Síntesis de nanopuntos de carbono amarillo fluorescente por Microplasma para la obtención de imágenes y la inactivación fotocatalítica de células cancerosas

Resultados y discusión

Caracterización de CQD

Los CQD emisores de amarillo de este estudio se preparan de manera sencilla y respetuosa con el medio ambiente mediante un método de microplasma utilizando o -fenilendiamina como precursor de carbono. Aunque se ha informado que el método de procesamiento de microplasmas se utiliza para la síntesis de nanopuntos de carbono, existen raras investigaciones relativas. La Figura 1A muestra imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM) de las partículas CQD. Las partículas producidas por el microplasma eran de forma cíclica u ovalada con un diámetro medio de 3,2 nm. Como se muestra en la imagen de alta resolución de la Fig. 1A (recuadro), la distancia de la red en los CQD es de 0,21 nm, que pertenece al plano (1,1,0) del grafito. El espectro Raman muestra que el modo D, denominado modo inducido por desorden, se encuentra alrededor de 1342 cm ⁻¹ y el modo G se centra alrededor de 1507 cm ⁻¹ , respectivamente, debido al resultado de sp ³ y sp ² -hibridación de carbono (Fig. 1E). Se sabe que la intensidad del modo D en comparación con el modo G depende del tamaño de los microcristales de grafito en la muestra. El mayor desorden de la muestra conduce a una mayor relación de intensidad de ID / IG y al microcristal de grafito más pequeño. Además, el modo D y G de los polvos CQD también se pueden ver como pequeñas escamas de grafito con una relación de intensidad relativamente alta de ID / IG (0,77).

Caracterizaciones de CQD. A Imágenes TEM de CQD (recuadro, imágenes TEM de alta resolución); B Distribuciones de tamaño de CQD; C Espectros de absorción UV-vis de los CQD; D El espectro FL de los CQD con longitudes de onda de excitación de 400 a 500 nm en incrementos de 20 nm; E , F Espectro Raman de CQD y espectro FTIR de CQD

FTIR y XPS son herramientas poderosas para caracterizar la composición química y la estructura de materiales a base de carbono. Los datos de FTIR para CQD se registraron en el rango de 400 a 4000 cm ⁻¹ , como se muestra en la Fig. 1F. El espectro FTIR reveló que los CQD contienen principalmente amina (3052 y 3324 cm ⁻¹ ), OH (3200 cm ⁻¹ ), C =O (1595 cm ⁻¹ ), C – N / C – O (1200 cm ⁻¹ ), C =C (1500 cm ⁻¹ ) y CH (748 cm ⁻¹ ) grupos funcionales o enlaces químicos [26, 27]. Los componentes de la superficie de los CQD, según lo determinado por XPS, fueron consistentes con los resultados de FTIR. El espectro completo presentado en la Fig. 2A mostró tres picos típicos:C 1 s (285 eV), N 1 s (400 eV) y O 1 s (531 eV).

Espectros XPS de CQD. A Espectros XPS a gran escala de los CQD; B Alta resolución de C 1 s espectro; C alta resolución de N 1 s espectro; D Alta resolución de O 1 s espectro

Como se muestra en la Fig. 2B – D, un C 1 s El análisis reveló la presencia de sp ² / sp ³ carbonos (C – C / C =C, 284,8 eV), carbonos nitrosos (C – O / C – N, 285,9 eV) y carbonilos (C =O, 287,7 eV). Los N 1 s La banda se deconvolucionó en tres picos a 399,3, 400,3 y 401,7 eV, que corresponden a N pirrólico, N grafítico y N amino, respectivamente. Los O 1 s banda contenía picos a 531,6 y 533,1 eV para C – O y C =O, respectivamente [28, 29]. Es importante destacar que la existencia de estos grupos funcionales anteriores dotó a las CQD de una solubilidad favorable. Además, se investigaron las propiedades ópticas de los CQD mediante espectroscopia de fluorescencia y absorción de UV-Vis. Los espectros de emisión de fluorescencia de CQD se muestran en la Fig. 1C. Los CQD preparados exhiben un comportamiento de emisión de fluorescencia dependiente de la excitación. Cuando se excitó a longitudes de onda de 400 a 500 nm, el pico máximo de emisión de fluorescencia se desplazó al rojo de 473 a 519 nm y la intensidad de la fluorescencia disminuyó drásticamente [30]. Como se muestra en la Fig. 1D, los espectros UV-vis de CQD presentaron un fuerte pico de absorción en el rango de longitud de onda de 400 a 490 nm. Los CQD exhibieron dos picos de absorción característicos a 280 y 420 nm, que se referían a transiciones π – π * (C aromático =C) y n – π * (carboxilo y / o C – N), respectivamente [31, 32]. Por lo tanto, estas propiedades ópticas de los CQD proporcionaron viabilidad para la obtención de imágenes biológicas y la inactivación fotodinámica simultáneas.

