Síntesis microplasma ecológica de puntos cuánticos de carbono con emisión amarilla para imagen de células cancerígenas e inactivación fotocatalítica

Resumen

En los últimos años, las nanopartículas multifuncionales con funciones diagnósticas y terapéuticas combinadas muestran un gran potencial en nanomedicina. En este estudio, informamos la síntesis ecológica de nano-puntos de carbono fluorescentes, como puntos cuánticos de carbono (CQDs), mediante microplasma utilizando o-fenilendiamina. Los CQDs producidos exhibieron picos de absorción amplios entre 380–500 nm y emitieron fluorescencia amarilla brillante con un pico a 550 nm. Los CQDs fueron rápidamente internalizados por células cancerígenas HeLa. Cuando se excitaron bajo luz azul, generaron eficientemente una señal de fluorescencia amarilla intensa y especies reactivas de oxígeno (ROS), permitiendo la imagen fluorescente simultánea de células cancerígenas y la inactivación fotodinámica, con una disminución del 40 % en la viabilidad celular relativa. Además, alrededor del 98 % de las células permanecieron viables tras la incubación con 400 μg mL⁻¹ de CQDs en la oscuridad, lo que revela su excelente biocompatibilidad. Por tanto, los CQDs recién preparados se demuestran como materiales potencialmente eficaces y seguros para bioimagen in vivo y terapia contra el cáncer guiada por imagen.

Introducción

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo [1]. Las nanopartículas multifuncionales con capacidades diagnósticas y terapéuticas tienen aplicaciones prometedoras en nanomedicina. La terapia guiada por imagen simultánea es un concepto novedoso en el tratamiento del cáncer y muestra un gran potencial para optimizar la eficiencia terapéutica. Puede proporcionar información útil sobre el tamaño y la localización de los tumores, la ventana temporal óptima para la fototerapia y la eficacia terapéutica [2,3,4]. La terapia fotodinámica (PDT) se ha utilizado para tratar muchos tipos de cáncer y otras enfermedades debido a su selectividad espacio-temporal y naturaleza no invasiva [5, 6]. Los fotosensibilizadores ideales generalmente poseen las siguientes características: (1) generación altamente eficiente de especies reactivas de oxígeno (ROS), (2) buena biocompatibilidad y (3) solubilidad en agua [7]. Sin embargo, las aplicaciones actuales de la PDT se ven limitadas por la pobre solubilidad en agua, inestabilidad y longitudes de onda de excitación subóptimas de los fotosensibilizadores. Por tanto, se necesitan sustitutos de fotosensibilizadores con buena solubilidad en agua y biocompatibilidad, generados mediante métodos ecológicos y de bajo costo.

Los puntos cuánticos de carbono (CQDs) han recibido una enorme atención debido a sus propiedades beneficiosas únicas, como síntesis simple y ecológica, baja toxicidad, notable biocompatibilidad, excelente solubilidad en agua y estabilidad lumínica [8]. Los CQDs tienen usos potenciales en imagen celular, biosensores, administración dirigida de fármacos y otras aplicaciones biomédicas [9,10,11,12,13]. Existen dos enfoques principales para la síntesis de puntos de carbono: métodos bottom-up y top-down. Los métodos top-down incluyen oxidación electroquímica, ablación láser, oxidación química y síntesis ultrasónica. Los métodos bottom-up consisten en tratamiento hidrotérmico, síntesis por microondas y descomposición térmica [14,15,16,17]. Sin embargo, las altas temperaturas, presiones y ácidos fuertes requeridos siempre conducen a un consumo sustancial de energía, procesos complicados y daño ambiental inevitable. Por ello, surgen nuevos métodos de síntesis ecológicos. Como se ha reportado, los CQDs pueden producirse en solo unos minutos mediante un método microplasma-líquido sin condiciones de alta temperatura, gran aporte energético ni procedimientos laboriosos [18,19,20]. Los microplasmas proporcionan un entorno fisicoquímico único tanto para estudios fundamentales como para aplicaciones que involucran materiales avanzados. Los entornos químicos y electrónicos proporcionados por los microplasmas son altamente no equilibrados y pueden almacenar energía. En este entorno, se pueden producir grandes cantidades de electrones, iones, radicales libres y otras sustancias activas excitadas-ionizadas [21, 22]. Aunque la o-fenilendiamina es una materia prima para la síntesis de nano-puntos de carbono, no se ha utilizado en la síntesis por microplasma [23,24,25].

