Nanopartículas híbridas magnéticas con nanopartículas de oro funcionalizadas con Her2:un agente teranóstico para la obtención de imágenes de modo dual y la terapia fototérmica del cáncer de mama

Materiales y métodos

Materiales

Poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, ácido carboxílico terminado, lactida:glicólido 50:50, Mw 24,000-38,000), clorhidrato de polialilamina (PAH, Mw 17,500) y trihidrato de ácido tetracloroaurico (III) (HAuCl ₄ · 3H ₂ O) se obtuvieron de Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, China). Se adquirieron nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas recubiertas con ácido oleico (OA-SPIO) con un diámetro medio de 10 nm de Shanghai So-Fe Biomedicine Co., Ltd. (Shanghai, China). Bromuro de perfluorooctilo (PFOB), alcohol polivinílico (PVA, 87-89% mol hidrolizado, bajo peso molecular), clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) y N -hidroxisuccinimida (NHS) se obtuvieron de Aladdin Chemistry Co., Ltd. (Shanghai, China). El poli (etilenglicol) terminado en carboxilo (SH-PEG-COOH, Mw 2000) y el anticuerpo anti-Her2 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se obtuvieron de Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, China). ) y Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.), respectivamente. Todos los demás reactivos utilizados fueron de calidad analítica.

Preparación de PFOB / SPIO en PLGA NP

PFOB / SPIOs @ PLGA NPs se fabricaron utilizando un método de evaporación de disolvente de emulsión de aceite / agua adaptado [24, 30]. Brevemente, se agregaron SPIO recubiertos con ácido oleico en hexano (0.5 mL, 20 mg / mL) a cloruro de metileno (3.6 mL) disolviendo PLGA (100 mg) y PFOB (60 μL). La fase orgánica resultante se añadió gota a gota a una solución acuosa de PVA preenfriada (20 ml, 2%, w / v ). Posteriormente, el sistema se emulsionó durante 2 min utilizando sonicación con sonda en un baño de agua helada con un ajuste de amplitud de salida del 80%. Posteriormente, la emulsión se agitó a temperatura ambiente durante 5 h, luego se centrifugó (16.000 rpm, 5 min, 15 ° C, Avanti J-25, Beckman Coulter) y se lavó dos veces con agua desionizada (DI) para obtener PFOB / SPIOs @ NP PLGA.

Preparación de PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPs

En primer lugar, se prepararon NP de oro estabilizadas con citrato con un diámetro medio de 5 nm como se informó anteriormente [21]. Mientras tanto, la suspensión de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs (1 mL) se mezcló en una solución de PAH (1.0 mg / mL en 0.5 mol / L de solución acuosa de NaCl) durante 30 min, seguido de centrifugación (15,000 rpm, 10 min, 15 ° C ) y lavar dos veces con agua desionizada. Luego, la mezcla se añadió en suspensión de NP de oro estabilizada con citrato (100 ml) y se agitó durante 30 min. Después de repetidos pasos de centrifugación / lavado, las NP de Au PFOB / SPIOs @ PLGA NP resultantes se volvieron a dispersar en HAuCl ₄ solución (2 ml, 1% p / v ) bajo agitación magnética. A continuación, solución de hidrocloruro de hidroxilamina recién preparada (NH ₂ OH · HCl, 0.3 mL, 0.5 mol / L) se agregó para reducir HAuCl ₄ para formar nanocapas de Au en la superficie de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs.

Preparación de NP de Her2-GPH

La solución acuosa preparada de PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPs (1 mL, 1 mg / mL) se mezcló con SH-PEG-COOH (5 mg) y se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. Después de centrifugar (16.000 rpm, 20 min, 15ºC) y lavar dos veces, el precipitado se dispersó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se introdujeron EDC (10 mg) y NHS (10 mg) y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 h para activar los grupos ácido carboxilo de las NP pegiladas, y luego se obtuvieron las NP activadas (NP GPH) mediante centrifugación / lavado repetidos. pasos. Posteriormente, se agregaron anticuerpos anti-Her2 con etiqueta FITC (10 μL, 0.38 mg / mL) a las dispersiones de NP activadas y se dejaron incubar durante 90 min en un agitador isotérmico. Finalmente, los anticuerpos libres se eliminaron mediante pasos de centrifugación / lavado para obtener PFOB / SPIO funcionalizados con Her2 @ PLGA @ Au NP (Her2-GPH NP).

Caracterizaciones

La estructura de la superficie y la morfología de las NP de Her2-GPH se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FE-SEM, Hitachi S-4800, Tokio, Japón). Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión de alta resolución (TEM, JEM-2100; JEOL, Tokio, Japón) para confirmar su estructura interna sumergiendo una muestra en rejillas de Cu recubiertas de carbono. La correspondiente espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS) de la muestra (sin proceso de pulverización catódica de oro) se adjuntó a TEM para analizar la composición elemental de las NP resultantes. El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de los NP de Her2-GPH se midieron utilizando un instrumento de dispersión dinámica de láser (DLS) (Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Los espectros de absorción UV-visible del agente en diferentes etapas de preparación se obtuvieron con un espectrofotómetro UV-visible (Beckman Coulter DU 730, EE. UU.). La cantidad de elementos de Au y Fe en las NP de Her2-GPH se evaluó mediante espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES, Vistampxicp Varian, EE. UU.).

