Nuevas nanopartículas de Au Nanostars @ PEG biocompatibles para la obtención de imágenes de TC in vivo y las propiedades de depuración renal

Métodos

Todo el protocolo experimental, incluido cualquier detalle relevante, fue aprobado por el Comité de Ética Regional de la Universidad Médica de Jinzhou, provincia de Liaoning, China.

Materiales e instrumentos

Todos los productos químicos se compraron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se usaron directamente a menos que se indique lo contrario.

Las nanopartículas sintetizadas se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y análisis de rayos X de dispersión de energía (EDX) utilizando voltaje de aceleración de 200 kV (Tecnai G2 Twin, FEI, Hillsboro, OR). La muestra de TEM se preparó secando soluciones de nanopartículas diluidas en una rejilla de cobre recubierta de formvar / carbono. Las muestras se prepararon depositando una gota de una solución coloidal diluida sobre una rejilla de carbón y dejando que el líquido se seque al aire a temperatura ambiente. Los espectros de adsorción UV-vis se registraron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2450 UV / Vis / NIR. La medición de la dispersión dinámica de la luz (DLS) se realizó en un Malvern Zetasizer NANO ZS a 25 ° C.

Síntesis de nanopartículas Au Nanostars / PEG (AuNS @ PEG)

Au nanostars (Au NS) se sintetizaron mediante el método de crecimiento mediado por semillas de acuerdo con un informe anterior [20, 21, 22] con algunos ajustes leves. Normalmente, las semillas de Au que se formaron con un diámetro de 10 nm se sintetizaron mediante la reducción química de HAuCl ₄ según informe anterior [23]; 6 ml de HAuCl ₄ solución ( w / v 1%) a 140 ml de agua ultrapura y se calentó a ebullición mientras se agitaba. Luego, se inyectaron rápidamente 0,75 ml de oleilamina y la mezcla resultante se hirvió durante otras 2 h. El coloide de Au se enfrió naturalmente a temperatura ambiente; Se añadieron 60 ml de ciclohexano al coloide y la solución se agitó magnéticamente durante 1 h más. Posteriormente, se inyectaron 1,5 ml de NaOH (4 M) en la mezcla mientras se agitaba vigorosamente durante otros 30 min. Se dejó que la mezcla fuera jerárquica. La nanoseda de Au contenida en la capa superior se precipitó añadiendo etanol. Los precipitados se purificaron alternativamente con etanol y agua una vez más y se dispersaron en agua.

Se sintetizaron au nanoestrellas con alrededor de 50 nm de diámetro de acuerdo con trabajos anteriores mezclando rápida y simultáneamente AgNO ₃ (1 ml, 3 mM) y ácido ascórbico (500 μl, 0,1 M) con 100 ml de una solución que contiene HAuCl ₄ 0,25 mM , HCl 1 mM y 1,5 ml de semillas de nanoesferas de oro. Luego, se añadió el polímero de polietilenglicol tiolado (PEG, 6 kDa) en gran exceso para pasivar la superficie de la nanopartícula. La solución de la mezcla se agitó continuamente durante 24 h, luego se recogieron las nanopartículas de AuNS @ PEG obtenidas mediante 3 ciclos de centrifugación / redispersión en agua. Las nanopartículas de AuNS @ PEG formadas se volvieron a dispersar en agua para su uso posterior.

Cultivo celular y exposición a nanopartículas AuNS @ PEG

Se recogieron células de neuroglia de tejidos de la médula espinal de rata. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, EE. UU.) Suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U por ml de penicilina y 100 μg por ml de estreptomicina a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO ₂ . Las células se sembraron en placas de cultivo seguido de exposición a nanopartículas de AuNS @ PEG durante 2 horas a ciertas concentraciones (50, 100, 200, 500 y 1000 ppm). Se utilizó DMEM sin nanopartículas de AuNS @ PEG como grupo de control.