En este estudio, se utilizó o-fenilendiamina como materia prima para sintetizar CQDs mediante tratamiento con microplasma. Los CQDs generados por este método fueron uniformes en tamaño (alrededor de 3,2 nm de diámetro) y exhibieron un pico de emisión alrededor de 550 nm. Demostramos que los CQDs recién sintetizados podían producir una gran cantidad de ROS bajo condiciones de luz. In vitro, los CQDs fueron absorbidos por células tumorales HeLa y emitieron luz amarilla bajo excitación de longitud de onda azul a 420–500 nm con baja toxicidad. También observamos la inactivación de células tumorales HeLa bajo irradiación a 460 nm. Estos resultados sugieren que los CQDs recién preparados podrían ser materiales prometedores para bioimagen in vivo, terapia contra el cáncer guiada por imagen o dirigida.

Resultados y Discusión

Caracterización de los CQDs

Los CQDs emisores de amarillo en este estudio se preparan de manera sencilla y ecológica mediante un método de microplasma utilizando o-fenilendiamina como precursor de carbono. Aunque el método de procesamiento por microplasma se ha reportado para la síntesis de nano-puntos de carbono, existen pocas investigaciones al respecto. La Figura 1A muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de las partículas de CQDs. Las partículas producidas por microplasma eran cicloides u ovaladas con un diámetro promedio de 3,2 nm. Como se muestra en la imagen de alta resolución Fig. 1A (inset), la distancia de red en los CQDs es de 0,21 nm, perteneciente al plano (1,1,0) de grafito. El espectro de Raman muestra que el modo D, llamado modo inducido por desorden, se ubica alrededor de 1342 cm⁻¹ y el modo G se centra alrededor de 1507 cm⁻¹, respectivamente, debido al resultado de la hibridación sp³ y sp² del carbono (Fig. 1E). Se sabe que la intensidad del modo D comparada con el modo G depende del tamaño de los microcristales de grafito en la muestra. El mayor desorden de la muestra conduce a una mayor relación de intensidad ID/IG y a un microcristal de grafito más pequeño. Además, los modos D y G de los polvos de CQD también pueden verse como pequeños copos de grafito con una relación de intensidad ID/IG relativamente alta (0,77).

A Imágenes TEM de CQDs (inset, imágenes TEM de alta resolución); B Distribuciones de tamaño de CQDs; C Espectros de absorción UV-vis de los CQDs; D Espectro FL de los CQDs con longitudes de onda de excitación de 400 a 500 nm en incrementos de 20 nm; E, F Espectro de Raman de CQDs y espectro FTIR de CQDs

FTIR y XPS son herramientas poderosas para caracterizar la composición química y la estructura de materiales basados en carbono. Los datos FTIR para CQDs se registraron en el rango de 400–4000 cm⁻¹, como se muestra en Fig. 1F. El espectro FTIR reveló que los CQDs contienen principalmente grupos funcionales o enlaces químicos de amina (3052 y 3324 cm⁻¹), OH (3200 cm⁻¹), C=O (1595 cm⁻¹), C–N/C–O (1200 cm⁻¹), C=C (1500 cm⁻¹) y CH (748 cm⁻¹) [26, 27]. Los componentes de superficie de los CQDs, determinados por XPS, fueron consistentes con los resultados de FTIR. El espectro completo presentado en Fig. 2A mostró tres picos típicos: C 1s (285 eV), N 1s (400 eV) y O 1s (531 eV).