Medición del rendimiento fototérmico

El rendimiento fototérmico de las NP de Her2-GPH se evaluó mediante el seguimiento del aumento de temperatura bajo irradiación con láser NIR. Se irradiaron diferentes concentraciones de soluciones acuosas de NP de Her2-GPH (50, 100, 150, 200 μg / mL) con un láser de 808 nm (1 W / cm ² ) durante 10 min en cubetas de cuarzo (volumen total de 1 mL), y la temperatura de las soluciones se midió con una cámara térmica FLIR A300 cada 10 s. Para evaluar la estabilidad fototérmica del agente, se adquirieron los espectros de absorción de los materiales antes y después del proceso de irradiación. Se irradió agua desionizada en las mismas condiciones para comparar.

Cultivo celular

La línea celular de carcinoma de mama humano SKBR3 (células SKBR3) que sobreexpresa Her2 y la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (células MDA-MB-231) de baja expresión de Her2 fueron del Instituto de Bioquímica y Biología Celular (Shanghai, China). Se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) Que contenía un 20% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina. Todas las células se cultivaron en un ambiente de 37 ° C y 5% de CO ₂ .

Ensayo de citotoxicidad in vitro

La citotoxicidad in vitro de las NP de Her2-GPH se evaluó mediante ensayos del kit 8 de recuento celular (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Japón) en células SKBR3 y MDA-MB-231. Los dos tipos de células se sembraron respectivamente en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁴ por pocillo y se incubó durante 24 h. Después de retirar el medio de cultivo, las células se trataron con diferentes concentraciones (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg / mL) de NP de Her2-GPH y se incubaron adicionalmente durante 12 o 24 h. Luego, se agregó la solución CCK-8 (10 μL de CCK-8 en 100 μL de DMEM) y se incubó durante 2 h más. Finalmente, se midió la densidad óptica (DO) de cada pocillo utilizando un lector de microplacas (Thermo Scientific Multiskan MK3) a la longitud de onda de 450 nm.

Estudios de focalización de receptores específicos in vitro

Microscopía de escaneo láser confocal

Las células SKBR3 y MDA-MB-231 se sembraron en placas de cultivo celular con fondo de vidrio ( Φ =20 mm) con una densidad de 2 × 10 ⁴ células / pocillo durante 24 h, y luego se dividieron en tres grupos, respectivamente, incluido el grupo no dirigido, el grupo dirigido y el grupo de inhibición dirigido. Se trataron dos tipos de células como grupo no dirigido con 100 µL de NP de GPH y las células del grupo objetivo se trataron con 100 µL de NP de Her2-GPH. En los grupos de inhibición dirigidos, las células se incubaron con anticuerpos anti-Her2 libres (20 μl) durante 30 minutos antes de tratarlas con NP de Her2-GPH. Después de la respectiva incubación de 30 min, las células se lavaron tres veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min. Luego, las células se tiñeron con un agente de tinción del núcleo (DAPI; Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) durante 10 min y se lavaron nuevamente con PBS. Finalmente, las células se observaron mediante microscopía confocal de barrido láser (LSCM) (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems Ltd., Mannheim, Alemania).

Citometría de flujo

Las células SKBR3 y MDA-MB-231 se cultivaron y trataron como se describió anteriormente, y las agrupaciones fueron consistentes con el ensayo LSCM. Todas las células se digirieron con tripsina y luego se resuspendieron en PBS antes de la citometría de flujo (FCM) con una densidad de 2 × 10 ⁵ células por tubo. La intensidad de fluorescencia de las células se determinó mediante un citómetro de flujo (FC500MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Se utilizaron células SKBR3 y MDA-MB-231 como controles en blanco para establecer las puertas. Luego, el voltaje y la compensación de fluorescencia de FL1 se ajustaron para asegurar que la fluorescencia espontánea de las células estuviera dentro de 10 ¹ del histograma de fluorescencia. Después de incubar las células con NP, las desviaciones de la intensidad de fluorescencia de los grupos en blanco reflejaron la tasa de unión de las NP a las células. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

Análisis cuantitativo y de imágenes in vitro de EE. UU.

Imágenes por ultrasonido en solución in vitro

La obtención de imágenes de ultrasonido en solución in vitro de los NP de Her2-GPH se llevó a cabo utilizando la unidad del sistema de ultrasonido Mylab Twice (Esaote SpA, Génova, Italia). Las NP de Her2-GPH se dispersaron en agua DI desgasificada en diferentes concentraciones (0.1, 0.5, 1, 1.5, 2 mg / mL) y se inyectaron en un tubo Eppendorf (2 mL), y luego el tubo se sumergió en un tanque de agua ultrapura. La ecografía se realizó utilizando el transductor LA522 en modo de escala de grises bidimensional (2D) y modo de contraste mejorado bajo los siguientes parámetros:el índice mecánico (MI) =0,01 y el rango de frecuencia fue de 3-9 MHz. Las imágenes se adquirieron de la sección transversal longitudinal del tubo y se registraron para el análisis cuantitativo de la curva de intensidad de tiempo (TIC) utilizando el software QontraXt V3.06.