Bioimagen y citotoxicidad de CQD

Para evaluar la capacidad de los CQD para la obtención de imágenes biológicas y el etiquetado celular, se investigaron las imágenes celulares in vitro utilizando CQD en células HeLa mediante un microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Las células Hela se incubaron con 200 μg mL ⁻¹ CQD durante 6 hy luego se preparó para la detección de CLSM. Como resultado, las células HeLa mostraron una fluorescencia de color amarillo brillante distribuida uniformemente por toda la célula (Fig. 3A). Más importante aún, debe tenerse en cuenta que la concentración baja de CQD de 200 μg mL ⁻¹ fue suficiente para marcar las células Hela con fluorescencia amarilla, lo que especificó aún más la posibilidad de CQD en las imágenes de células. Como se ha informado, las nanopartículas de carbono siempre exhibieron una fuerte emisión solo en la región de la luz azul, mientras que las emisiones de longitud de onda larga fueron generalmente débiles. Bajo la excitación ultravioleta, los tejidos biológicos mostraban con frecuencia autofluorescencia azul y eran vulnerables a recibir fotodaño, lo que dificulta seriamente las aplicaciones de análisis de imágenes biológicas de nanopartículas de carbono con emisiones de longitud de onda corta [33]. Por tanto, el desarrollo de nanopartículas de carbono con emisiones de longitud de onda larga fue motivo de gran preocupación. En el presente estudio, las CQD preparadas mostraron fluorescencia de color amarillo brillante bajo la excitación de una luz de 400 a 450 nm. Por tanto, la fluorescencia amarilla excitada podría permitir que las CQD se utilicen para la detección de tumores profundamente arraigados. Sin embargo, todavía queda un largo camino por recorrer antes de las aplicaciones prácticas en las imágenes de cáncer en humanos.

Aplicación de CQD. A Imágenes CLSM de células HeLa marcadas con CQD; B Prueba de citotoxicidad in vitro de CQD; C Viabilidad relativa de las células HeLa incubadas con solución de control o CQD (200 μg mL ⁻¹ ) y expuesto a luz azul (460 nm, 30 mW cm ⁻² ) durante 5 min, 10 min y 15 min; D El IC50 de los CQD excitados en las células Hela después de la exposición a la luz azul durante 10 y 15 minutos (* P <0.05)

Además de la característica de luminiscencia, siempre se requieren una alta biocompatibilidad y una baja toxicidad si se pretende que los CQD se desarrollen como un posible reactivo de bioetiquetado. Para aplicaciones biomédicas, los materiales deben ser altamente biocompatibles en las dosis recomendadas. Para examinar la citotoxicidad, las células HeLa se trataron con CQD en concentraciones finales que iban de 0 a 400 μg mL ⁻¹ durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 3B, más del 95% de las células sobrevivieron según lo determinado por los ensayos de MTT (bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2-il) -2,5-difeniltetrazolio), que revelaron que las CQD eran prácticamente no- tóxico.

Estos datos sugieren que las CQD recién generadas con fluorescencia amarilla excitada tienen baja citotoxicidad y alta biocompatibilidad, lo que facilita su prometedora perspectiva de obtención de imágenes biológicas.

Eficacia de la terapia fotodinámica

Inactivación de células cancerosas

Como se muestra en la Fig. 3C, la viabilidad no difirió entre las células HeLa tratadas con CQD o con luz azul sola. El tratamiento simultáneo con CQD y luz azul redujo notablemente la viabilidad celular de las células Hela, dependiendo de la duración de la fotoexposición. Después de la irradiación a 460 nm durante 15 min, los CQD mostraron una notable actividad antitumoral; la viabilidad de las células HeLa disminuyó en aproximadamente un 40% a una concentración de 200 μg mL ⁻¹ . Para detectar aún más los efectos de las CQD excitadas, se implementaron ensayos de MTT para evaluar la concentración inhibidora media máxima (IC50) de las CQD excitadas a las células Hela. Como resultado, la CI50 de las CQD después de excitarse en células Hela fue de aproximadamente 427,5 μg mL ⁻¹ (IC del 95%:366,7–498,7 μg mL ⁻¹ ) después de una irradiación de 10 min y fue de aproximadamente 255,1 μg mL ⁻¹ (IC del 95% 220,9–249,8 μg mL ⁻¹ ) después de la exposición a la luz azul durante 15 minutos.