A Espectros XPS de escala completa de los CQDs; B Espectro de alta resolución de C 1s; C Espectro de alta resolución de N 1s; D Espectro de alta resolución de O 1s

Como se muestra en Fig. 2B–D, un análisis de C 1s reveló la presencia de carbonos sp²/sp³ (C–C/C=C, 284,8 eV), carbonos nitroso (C–O/C–N, 285,9 eV) y carbonos carbonilo (C=O, 287,7 eV). La banda N 1s se desconvolucionó en tres picos a 399,3, 400,3 y 401,7 eV, que corresponden a N pirrólico, N graítico y N amino, respectivamente. La banda O 1s contenía picos a 531,6 y 533,1 eV para C–O y C=O, respectivamente [28, 29]. Importante, la existencia de estos grupos funcionales confirió a los CQDs una solubilidad favorable. Además, se investigaron las propiedades ópticas de los CQDs mediante espectroscopía de fluorescencia y UV-Vis. Los espectros de emisión de fluorescencia de los CQDs se muestran en Fig. 1C. Los CQDs preparados exhiben un comportamiento de emisión de fluorescencia dependiente de la excitación. Cuando se excitan a longitudes de onda de 400 a 500 nm, el pico máximo de emisión de fluorescencia se desplaza hacia el rojo de 473 a 519 nm y la intensidad de fluorescencia disminuye drásticamente [30]. Como se muestra en Fig. 1D, los espectros UV-vis de CQD presentaron un pico de absorción fuerte en el rango de longitud de onda de 400–490 nm. Los CQDs exhibieron dos picos de absorción característicos a 280 y 420 nm, que se refieren a transiciones π–π* (C=C aromático) y n–π* (carboxilo y/o C–N), respectivamente [31, 32]. Por tanto, estas propiedades ópticas de los CQDs proporcionaron factibilidad para la imagen biológica simultánea y la inactivación fotodinámica.

Bioimagen y citotoxicidad de los CQDs

Para evaluar la capacidad de los CQDs para bioimagen y marcado celular, se investigó la imagen celular in vitro usando CQDs en células HeLa mediante un microscopio confocal de barrido láser (CLSM). Las células HeLa se incubaron con 200 μg mL⁻¹ CQDs durante 6 h y luego se prepararon para detección CLSM. Como resultado, las células HeLa mostraron fluorescencia amarilla brillante distribuida uniformemente por toda la célula (Fig. 3A). Más importante aún, cabe destacar que una baja concentración de CQDs de 200 μg mL⁻¹ fue suficiente para marcar células HeLa con fluorescencia amarilla, lo que especificó aún más la posibilidad de los CQDs en imagen celular. Como se ha reportado, las nanopartículas de carbono siempre exhibieron emisión fuerte solo en la región de luz azul, mientras que las emisiones de longitud de onda larga solían ser débiles. Bajo excitación UV, los tejidos biológicos frecuentemente mostraban autofluorescencia azul y eran vulnerables al daño fotónico, lo que obstaculiza seriamente las aplicaciones de análisis de imagen biológica de nanopartículas de carbono con emisiones de longitud de onda corta [33]. Por tanto, el desarrollo de nanopartículas de carbono con emisiones de longitud de onda larga ha sido ampliamente investigado. En el presente estudio, los CQDs preparados mostraron fluorescencia amarilla brillante bajo excitación de luz de 400–450 nm. La fluorescencia amarilla excitada podría permitir el uso de CQDs para la detección de tumores profundos. Sin embargo, aún queda un largo camino antes de aplicaciones prácticas en imagen de cáncer humano.