Diagnóstico por imágenes de células cancerosas de mama en EE. UU.

Las células SKBR3 y las células MDA-MB-231 se cultivaron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10 ⁶ / pozo durante 24 h, y se dividieron en tres grupos, incluido el grupo de control, el grupo no objetivo y el grupo objetivo. Las células del grupo no objetivo y del grupo objetivo se trataron con NP de GPH (100 μg / mL) y NP de Her2-GPH (100 μg / mL) durante 30 min, respectivamente. Posteriormente, las células se lavaron con PBS, se digirieron y se redispersaron en tubos de ensayo con PBS (0,5 ml). Se prepararon geles de agarosa (1%) en placas de vidrio de 20 ml. Para simular el efecto de imágenes de ultrasonido dirigido de NP en la superficie celular, las suspensiones celulares en los seis grupos de tubos de ensayo se extrajeron por separado con jeringas de 1 ml y se inyectaron lentamente en el gel de agar. Las imágenes se realizaron utilizando un transductor SL3116 en modo de escala de grises (ganancia =70%; frecuencia central =22 MHz; MI =0,06). Después de escanear, se dibujó la región de interés (ROI) en cada grupo de imágenes de ultrasonido. El valor de la escala de grises de cada ROI se analizó cuantitativamente utilizando un software de análisis de imágenes (DigSubAna; Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China) para evaluar el efecto de imágenes de ultrasonido dirigido de los NP de Her2-GPH.

Análisis cuantitativo y de resonancia magnética in vitro

T ₂ Medición e imágenes por resonancia magnética de NP de Her2-GPH

La resonancia magnética de las NP de Her2-GPH y las mediciones de la relajación se realizaron utilizando un sistema de 0,5 T (ración NM120-Analyst de Shanghai Niumag Corporation). Los NP de Her2-GPH se suspendieron en agua desionizada a varias concentraciones de Fe (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 mM) y T ₂ Las imágenes de RM ponderadas de las muestras se adquirieron utilizando una secuencia de eco de espín (TR =2000 ms; TE =100 ms; grosor de corte =3 mm; FOV =3 × 3 cm). El tiempo de relajación transversal ( T ₂ ) de protones de agua de la solución acuosa de NPs, y también se midió la relaxividad transversal ( r ₂ ) se determinó mediante el ajuste de la curva de 1 / T ₂ (s ⁻¹ ) versus la concentración de Fe (mM).

Imagen de RM dirigida de células cancerosas de mama

Las agrupaciones y el tratamiento de las células SKBR3 y MDA-MB-231 fueron consistentes con el ensayo de imágenes de EE. UU. Dirigido. Después de la incubación con NP de GPH no dirigidas (100 μg / ml) o NP de Her2-GPH dirigidas (100 μg / ml) durante 30 minutos, las células se lavaron con PBS, se digirieron y se dispersaron en goma xantana (1 mg / ml) . Todas las muestras se escanearon utilizando una secuencia de eco de espín con los mismos parámetros descritos anteriormente. El ROI de cada imagen se definió para el análisis cuantitativo de la intensidad de la señal con el software Image J.

Evaluación PTT dirigida in vitro

Para visualizar el efecto PTT dirigido de los NP de Her2-GPH, se sembraron células SKBR3 en placas de cultivo celular con fondo de vidrio ( Φ =20 mm) con una densidad de 1 × 10 ⁵ células / pocillo durante 24 h, y se dividieron en cinco grupos respectivamente, incluidos los grupos de control DMEM con o sin irradiación con láser, los grupos de materiales dirigidos con o sin irradiación con láser y el material no dirigido con irradiación con láser. Los grupos objetivo se trataron con dispersiones DMEM que contenían NP Her2-GPH (100 μg / ml) durante 30 min y los grupos no objetivo se trataron con NP GPH (100 μg / mL) en las mismas condiciones. Las células en los grupos de irradiación láser se irradiaron con láser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) durante 10 min y se incubó adicionalmente a 37 ° C durante 2 h. Luego, se evaluó la viabilidad celular usando un kit de ensayo de células vivas / muertas (Life Technologies, Grand Island, NY). Finalmente, las imágenes de las células teñidas se adquirieron con un LSCM. Para cuantificar la citotoxicidad fototérmica, las células SKBR3 (1 × 10 ⁴ por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Los agrupamientos fueron consistentes con lo anterior, y la viabilidad celular se probó mediante el ensayo CCK-8. Evaluar más cuantitativamente la citotoxicidad fototérmica de las NP de Her2-GPH bajo diferentes concentraciones e irradiación láser. Las células se incubaron con dispersiones de DMEM que contenían NP de Her2-GPH de diferentes concentraciones (0, 50, 100, 150, 200 μg / mL). Después de lavar con PBS (10 mM, pH 7,0), las células se irradiaron con láser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) durante 10 min y se incubó durante 2 h. Luego, la viabilidad celular también se determinó mediante el ensayo CCK-8. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar ( n =4).