Estos resultados indicaron que las CQD excitadas podrían matar eficazmente las células tumorales como algunos fármacos anticancerosos clínicos, como Photofrin [34], lo que provocó el valor prometedor de las CQD en la terapia antitumoral guiada por imágenes.

Generación ROS de CQD

Durante la TFD, las células cancerosas pueden ser destruidas por ROS citotóxicos generados por el fotosensibilizador endocitosado en condiciones de irradiación adecuadas [35, 36]. Las ROS pueden inactivar las células diana por apoptosis o necrosis con pocos efectos secundarios a través de la TFD en varias enfermedades [37,38,39,40]. La inspección de la Fig. 4A mostró que el reactivo ROS emite fluorescencia roja, lo que indica la generación de ROS. Además, la señal roja de ROS se superpuso bien con la fluorescencia de CQD, lo que significa que la generación de ROS estuvo estrechamente asociada con la captación de CQD por las células tumorales. Como se muestra en la Fig. 4B, en comparación con el control y sin grupos de irradiación con láser, los grupos experimentales bajo irradiación con láser de 460 nm durante 15 min mostraron una generación de ROS obvia. Nuestros resultados indicaron que los CQD podrían promover significativamente la producción de ROS intracelulares bajo la irradiación de láser de 460 nm y tenían un gran potencial para su aplicación en TFD. En principio, los CQD se pueden excitar desde el estado fundamental (S0 en la Fig. 4C) a un estado excitado (Sn en la Fig. 4C), y la eficiencia de este proceso está determinada por la intensidad de la fuente de luz y el coeficiente de extinción. . Después de la relajación mediada por disolvente, los CQD permanecen en el nivel de vibración más bajo del primer estado excitado de singlete. Debido a la relajación vibratoria rápida que sigue a la excitación, la energía del fotón emitida desde el primer estado excitado singlete (S1 en la Fig. 4C) es menor que la energía del fotón de excitación, lo que da como resultado un aumento de la longitud de onda. Las imágenes de fluorescencia utilizan la transición de CQD de S0 a Sn a S1 [41]. Las CQD fueron ingeridas por células tumorales HeLa y emitieron fluorescencia cuando se iluminaron con una fuente de longitud de onda adecuada, lo que permitió marcar las células. S1 puede volver al estado S0 por fluorescencia o por cruce entre sistemas a un estado excitado triplete no fluorescente (T1 en la Fig. 4C) [7, 42]. El grupo fluorescente de T1 es especialmente activo en las reacciones de transferencia de electrones, generando radicales libres superóxido y, posteriormente, dando como resultado la degradación del grupo fluorescente. La energía de T1 transferida al oxígeno molecular produciría un agente oxidante de oxígeno singlete excitado que es más fuerte que el oxígeno molecular en estado fundamental. Los radicales superóxido y el oxígeno singlete, así como otros ROS, incluidos OH y H ₂ O ₂ , reaccionan con moléculas biológicas cercanas para ejercer fototoxicidad, lo que lleva a la muerte celular. Después de que las células HeLa absorbieron los CQD, la iluminación dio como resultado la transferencia del estado singlete al estado triplete a través del intersistema, y ​​el proceso de transferencia de energía produjo ROS y finalmente condujo a la muerte celular. Bajo la fuente de longitud de onda adecuada, los CQD se someten a dos tipos de transferencia de energía. Se emitió fluorescencia para marcar las células tumorales HeLa y las células HeLa fueron destruidas por ROS. Nuestros datos experimentales revelaron la buena biocompatibilidad de los CQD recién producidos en la oscuridad y la eficacia de eliminación de tumores en condiciones de luz. Por lo tanto, los CQD podrían usarse como fotosensibilizadores para células y tejidos tumorales.