A Imagen CLSM de células HeLa marcadas con CQDs; B Prueba de citotoxicidad in vitro de CQDs; C Viabilidad relativa de células HeLa incubadas con solución de control o CQDs (200 μg mL⁻¹) y expuestas a luz azul (460 nm, 30 mW cm⁻²) durante 5 min, 10 min y 15 min; D IC50 de CQDs excitados en células HeLa tras exposición a luz azul durante 10 y 15 min (*P < 0,05)

Además de las características de luminiscencia, la alta biocompatibilidad y baja toxicidad son siempre requeridas si los CQDs pretenden desarrollarse como reactivos potenciales de bio-marcado. Para aplicaciones biomédicas, los materiales deben ser altamente biocompatibles en las dosis recomendadas. Para examinar la citotoxicidad, las células HeLa se trataron con CQDs a concentraciones finales que oscilaban entre 0 y 400 μg mL⁻¹ durante 24 h. Como se muestra en Fig. 3B, más del 95 % de las células sobrevivieron según ensayos MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro), lo que reveló que los CQDs eran prácticamente no tóxicos.

Estos datos sugieren que los CQDs recién generados con fluorescencia amarilla excitada tienen baja citotoxicidad y alta biocompatibilidad, lo que facilita su prometedor prospecto en imagen biológica.

Eficacia de la Terapia Fotodinámica

Inactivación de células cancerígenas

Como se muestra en Fig. 3C, la viabilidad no difirió entre células HeLa tratadas con CQDs o luz azul por separado. El tratamiento simultáneo con CQDs y luz azul redujo marcadamente la viabilidad celular de HeLa, dependiendo de la duración de la fotoexposición. Tras irradiación a 460 nm durante 15 min, los CQDs mostraron una notable actividad antitumoral; la viabilidad de células HeLa disminuyó aproximadamente un 40 % a una concentración de 200 μg mL⁻¹. Para detectar más a fondo los efectos de los CQDs excitados, se implementaron ensayos MTT para evaluar la concentración inhibitoria media (IC50) de CQDs excitados en células HeLa. Como resultado, la IC50 de CQDs tras ser excitados en células HeLa fue de aproximadamente 427,5 μg mL⁻¹ (IC 95 % 366,7–498,7 μg mL⁻¹) tras irradiación de 10 min y aproximadamente 255,1 μg mL⁻¹ (IC 95 % 220,9–249,8 μg mL⁻¹) tras exposición a luz azul durante 15 min.

Estos resultados indicaron que los CQDs excitados podían matar eficazmente células tumorales como algunos fármacos anticancerígenos clínicos, como Photofrin [34], lo que impulsó el valor prometedor de los CQDs en terapia antitumoral guiada por imagen.