Para simular la expresión heterogénea de Her2 en tejidos tumorales de mama, cocultivamos células SKBR3 y células MDA-MB-231 en diferentes proporciones (0:100%, 25:75%, 50:50%, 75:25%, 100 :0%). Todas las células se trataron con NP de Her2-GPH (200 μg / ml) durante 30 min y se irradiaron con láser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) durante 10 min. Después de una incubación adicional durante 2 h, se analizaron las viabilidades celulares con ensayos CCK-8. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar ( n =4).

Análisis estadístico

Los datos cuantitativos se expresaron como media ± desviación estándar (media ± DE). Las diferencias estadísticas entre varios grupos se determinaron mediante análisis de varianza (ANOVA), y los datos de dos muestras independientes se compararon utilizando la t de Student. prueba. P <0,05 se consideró diferencia estadísticamente significativa. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS v17.0 (IBM, Armonk, NY, EE. UU.).

Resultados y discusiones

Caracterizaciones

Los NP de PFOB / SPIO @ PLGA se fabricaron mediante el proceso de evaporación de disolvente de emulsión de aceite / agua. La imagen SEM (Fig. 2a) reveló que los NP PFOB / SPIOs @ PLGA poseían una morfología esférica uniforme y una superficie lisa. Como se muestra en TEM (Fig. 2b), había una diferencia obvia de densidad electrónica entre el núcleo y el caparazón de las NP de PFOB / SPIO @ PLGA, lo que sugiere la encapsulación de PFOB dentro de las NP. Además, como se muestra en la imagen insertada de mayor aumento, la presencia de SPIO se demostró como puntos grises profundos en la cáscara y la región del núcleo de PFOB líquido de PFOB / SPIO @ PLGA NP. El diámetro medio de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs fue de aproximadamente 248,3 nm con un índice de polidispersidad de 0,037, y el potencial zeta fue de aproximadamente - 14,7 mV según la medición de DLS. Por lo tanto, PFOB / SPIOs @ PLGA NPs podrían absorber fácilmente PAH cargados positivamente para posteriormente unir nanopartículas de Au cargadas negativamente con un tamaño medio de 5-7 nm, que se usaron como semillas para nuclear el crecimiento de nanocapas de oro alrededor de la superficie de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs a través del procedimiento de siembra.

Caracterizaciones de NP de Her2-GPH. un SEM (escala =2 μm) y b Imágenes TEM (escala =200 nm) de PFOB / SPIO en PLGA NP; c SEM (escala =1 μm) y d Imágenes TEM (escala =100 nm) de NP de Her2-GPH; e Las imágenes de mapeo de elementos EDS muestran las distribuciones de los elementos C, O, Fe, F, Br y Au en los NP de Her2-GPH

Las NP de Her2-GPH se prepararon uniendo anticuerpos anti-Her2 a NP de PFOB / SPIO en PLGA en Au a través de SH-PEG-COOH. En este proceso, se utilizó la tecnología clásica de carbodiimida para activar los grupos de ácido carboxílico de PFOB / SPIO PEGilados @ PLGA @ Au NP y promover la unión covalente de los grupos amino a los anticuerpos [31]. Como se ilustra en las imágenes SEM y TEM (Fig.2c, d), las NP de Her2-GPH mantuvieron una morfología esférica bien definida con superficie rugosa, y las NP de Au densas con un diámetro de decenas de nanómetros se pudieron ver claramente en la superficie de la NP, que indicó la fabricación exitosa de las nanocapas de oro. El mapeo de elementos de EDS (Fig. 2e) y los resultados del análisis de elementos (Fig. 3a) de las NP de Her2-GPH revelaron claramente la gran cantidad de elemento Au y la presencia de elementos Fe, F y Br, lo que indica la encapsulación exitosa de SPIO y PFOB y la formación de nanocapas de Au. Además, el contenido de elementos de Au y Fe en las NP de Her2-GPH se evaluó en 67,71 ± 7,34% en peso% y 2,13 ± 0,52% en peso por ICP-AES, respectivamente.

Caracterizaciones de NP de Her2-GPH. un Análisis de elementos EDS de NP de Her2-GPH; b Espectros de absorción UV-Vis de NP de Her2-GPH en diferentes etapas de preparación; c Distribución de tamaño y d Potencial Zeta de los NP de Her2-GPH

Además, también se examinaron los espectros de absorción UV-Vis de las NP de Her2-GPH en diferentes etapas de preparación (Fig. 3b). Las NP de PFOB / SPIO @ PLGA no mostraron un pico de absorción obvio en el rango de 400 a 800 nm, mientras que las NP de Au exhibieron un pico de resonancia de plasma a aproximadamente 520 nm. Tanto las NP PFOB / SPIO @ PLGA @ Au como las NP Her2-GPH exhibieron un pico amplio continuo que variaba de 600 a 900 nm (región NIR) debido a que las semillas de Au adheridas crecieron lo suficiente a través del proceso de siembra para agruparse. Los amplios espectros de absorción en la región NIR aseguraron que las NP Her2-GPH pudieran operar como fotoabsorbentes para la terapia fototérmica NIR. Además, en comparación con las NP de PFOB / SPIO @ PLGA, las NP de Her2-GPH tenían una distribución de tamaño aumentada de 282,3 nm con un índice de polidispersidad de 0,18 (Fig. 3c). Y el potencial zeta era - 31,3 mV (Fig. 3d), lo que implica una buena estabilidad.