Generación de ROS intracelulares. A Imágenes de fluorescencia de HeLa, (a) Imagen de transmisión de campo brillante, (b) Imagen de fluorescencia de CQD recolectada en el rango de 400–450 nm, (c) Imagen de fluorescencia del reactivo de detección de ROS capturada en el rango de 510–530 nm, y (d ) la imagen fusionada; B La producción de ROS intracelulares para diversas concentraciones de CQD con o sin irradiación durante 15 min; C un diagrama de nivel de energía simplificado muestra las posibles vías de transferencia de energía de fluorescencia y muerte celular. (S0, estado fundamental de la molécula de fluoróforo; S1, primer estado excitado singlete; Sn ( n > 1); T1, primer estado excitado de triplete; Ex, excitación por absorción de fotones; FL, fluorescencia)

Además, todavía es un problema sin resolver cómo los CQD pueden atacar el tumor con precisión y matar las células tumorales de manera más efectiva. La abundancia existente de grupos hidrófilos funcionales superficiales (carboxilo, carbonilo, epoxi, hidroxilo, hidroxilo, etc.) permite que los puntos de carbono se conjuguen con un anticuerpo específico que podría apuntar con precisión a los tumores, y esto requiere que el tumor tenga biomarcadores específicos. Al mismo tiempo, los puntos de carbono también podrían servir como una herramienta para la administración de fármacos y genes debido a su alta relación de superficie a volumen [43]. Teniendo en cuenta la excelente biocompatibilidad, el tamaño pequeño para la internalización por las células tumorales, la riqueza en restos funcionales de la superficie y los potenciales de bioimagen, se cree que los puntos de carbono (incluidos los CQD) se convierten en candidatos teranósticos prometedores para la terapia tumoral. Sin embargo, todavía existen desafíos y muchos problemas sin resolver para las aplicaciones de puntos de carbono en nanomedicina y bioimagen. Se deben realizar más esfuerzos para promover la traducción de la nanomedicina relacionada con el punto de carbono del laboratorio a la cabecera en el futuro.

Conclusiones

En resumen, sintetizamos CQD fotoluminiscentes usando o -fenilendiamina por el método del plasma. Emocionados por un láser azul, los CQD con un diámetro de aproximadamente 3,2 nm emitían fluorescencia amarilla. Los resultados de Raman, UV-vis, FTIR y XPS mostraron que había más átomos de carbono involucrados en sp ² hibridación, formando un nuevo grupo orgánico. Las CQD sintetizadas por el método del plasma demostraron ser una sonda eficaz en experimentos de imágenes de células, y la fluorescencia amarilla emitida por las CQD puede marcar claramente las células HeLa. Además, los CQD sintetizados mostraron una solubilidad favorable, no tóxicos y una alta biocompatibilidad, lo que podría acelerar su capacidad de obtención de imágenes biológicas. Además, las CQD excitadas podrían matar de manera efectiva las células Hela mediante la generación de ROS, que claramente exhibieron una citotoxicidad fotodinámica satisfactoria de las CQD in vitro y respaldaron sus aplicaciones en la TFD.

Métodos experimentales

Síntesis de puntos cuánticos de carbono

El sistema de procesamiento de microplasmas se resume en el archivo adicional 1:Figura S1. Se conectó un tubo de acero inoxidable hueco con un diámetro interior de 180 μm a una fuente de alimentación de corriente continua de alto voltaje (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) y se mantuvo a 2 mm por encima de la superficie del solución. Se conectó un electrodo de Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) al cátodo de la fuente de alimentación y se sumergió en la solución. Luego, 400 mg de o -fenilendiamina (Shanghai, China) se disolvió en 40 ml de agua desionizada y 20 ml de o Se añadió una solución de fenilendiamina a una placa de Petri y se agitó usando un agitador magnético. Durante el tratamiento con microplasmas, el gas argón (Ar) fluyó a través de la tubería a un caudal de 60 sccm y la corriente CC se mantuvo en 17 mA. Después de 10 min de tratamiento con plasma, el producto de color negro pardusco se dializó utilizando una membrana de diálisis (corte de peso molecular, 500 Da) frente a 2 L de agua desionizada durante 12 hy posteriormente se filtró a través de una membrana de ultrafiltración de 0,22 μm. Finalmente, se obtuvieron CQD puros mediante liofilización.

Caracterización de la estructura, composición y propiedades ópticas de los CQD

El tamaño y la morfología de los CQD se caracterizaron mediante TEM utilizando un sistema JEM-2100F (JEOL, Tokio, Japón). La espectroscopía de fluorescencia se realizó usando un espectrómetro de luminiscencia Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, EE. UU.). Los espectros de absorción UV / Vis se midieron utilizando el espectrofotómetro Varian Cary 50 UV-VIS (Palo Alto, CA, EE. UU.). Los espectros FTIR se obtuvieron usando un espectroscopio Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), Y la espectroscopia Raman se realizó usando el espectrómetro 800 UV micro-Raman (Invia-reflex, Reino Unido). Los experimentos de XPS se realizaron utilizando un sistema Axis Ultra DLD (Shimadzu / Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japón).