Generación de ROS por CQDs

Durante la PDT, las células cancerígenas pueden ser eliminadas por ROS citotóxicos generados por el fotosensibilizador endocitado bajo condiciones de irradiación apropiadas [35, 36]. Los ROS pueden inactivar células diana por apoptosis o necrosis con pocos efectos secundarios mediante PDT en varias enfermedades [37,38,39,40]. La inspección de Fig. 4A mostró que el reactivo ROS emite fluorescencia roja, indicando la generación de ROS. Además, la señal roja de ROS se superpuso bien con la fluorescencia de CQDs, lo que significa que la generación de ROS estaba estrechamente asociada con la captación de CQDs por células tumorales. Como se muestra en Fig. 4B, comparado con los grupos de control y sin irradiación láser, los grupos experimentales bajo irradiación láser de 460 nm durante 15 min mostraron una generación obvia de ROS. Nuestros resultados indicaron que los CQDs podían promover significativamente la producción de ROS intracelular bajo irradiación láser de 460 nm y tenían gran potencial para aplicación en PDT. En principio, los CQDs pueden ser excitados del estado fundamental (S0 en Fig. 4C) a un estado excitado (Sn en Fig. 4C), y la eficiencia de este proceso está determinada por la intensidad de la fuente de luz y el coeficiente de extinción. Tras relajación mediada por solvente, los CQDs permanecen en el nivel vibracional más bajo del primer estado excitado singlete. Debido a la rápida relajación vibracional tras la excitación, la energía del fotón emitido desde el primer estado excitado singlete (S1 en Fig. 4C) es menor que la energía del fotón de excitación, resultando en un aumento de longitud de onda. La imagen de fluorescencia utiliza la transición de CQDs de S0 a Sn a S1 [41]. Los CQDs fueron ingeridos por células tumorales HeLa y emitieron fluorescencia cuando se iluminaron con una fuente de longitud de onda adecuada, permitiendo así el marcado celular. S1 puede volver al estado S0 por fluorescencia o por cruce entre sistemas a un estado excitado triplete no fluorescente (T1 en Fig. 4C) [7, 42]. El grupo fluorescente de T1 es especialmente activo en reacciones de transferencia de electrones, generando radicales libres superóxido y resultando subsiguientemente en degradación del grupo fluorescente. La energía de T1 transferida al oxígeno molecular produciría un agente oxidante de oxígeno singlete excitado más fuerte que el oxígeno molecular en estado fundamental. Los radicales superóxido y oxígeno singlete, así como otros ROS, incluyendo OH y H₂O₂, reaccionan con moléculas biológicas cercanas para ejercer fototoxicidad, conduciendo a muerte celular. Tras la captación de CQDs por células HeLa, la iluminación resultó en la transferencia del estado singlete al estado triplete a través del entrecruzamiento, y el proceso de transferencia de energía produjo ROS y finalmente condujo a muerte celular. Bajo la fuente de longitud de onda apropiada, los CQDs experimentan dos tipos de transferencia de energía. Se emitió fluorescencia para marcar células tumorales HeLa, y las células HeLa fueron eliminadas por ROS. Nuestros datos experimentales revelaron la buena biocompatibilidad de los CQDs recién producidos en la oscuridad y la eficiencia de eliminación tumoral bajo condiciones de luz. Por tanto, los CQDs podrían usarse como fotosensibilizador para células y tejidos tumorales.

A Imágenes de fluorescencia de HeLa, (a) Imagen de transmisión de campo brillante, (b) Imagen de fluorescencia de CQDs recopilada en el rango 400–450 nm, (c) Imagen de fluorescencia de reactivo de detección ROS capturada en el rango 510–530 nm, y (d) imagen fusionada; B Producción intracelular de ROS para diversas concentraciones de CQDs con o sin irradiación durante 15 min; C Diagrama simplificado de niveles de energía muestra posibles vías de transferencia de energía para fluorescencia y muerte celular. (S0, estado fundamental de la molécula fluoróforo; S1, primer estado excitado singlete; Sn (n > 1); T1, primer estado excitado triplete; Ex, excitación por absorción de fotón; FL, fluorescencia)

Además, sigue siendo un problema sin resolver cómo los CQDs pueden dirigirse al tumor con precisión y matar células tumorales más eficazmente. La abundancia existente de grupos funcionales hidrofílicos de superficie (carboxilo, carbonilo, epóxido, hidroxilo, hidroxilo, etc.) permite que los puntos de carbono se conjuguen con anticuerpos específicos que podrían dirigirse con precisión a tumores, lo que requiere que el tumor tenga biomarcadores específicos. Simultáneamente, los puntos de carbono también podrían servir como herramienta para administración de fármacos y genes debido a su alta relación superficie/volumen [43]. Considerando la excelente biocompatibilidad, tamaño pequeño para internalización por células tumorales, riqueza en grupos funcionales de superficie y potenciales de bioimagen, los puntos de carbono (incluyendo CQDs) se cree que se convierten en candidatos teranósticos prometedores para terapia tumoral. Sin embargo, aún existen desafíos y muchos problemas sin resolver para las aplicaciones de puntos de carbono en nanomedicina y bioimagen. Se deben hacer más esfuerzos para promover la traducción de la nanomedicina relacionada con puntos de carbono del banco al lecho del paciente en el futuro.