Medición del rendimiento fototérmico

El efecto de conversión fototérmica de la solución de NP de Her2-GPH se evaluó bajo la irradiación de láser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ), y la variación de temperatura se controló con una cámara termográfica IR cada 10 s. Después de 10 min de irradiación con láser, el color de la imagen térmica de diferentes concentraciones de solución de NP de Her2-GPH cambió, lo que significa que la temperatura se elevó al aumentar la concentración de NP de Her2-GPH (Fig. 4a). La medición de la temperatura fototérmica fue consistente con los datos de imagen. Se pudo observar que la temperatura de la solución de NP aumentaba al aumentar el tiempo de exposición y la concentración (Fig. 4b). En detalle, el aumento de temperatura de la solución de NP de Her2-GPH fue de 18.5 ° C a la concentración de 0.2 mg / mL, mientras que solo hubo un aumento de 1.2 ° C para el agua DI. Para destruir las células cancerosas, la temperatura tuvo que elevarse al rango de temperatura de hipertermia (40-47 ° C) según estudios previos [32]. Sin embargo, debido a la pérdida térmica in vitro, un aumento de temperatura de aproximadamente 10 ° C no es suficiente para inducir la muerte celular [33]. Los NP de Her2-GPH podrían aumentar la temperatura en aproximadamente 18 ° C a una concentración relativamente baja, dando así el potencial de matar las células cancerosas por hipertermia. Además, para verificar la estabilidad fototérmica de las NP de Her2-GPH, se recogieron los espectros de absorción NIR UV-visible de las muestras antes y después de la irradiación con láser. Y los espectros de absorción prácticamente no cambian antes y después de la exposición al láser (Fig. 4c), lo que garantiza que las NP de Her2-GPH puedan servir como fotoabsorbentes eficaces para el PTT del cáncer.

Efecto fototérmico de las NP de Her2-GPH. un Imágenes térmicas NIR y b variación de temperatura de las NP de Her2-GPH a diferentes concentraciones, después de la irradiación con un láser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ,10 minutos); c Espectros de absorción UV-Vis-NIR antes y después del ensayo de irradiación fototérmica

In Vitro Cytotoxicity Assay

It is well known that biocompatibility of NPs is one of the primary concerns in biomedical applications and should be determined first. Thus, CCK-8 assays were used to evaluate the cytotoxicity of Her2-GPH NPs in breast cancer MDA-MB-231 and SKBR3 cells, as shown in Fig. 5a and b. Compared with controls, the viability of Her2-GPH NPs-treated MDA-MB-231 and SKBR3 cells remained more than 90% at the concentration ranging from 10 to 200 μg/mL for 24 h, indicating the low cytotoxicity and good biocompatibility of the resulted NPs, which could ensure their safety for further cell experiments and clinical studies.

Cell viabilities of a MDA-MB-231 and b SKBR3 cells at different dosages of Her2-GPH NPs (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL) for 12 h and 24 h (data expressed as mean ± SD, n  = 4)

In Vitro Receptor-Specific Targeting Studies

Confocal Laser Scanning Microscopy

Fluorescein isothiocyanate (FITC) is widely used as green fluorescence probes for immune detection and it can easily bind several kinds of monoclonal antibodies. Thus, we choose FITC-labeled anti-Her2 antibody, and the connection of NPs with antibody could be observed more visually by immunofluorescence assay. To verify the binding of anti-her2 antibodies to GPH NPs, GPH NPs and Her2-GPH NPs were placed on dishes (Φ  = 20 mm) for CLSM analysis. As illustrated in Fig. 6, both Her2-GPH NPs and GPH NPs could be clearly observed in bright field. GPH NPs showed no fluorescence signal, while Her2-GPH NPs exhibited bright green fluorescence in the FITC and merged channel, which confirmed the successful conjugation of anti-her2 antibody with GPH NPs.

