativo. También se reportó que escisión del puente endoperóxido en ART mediada por hierro podría afectar equilibrio oxidativo intracelular a ferroptosis en muchos tipos de células cancerosas. Esta inducción de ferroptosis basada en desequilibrio oxidativo puede amplificarse con adición de Fe(II). Mientras Fe(II) activa ART, también reacciona con peróxido de hidrógeno intracelular para generar radicales hidroxilo mediante reacción de Fenton, potenciando efecto inductor de apoptosis de ART en células tumorales.

TA-Fe/ART@ZIF induce apoptosis y ferroptosis en células MDA-MB-231

Para investigar muerte celular y papel de Fe(II), utilizamos quelante de hierro deferoxamina, inhibidor de apoptosis Z-VAD-FMK, e inhibidor de ferroptosis ferrostatin-1 para rescatar células. Como se predijo, deferoxamina, quelante de Fe(II), bloqueó notablemente muerte celular, sugiriendo papel importante de Fe(II). Además, tasa de supervivencia de MDA-MB-231 mejoró significativamente con inhibidores de apoptosis y ferroptosis de 31,4 % a 56,3 % y 76,0 % respectivamente (Fig. 6a), destacando importancia de apoptosis y ferroptosis en muerte celular mediada por nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF. Además, empleamos ensayo basado en Annexin V-FITC mediante citometría de flujo para determinar cuantitativamente grado de apoptosis. Resultados indican que nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF inducen apoptosis en 21,8 % de células MDA-MB-231 (Archivo Adicional 1: Fig. 6s). Este porcentaje fue mayor que el registrado para ART, implicando que apoptosis está involucrada pero no es causa principal.

Rasgo común de ferroptosis es peroxidación lipídica endógena. MDA, producto de peroxidación lipídica, se investigó para evaluar grado de ferroptosis. Resultados mostraron nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF tenían ~2,5 veces mayor nivel de MDA que grupo control (Fig. 6b). Esto se presumió debido a presencia de Fe(II) enriquecido en nanotransportador y elevación correspondiente de niveles de radicales lipídicos. Como uno de los principales componentes antioxidantes en células, GSH intracelular disminuye acompañado de ferroptosis. Considerando papel importante de GSH en ferroptosis, evaluamos nivel intracelular de GSH tras tratamiento con nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF. GSH disminuyó significativamente comparado con células tratadas con vehículo (Fig. 6c). Esto proveyó fuerte evidencia de depleción de GSH y desequilibrio oxidativo centrado en activación de ART mediada por Fe(II) por nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF. Luego, Western blot se realizó para entender impacto de nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF en actividad GPX4. Observamos que nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF causaron inhibición significativamente mayor de actividad GPX4 que ART (Fig. 6d). Estos datos concordaron bien con mayor extensión de depleción de GSH.

Experimento antitumoral in vivo

Evaluamos eficacia antitumoral de nuestras nanopartículas a células MDA-MB-231 in vivo por inhibición de tumores xenoinjertos subcutáneos en ratones nu/nu portadores de tumor. Durante tratamiento de 14 días, relativo a otros grupos, nanopartículas TA-Fe/ART@ZIF inhibieron significativamente crecimiento de xenoinjertos MDA-MB-231 como resultado de abundante generación de ROS mediante reacción Fe(II)-ART (Fig. 7a). Además, no hubo diversidad significativa de peso corporal en todos los grupos (Fig. 7b), manifestando que TA-Fe/ART@ZIF tuvo efectos secundarios agudos insignificantes. Para estudiar efecto terapéutico, tumor y otros tejidos normales se examinaron por tinción H&E tras 14 d de tratamiento. Como se muestra en Fig. 8, TA-Fe/ART@ZIF causó mayor región de muerte celular en tejido tumoral, sin daño obvio ni apoptosis en tejidos normales. En general, resultados demostraron que terapia mediada por TA-Fe/ART@ZIF no solo condujo a eficacia anticancerígena, sino también bajo nivel de toxicidad sistémica aguda.

Conclusiones

En resumen, la ferroptosis proporciona remedio potencial para tratamientos de CMTN, ya que tiene ventajas exclusivas para superar barreras inevitables de terapia prevalente. Aquí diseñamos un nanotransportador de suministro ferroso para ART basado en TA–Fe(II) recubierto sobre nanopartículas ZIF con ART encapsulado vía autoensamblaje impulsado por coordinación para ferroptosis potenciada. El nanotransportador se disuelve en microambiente débilmente ácido para liberar ART y Fe(II), que causa alto nivel de ROS y MDA intracelulares, acompañado de disminución de GSH y GPX4, llevando a potente inhibición de crecimiento tumoral y eficacia anticancerígena in vitro e in vivo. Este trabajo proporciona enfoque novedoso para potenciar potencia de nanomedicinas ferroptóticas y nuevas direcciones para terapia de CMTN. Biocompatibilidad y mecanismos comprehensivos de ferroptosis inducida por TA-Fe/ART@ZIF deben asegurarse para investigación futura.