Conclusiones

En resumen, sintetizamos CQDs fotoluminiscentes usando o-fenilendiamina por el método de plasma. Excitados por un láser azul, CQDs con un diámetro de aproximadamente 3,2 nm emitieron fluorescencia amarilla. Resultados de Raman, UV-vis, FTIR y XPS mostraron que más átomos de carbono participaron en hibridación sp², formando un nuevo grupo orgánico. Los CQDs sintetizados por el método de plasma demostraron ser una sonda eficaz en experimentos de imagen celular, y la fluorescencia amarilla emitida por CQDs puede marcar claramente células HeLa. Además, los CQDs sintetizados mostraron solubilidad favorable, no tóxicos y alta biocompatibilidad, lo que podría acelerar su capacidad de bioimagen. Adicionalmente, los CQDs excitados pudieron matar eficazmente células HeLa mediante generación de ROS, lo que exhibió claramente una citotoxicidad fotodinámica satisfactoria de CQDs in vitro y respaldó sus aplicaciones en PDT.

Métodos Experimentales

Síntesis de Puntos Cuánticos de Carbono

El sistema de procesamiento por microplasma se resume en Archivo Adicional 1: Figura S1. Un tubo hueco de acero inoxidable con diámetro interno de 180 μm se conectó a una fuente de alimentación de corriente continua de alto voltaje (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) y se mantuvo a 2 mm sobre la superficie de la solución. Un electrodo de Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) se conectó al cátodo de la fuente de alimentación e inmerso en la solución. Luego, 400 mg de o-fenilendiamina (Shanghai, China) se disolvieron en 40 mL de agua desionizada, y 20 mL de la solución de o-fenilendiamina se añadieron a una placa de Petri y se agitaron usando un agitador magnético. Durante el tratamiento con microplasma, gas argón (Ar) fluyó a través del tubo a una tasa de flujo de 60 sccm, y la corriente DC se mantuvo a 17 mA. Tras 10 min de tratamiento con plasma, el producto negruzco-marronoso se dializó usando una membrana de diálisis (corte de peso molecular, 500 Da) contra 2 L de agua desionizada durante 12 h y posteriormente se filtró a través de una membrana de ultrafiltración de 0,22 μm. Finalmente, se obtuvieron CQDs puros por liofilización.

Caracterización de la Estructura, Composición y Propiedades Ópticas de los CQDs

El tamaño y morfología de los CQDs se caracterizaron por TEM usando un sistema JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japón). La espectroscopía de fluorescencia se realizó usando un Espectrómetro de Luminescencia Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, USA). Los espectros de absorción UV/Vis se midieron usando el espectrofotómetro Varian Cary 50 UV–VIS (Palo Alto, CA, USA). Los espectros FTIR se obtuvieron usando un espectrómetro Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), y la espectroscopía de Raman se realizó usando el espectrómetro micro-Raman UV 800 (Invia-reflex, UK). Los experimentos XPS se realizaron usando un sistema Axis Ultra DLD (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japón).

Cultivo Celular y Ensayo de Citotoxicidad

Células HeLa (ATCC, Manassas, VA, USA) se cultivaron en Medio Dulbecco Modificado Eagle (DMEM) conteniendo 10 % FBS y 1 % penicilina-estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humificada con 5 % CO₂. Para estudios de citotoxicidad de CQDs, las células se contaron y sembraron en placas de 96 pocillos conteniendo 200 μL de medio completo a una densidad de 6000 células por pocillo. Tras 24 h de cultivo, las células se incubaron con CQDs a concentraciones de 0, 25, 50, 100, 200 y 400 μg mL⁻¹ durante otras 24 h, y luego se detectaron las viabilidades celulares usando ensayos MTT para evaluar la citotoxicidad de CQDs. Brevemente, estas soluciones se reemplazaron con 100 μL de solución de prueba MTT (0,5 mg mL⁻¹) e incubaron durante 4 h en una incubadora en la oscuridad. Se eliminó el sobrenadante y los cristales se disolvieron en dimetil sulfoxido (DMSO). Finalmente, la absorbancia de cada pocillo se midió a 490 nm. La densidad óptica se relacionó con la viabilidad celular asumiendo 100 % viabilidad para la muestra de control sin CQDs.