Confocal microscopic images of Her2-GPH NPs and GPH NPs in bright field, FITC fluorescence and merged channels (scale bar = 5 μm)

We utilized LSCM to confirm the targeting specificity of Her2-GPH NPs in vitro. As can be seen from the Fig. 7, compared with non-targeted group (b), SKBR3 cells incubated with targeted Her2-GPH NPs (a) exhibited bright green fluorescence signals on the surface of cell membranes, indicating the NPs carrying Her2 antibodies could effectively bind to Her2-positive cells [34]. To clearly observe the distributions of Her2-GPH NPs in SKBR3 cells, we provided a bright image (a1), FITC fluorescence image (a2), nuclear image (a3), and an overlay image (a4) of it. Because of the short incubation time of NPs, they were mainly distributed on the surface of cell membranes and aggregated into black spots. In competition study, there were negligible fluorescence signals when SKBR3 cells were pre-treated with excess free anti Her2 antibodies and then incubated with Her2-GPH NPs (Fig. 7c). These results demonstrated that the targeting behavior of Her2-GPH NPs was receptor-mediated and could be blocked by excess free anti-Her2 antibodies [26]. In addition, little fluorescence is detected in MDA-MB-231 cells treated with Her2-GPH NPs under the same conditions (Fig. 7d), which confirmed that Her2-GPH NPs specifically bind to SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors.

Confocal microscopic images and flow cytometry results of SKBR3 cells incubated with targeted Her2-GPH NPs (a /a1 –a4 , e ) and non-targeted GPH NPs (b , f ), free Her2 antibody pre-treated SKBR3 cells incubated with Her2-GPH NPs (c , g ), and MDA-MB-231 cells incubated with Her2-GPH NPs (d , h ). a1 the image of bright field; a2 the image of DAPI channel; a3 the image of FITC channel; and a4 the image of merged channel (scale bar = 10 μm)

Flow Cytometry

The binding rate of Her2-GPH NPs towards cells was further assessed quantitatively via FCM. As clearly illustrated in Fig. 7, the binding rate of targeted NPs to SKBR3 cells (e) was remarkably higher than that of MDA-MB-231 cells (h) (86% ± 3.72% vs 2.31% ± 0.36%, P  < 0.001), indicating the specific targeting capability of Her2-GPH NPs to Her2-positive cells. In addition, Her2-GPH NPs had little targeting binding to SKBR3 cells which were pre-treated with excess free anti-Her2 antibodies (Fig. 7g), and there was significant difference between the targeted inhibition group and targeted group (3.16% ± 0.41% vs 86% ± 3.72%, P  < 0.001). Based on the above, the FCM results provided further strong evidence that Her2-GPH NPs had specific targeting capability of recognizing and combining with SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors and the targeting behavior was receptor-mediated.

In Vitro US Imaging and Quantitative Analysis

In Vitro Solution Ultrasound Imaging

In our study, the US imaging effect of Her2-GPH NPs solution was assessed in vitro under different modes using Mylab Twice Ultrasound System unit. Observed from Fig. 8a, the tubes filled with Her2-GPH NPs solution displayed strong dotted echo in both 2D gray-scale and CEUS modes. By contrast, DI water exhibited as an echo. Furthermore, with the increasing concentration of Her2-GPH NPs, the ultrasound contrast enhancement signal gradually increased. As illustrated in TIC, the mean signal intensity of the Her2-GPH NPs gradually increased as the concentration of NPs increased and it kept correspondence with the CEUS result. The agent at the concentration of 2 mg/mL had significantly stronger contrast enhancement signals than the NPs at 0.1 mg/mL (82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB, P  < 0.01), indicating the stronger backscattering is produced by higher concentration of the NPs. The above indicated that the Her2-GPH NPs possessed satisfactory contrast enhancement effect in vitro and such contrast enhancement was concentration-dependent. In addition, the length of ultrasound imaging time of Her2-GPH NPs at the concentration of 2 mg/mL was also investigated (Fig. 8b). Her2-GPH NPs exhibited exquisite contrast-enhanced signal before 2 min, and the signal intensity gradually decreased with time elapsing. However, there was still obvious enhancement signal within 5 min, which can meet the requirement of clinical contrast-enhanced ultrasonography. Conventional gas-filled microbubbles as UCAs could enhance the backscattering signal of blood by non-linear oscillations under ultrasound but are not suitable for tissue molecular evaluation due to its limitation in intravascular imaging and poor stability [35]. Compared with gas-filled agent, the liquid fluorocarbon-filled PLGA nanocapsules have acoustic stability with prolonged circulation half-time [16]. Besides, our previous research found that Au nanoshells have good reflection properties because of its high atomic number and density [36]. Therefore, we combined the ultrasonic resonance properties of PFOB-filled PLGA nanocapsules with the great echogenicity of Au nanoshells, which prominently enhanced the backscattering signal of Her2-GPH NPs in vitro.

un In vitro two-dimensional (2D) gray-scale ultrasound (US) and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) images and the time-intensity curve (TIC) of Her2-GPH NPs under different concentrations (0, 0.1, 1, 1.5, 2 mg/mL). b In vitro US images of Her2-GPH NPs (2 mg/mL) with time elapsing