Ensayo de citotoxicidad y cultivo celular

Se cultivaron células HeLa (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) En medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% a 37 ° C en un 5% de CO ₂ humidificado atmósfera. Para los estudios de citotoxicidad de las CQD, se contaron las células y se sembraron en placas de 96 pocillos que contenían 200 μL de medio completo a una densidad de 6000 células por pocillo. Después de 24 h de cultivo, las células se incubaron con CQD a concentraciones de 0, 25, 50, 100, 200 y 400 μg mL ⁻¹ durante otras 24 h, y luego, se detectaron las viabilidades celulares usando ensayos MTT para evaluar la citotoxicidad de las CQD. Brevemente, estas soluciones se reemplazaron con 100 μL de solución de prueba de MTT (0,5 mg mL ⁻¹ ) y se incubó durante 4 h en una incubadora en la oscuridad. Se eliminó el sobrenadante y los cristales se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Finalmente, se midió la absorbancia de cada pocillo a 490 nm. La densidad óptica se relacionó con la viabilidad celular asumiendo una viabilidad del 100% para la muestra de control sin CQD.

El ensayo MTT también se usó para evaluar la CI50 de CQD excitadas en células Hela. Brevemente, las células Hela en placa de 96 pocillos se incubaron con CQD a concentraciones de 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 y 6400 μg mL ^-1 durante 24 h en la incubadora, se trató con luz a 460 nm durante 10 min o 15 min por separado, y luego se cultivó durante otras 24 h. La viabilidad celular de cada pocillo se detectó mediante el ensayo MTT y los datos se utilizaron para la evaluación de IC50.

Imágenes de células

Células a una concentración de 2 × 10 ⁴ mL ⁻¹ se sembraron en una placa confocal (diámetro =15 mm), se cultivaron durante 24 h y se lavaron con PBS dos veces para asegurar que no hubiera células muertas. Una solución de CQD (200 μg mL ⁻¹ ; pH 7) y las células se incubaron durante 6 h. Las células se lavaron posteriormente con PBS tres veces para eliminar las CQD no unidas y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Luego, las muestras se observaron usando un CLSM (LSM510, Zeiss, Alemania) con excitación en longitudes de onda que van desde 400 a 450 nm.

Terapia fotodinámica y medición de ROS

Para investigar los efectos antitumorales, las células HeLa se incubaron con 200 μg mL ⁻¹ CQD durante 24 ha 37 ° C en la oscuridad y tratadas con luz a 460 nm (30 mW cm ⁻² ) durante 5, 10 y 15 min. Después de 24 h de incubación, se realizó un ensayo de MTT estándar para determinar la viabilidad celular relativa. La generación intracelular de ROS se detectó químicamente mediante el método espectrofotométrico con el kit Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit (sigma, EE. UU.). Las células se cultivaron en una placa confocal (diámetro =15 mm) durante la noche para la unión celular. Luego, las células se incubaron con 200 μg mL ⁻¹ CQD durante 4 h. Posteriormente, se agregaron 100 μL / pocillo de Master Reaction Mix. Después de la incubación durante 1 h, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min y se observaron imágenes de fluorescencia de las células mediante CLSM. En cuanto a la detección de la producción de ROS, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos con 200 μL de medio de cultivo. Después de 24 h de incubación, el medio se reemplazó con 100 μL de solución de CQD a concentraciones de 0, 100, 200 μg mL ⁻¹ , y las células se incubaron durante otras 4 h. Posteriormente, las muestras se lavaron tres veces con PBS, se irradiaron durante 15 min o no y se incubaron con 100 μL / pocillo Master Reaction Mix durante 1 h. Finalmente, la intensidad de la fluorescencia se detectó mediante un lector de fluorescencia (excitación de 520 nm, emisión de 605 nm).

Análisis estadísticos

Los experimentos involucrados en este estudio se repitieron tres veces y los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS19.0. Las diferencias entre los dos grupos se compararon utilizando Mann-Whitney U prueba. La CI50 de los CQD excitados en células Hela se evaluó usando regresión no lineal. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos y materiales del estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Abreviaturas

PDT:

Terapia fotodinámica

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

CQD:

Puntos cuánticos de carbono

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

CLSM:

Microscopio de barrido láser confocal

DMEM:

Águila mediana modificada de Dulbecco

MTT:

Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2-il) -2,5-difeniltetrazolio

DMSO:

Dimetilsulfóxido

IC50:

Concentración inhibitoria media máxima

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