El ensayo MTT también se usó para evaluar la IC50 de CQDs excitados en células HeLa. Brevemente, células HeLa en placa de 96 pocillos se incubaron con CQDs a concentraciones de 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 y 6400 μg mL⁻¹ durante 24 h en la incubadora, tratadas con luz a 460 nm durante 10 min o 15 min por separado, y luego cultivadas otras 24 h. La viabilidad celular de cada pocillo se detectó usando ensayo MTT y los datos se usaron para evaluación de IC50.

Imagen Celular

Células a una concentración de 2 × 10⁴ mL⁻¹ se sembraron en un plato confocal (diámetro = 15 mm), cultivaron durante 24 h y se lavaron con PBS dos veces para asegurar ausencia de células muertas. Se añadió una solución de CQD (200 μg mL⁻¹; pH 7) y las células se incubaron durante 6 h. Posteriormente, las células se lavaron con PBS tres veces para eliminar CQDs no unidos y se fijaron con 4 % paraformaldehído. Luego, las muestras se observaron usando un CLSM (LSM510, Zeiss, Alemania) con excitación a longitudes de onda que oscilaban entre 400 y 450 nm.

Terapia Fotodinámica y Medición de ROS

Para investigar efectos antitumorales, células HeLa se incubaron con 200 μg mL⁻¹ CQDs durante 24 h a 37 °C en la oscuridad y se trataron con luz a 460 nm (30 mW cm⁻²) durante 5, 10 y 15 min. Tras 24 h de incubación, se realizó un ensayo MTT estándar para determinar la viabilidad celular relativa. La generación intracelular de ROS se detectó químicamente usando el método espectrofotométrico con Kit de Ensayo Fluorométrico de ROS Intracelular (sigma, USA). Las células se cultivaron en un plato confocal (diámetro = 15 mm) durante la noche para adherencia. Luego, las células se incubaron con 200 μg mL⁻¹ CQDs durante 4 h. Posteriormente, se añadieron 100 μL/pocillo de Mezcla Maestra de Reacción. Tras incubación de 1 h, las células se fijaron con 4 % paraformaldehído durante 10 min, y se observaron imágenes de fluorescencia de las células por CLSM. Para detección de producción de ROS, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos con 200 μL medio de cultivo. Tras 24 h incubación, el medio se reemplazó con 100 μL solución de CQDs a concentraciones de 0, 100, 200 μg mL⁻¹, y las células se incubaron otras 4 h. Posteriormente, las muestras se lavaron tres veces con PBS, irradiaron durante 15 min o no, e incubaron con 100 μL/pocillo Mezcla Maestra de Reacción durante 1 h. Finalmente, la intensidad de fluorescencia se detectó usando un lector de fluorescencia (excitación 520 nm, emisión 605 nm).

Análisis Estadísticos

Los experimentos involucrados en este estudio se repitieron tres veces, y los análisis estadísticos se realizaron usando SPSS19.0. Las diferencias entre dos grupos se compararon usando prueba de Mann-Whitney U. La IC50 de CQDs excitados en células HeLa se evaluó usando regresión no lineal. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos y materiales del estudio actual están disponibles del autor correspondiente bajo solicitud razonable.

Abreviaturas

PDT:

Terapia fotodinámica

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

CQDs:

Puntos cuánticos de carbono

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

CLSM:

Microscopio confocal de barrido láser

DMEM:

Medio Dulbecco modificado Eagle

MTT:

3-(4,5-Dimetiltiazolil-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro

DMSO:

Dimetil sulfoxido

IC50:

Concentración inhibitoria media