Targeted US Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted ultrasound imaging ability of Her2-GPH NPs on breast cancer cells was evaluated in 2D gray-scale mode using Mylab Twice Ultrasound System unit. As shown in Fig. 9a, both the NPs-treated and the control cells displayed uniform, hyperechoic bands in the gel with clear boundaries. It could be clearly observed that the echogenic band of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs was brighter and denser than those of non-targeted and control SKBR3 cells. However, no significant echo signal differences were observed in MDA-MB-231 cells treated with targeted or non-targeted NPs. We further quantified the average gray-scale value of the images based on the defined ROI, and the results were exhibited in Fig. 9b. The gray-scale value of SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs was significantly higher than that of SKBR3 non-targeted and control group (P <0,01). Moreover, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs showed higher gray-scale values compared to MDA-MB-231 cells treated with the same NPs (P <0,05). These results demonstrated that Her2-GPH NPs could specifically bind to Her2-positive SKBR3 cells and had the potential to enhance the ultrasound molecular imaging effect of targeted cells.

un In vitro ultrasound imaging and b gray-scale value analysis of MDA-MB-231 and SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs or non-targeted GPH NPs. MDA-MB-231 and SKBR3 cells served as controls (data expressed as mean ± SD, *P <0.05, ** P  < 0.01, n =3)

In Vitro MR Imaging and Quantitative Analysis

T ₂ Measurement and MR Imaging of Her2-GPH NPs

SPIOs have been intensively investigated in T ₂ -weighted MR imaging due to their capability to shorten transverse relaxation times of the surrounding water protons, which results in the decrease in the MR signal intensity and enables to provide negative contrast enhancement of the target lesion [37, 38]. La T ₂ contrast imaging capabilities of Her2-GPH NPs with various Fe concentrations were evaluated at a 0.5 T magnetic field. Figure 10 a displayed the transverse relaxation rates (1/T ₂ ) of water protons as a function of the iron concentration in Her2-GPH NPs aqueous solution. And the relaxivity (r ₂ ) was calculated based on the slope to be 441.47 mM ⁻¹ s ⁻¹ , which is more than 2 times as high as commercial SPIO-based MR imaging contrast agent Feridex (152 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) under the same magnetic field strength [39]. The higher T ₂ relaxivity may be due to the fact that the aggregation of SPIOs inside the polymeric matrix results in a relatively enlarge in the size of the magnetic NPs and enhances the magnetic interactions [37, 40]. In addition, the signal intensity of T ₂ -weighted MR imaging gradually decreased along with the increase of the iron concentration (Fig. 10b), which further confirmed Her2-GPH NPs had the capability for T ₂ -weighted MR contrast imaging.

In vitro MR imaging. un The transverse relaxation rates (1/T ₂ ) of Her2-GPH NPs aqueous solution as a function of the iron concentration in a 0.5 T magnetic field. b T ₂ -weighted MR images of Her2-GPH NPs with different iron concentrations acquired using spin-echo sequence. c T ₂ -weighted MR images and d signal intensity of Her2-GPH NPs (100 μg/mL) and GPH NPs (100 μg/mL) incubated with MDA-MB-231 and SKBR3 cells. MDA-MB-231 and SKBR3 cells served as controls (data expressed as mean ± SD, *P <0.05, ** P <0.01, *** P  < 0.001, n =3)

Targeted MR Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted MR imaging effect of Her2-GPH NPs on SKBR3 and MDA-MB-231 cells was confirmed by in vitro T ₂ -weighted MR imaging. As shown in Fig. 10 c and d, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs exhibited noticeable negative contrast enhancement, and the signal intensity decreased by 48% compared to the control cells (P  < 0.001). However, the MR signal intensity of non-targeted GPH NPs-treated SKBR3 cells showed little reduction. In addition, the signal intensity of MDA-MB-231 cells labeled with Her2-GPH NPs or GPH NPs did not change significantly compared with the control group (P  > 0.05). Furthermore, Her2-GPH NPs-treated SKBR3 cells showed a higher degree of signal intensity reduction than that of MDA-MB-231 cells (P  < 0.001), which could be used to distinguish the two cells from each other. The above results together indicated that Her2-GPH NPs could enhance T ₂ -weighted MR imaging through receptor-mediated cell-specific uptake [41].

In Vitro Targeted PTT Evaluation

Initially, calcein-AM/propidium iodide (PI) staining was used to visually evaluate targeted photothermal cytotoxicity in vitro. Calcein AM, a non-fluorescent live cell stain, can permeate the cell membrane and hydrolyze to produce a green fluorescent calcein dye in live cells. Propidium iodide (PI) is a dead cell stain, which binds to the DNA of dead cells to generate red fluorescence [33]. As shown in Fig. 11a, there were no obvious dead cells when NIR laser irradiation or the Her2-GPH NPs was used separately, indicating that neither laser irradiation nor the NPs itself was cytotoxic. Likewise, cells treated with non-targeted GPH NPs in combination with NIR laser showed little cell death. On the contrary, a large number of dead cells could be observed when Her2-GPH NPs were treated in the presence of laser irradiation, which suggested that the agent could induce hyperthermic cell death by targeting photothermal effect. The cell viabilities were further quantitatively evaluated by CCK-8 assay. As illustrated in Fig. 11b, SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs and laser irradiation exhibited a (62 ± 4.56%) decrease in cell viability compared with the control group (P  < 0.001). Furthermore, under the laser irradiation for 10 min, the cell viability of targeted Her2-GPH NPs group was significantly lower than that of the non-targeted group (38 ± 4.56% vs 87.6 ± 4.06%, P <0.05).

In vitro targeted photothermal assay. un Confocal microscopic images of calcein-AM/PI-stained SKBR3 cells in in different treatments groups (Her2-GPH NPs group, laser group, GPH NPs + laser group, Her2-GPH NPs + laser group) (scale bar = 100 μm). SKBR3 cells served as control. b Relative cell viabilities of SKBR3 cells in the five groups after treatment as shown in Fig. 11 a (data expressed as mean ± SD, *P  < 0.05, ***P  < 0.001, n = 4); c cell viabilities of SKBR3 cells incubated with Her2-GPH NPs at different concentrations (0, 50, 100, 150, 200 μg/mL) with or without NIR laser irradiation (808 nm, 1 W/cm ² , 10 min) (data expressed as mean ± SD, *P  < 0.05, ***P  < 0.001, n  = 4)

In addition, we used the CCK-8 assay to further quantitatively assess the photothermal cytotoxicity of Her2-GPH NPs at various concentrations. As shown in Fig. 11c, the viabilities of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs without NIR laser irradiation remained more than 90%, whereas the viabilities of laser irradiated cells decreased significantly with increasing concentrations of Her2-GPH NPs. Only less than 20% of laser-irradiated cells remained viable at the concentration of 200 μg/mL compared with the non-laser-irradiated cells at the same concentration (P  < 0.001). These results further confirmed that relatively low concentrations of Her2-GPH NPs were sufficient to provide enough temperature increase to kill SKBR3 cells.

Furthermore, we co-cultured SKBR3 and MDA-MB-231 cells in different proportions to simulate the heterogeneous expression of Her2 in breast tumor tissues. Results showed that the total cell viabilities after photothermal induction of Her2-GPH NPs decreased with the increasing proportions of SKBR3 cells, and the total cell viability of the other proportion group was significantly higher than that of the 100% SKBR3 cells group (P  < 0.05) (Additional file 1:Figure S1). Besides, in the presence of Her2-GPH NPs for 30 min, the total cell viabilities after induction with NIR laser was significantly lower than that of the non-laser irradiation cells (P  < 0.05), except for the 100% MDA-MB-231 cells group. Taken together, Her2-GPH NPs could specifically bind to SKBR3 cells and had great potential to induce cancer cells to death by photothermal effect. The possible mechanism of photothermal hyperthermia for SKBR3 cells should be mainly attributed to the exposure of the cancer cells to higher temperatures, which inhibited normal cellular growth and proliferation by denaturing intracellular proteins [42].

Conclusions

Her2-GPH NPs, a Her2 functionalized theranostic agent that integrated dual-modal US/MR imaging and targeted PTT has been successfully designed, fabricated and investigated in vitro. By conjugation with anti-Her2 antibodies, the agent could recognize or bind to breast cancer SKBR3 cells overexpressing Her2 with high specificity and sensitivity. In addition, through the co-loading of PFOB and SPIOs, and the construction of Au-nanoshelled PLGA “shell-core structure”, the resulting Her2-GPH NPs provide excellent contrast enhancement in vitro US and T ₂ -weighted MR imaging. Furthermore, the formation of Au nanoshells enables the agent to be served as efficient photoabsorber for targeted NIR PTT in breast cancer cells. Our results provide a preliminary exploratory study for the integration of collaborative diagnosis and adjuvant therapy of breast cancer, and further studies in vivo are still needed.

Disponibilidad de datos y materiales

The datasets generated and analyzed during the current study are included in this article.

Abreviaturas

Au NPs:

Nanopartículas de oro

CCK-8:

Cell-counting kit-8

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DI:

Desionizado

DLS:

Dynamic laser scattering

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EDC:

Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

EDS:

Espectroscopía de rayos X de energía dispersiva

FCM:

Citometría de flujo

FDA:

Food and Drug Administration

FE-SEM:

Microscopía electrónica de barrido por emisión de campo

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

GPH NPs:

Gold-nanoshelled magnetic hybrid nanoparticles

Her2:

Human epidermal growth factor receptor 2

HR-TEM (TEM):

Microscopio electrónico de transmisión de alta resolución

HUVEC cells:

Human umbilical vein endothelial cells

ICP-AES:

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

LSCM:

Laser scanning confocal microscopy

MRI:

Magnetic resonance imaging

NIR:

Infrarrojo cercano

PAH:

Polyallylamine hydrochloride

PFOB:

Perfluorooctyl bromide

PLGA:

Poly lactic-co-glycolic acid

PTT:

Photothermal therapy

PVA:

Alcohol polivinílico

SPIOs:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

TIC:

Time-intensity curve

UCA:

Ultrasound contrast agent

US:

Ultrasound imaging

Nanohélice de doble puerta como una nueva superrejilla binaria ajustable Comportamiento de adsorción de la molécula de gas CH4 en la monocapa MoX2 (S, Se, Te):el estudio DFT