Animales y tratamiento

Este trabajo se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Jinzhou (número de permiso:LMU-2013-368), China. Se adquirieron ratas macho Sprague Dawley (180-200 g) en el Centro Animal de la Universidad Médica de Jinzhou (número de licencia:SCXK 2009-0004). Todas las ratas fueron alimentadas en una habitación con temperatura controlada (25,0 ± 0,2 ° C) en un laboratorio libre de patógenos específicos, con un fotoperiodo de luz / oscuridad de 12 h / 12 h y 50% de humedad. A las ratas se les permitió acceso libre a comida y agua.

Los criterios de valoración humanitarios se eligen para minimizar o acabar con el dolor o la angustia de los animales de experimentación mediante la eutanasia, incluidos los agentes inhalantes, los agentes farmacéuticos no inhalantes y los métodos físicos, en lugar de esperar su muerte como criterio de valoración. En este trabajo, las ratas se dividieron en dos grupos:(1) control:las ratas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de solución de hidrato de cloral (10% en peso), y luego, se inyectaron 800 μL de solución salina tamponada con fosfato a través de la vena de la cola. (2) Prueba:se anestesiaron ratas mediante inyección intraperitoneal de solución de hidrato de cloral (10% en peso), y luego, se inyectaron 800 μL de solución de nanopartículas de AuNS @ PEG (200 μg / ml) a través de la vena de la cola. Para el estudio de H&E, las ratas se sacrificaron mediante dislocación cervical sin anestesia previa, y sus corazones, hígados, riñones, bazos e intestinos se disecaron inmediatamente, se almacenaron a -80 ° C y se congelaron rápidamente en isopentano sobre hielo seco hasta más tarde. procesado.

Ensayo de viabilidad celular

Se sembraron células de neuroglía en fase logarítmica en una placa de 96 pocillos a 1 × 10 ⁴ células por pocillo en 100 μl de suspensión celular. Se añadió solución salina tamponada con fosfato (PBS) a los pocillos circundantes. La placa se incubó a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 24 h para permitir que las células se adhieran. A continuación, las células se distribuyeron en cuatro grupos:las células del grupo de control se incubaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%; en el grupo de nanopartículas de AuNS @ PEG, se añadieron 0, 25, 50, 100, 200, 500 o 1000 ppm de nanopartículas de AuNS @ PEG al medio de cultivo; las células se observaron 24 h después bajo un microscopio de contraste de fase invertido (Leica, Heidelberger, Alemania). Posteriormente, se agregaron 20 μl de MTT (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) A cada pocillo durante 4 h. Se retiró el medio y las células se incubaron con 150 μl de dimetilsulfóxido durante 10 min a 37 ° C. Los valores de densidad óptica (DO) se midieron a 490 nm con un lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).

Citometría de flujo

Las células se incubaron en placas de 6 pocillos durante 24 h, luego se agruparon y trataron como se describe anteriormente. Se preparó una suspensión unicelular con tripsina y se centrifugó a 300 g durante 3 min. Después de la eliminación del sobrenadante, las células se lavaron dos veces con PBS preenfriado y se centrifugaron en 1 ml de anexina V (Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd., Tianjin, China) durante 10 min. Las celdas se ajustaron a 10 ⁵ / ml. La suspensión celular se centrifugó y se lavó tres veces con PBS. Se agregaron muestras (100 μl) a tubos Eppendorf con 5 μl de anexina V-APC (Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.) y 7-AAD (Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd.) y se mezclaron. El volumen se completó hasta 500 μl con PBS y los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. La apoptosis se cuantificó mediante citometría de flujo (BD FACSCanto II, BD Becton Dickinson, San José, CA, EE. UU.). La tasa de apoptosis celular se calculó de la siguiente manera:número de células apoptóticas / número total de células × 100%.

Imágenes por TC

Las imágenes de TC se adquirieron mediante TC en espiral de 64 cortes de 128 filas producida por General Electric Company (GE). Los parámetros de imagen fueron los siguientes:el grosor del corte es 0,625; el medio son ratones desnudos; la energía del tubo, kvp, es de 120 μA y 100 mA; CTDIVOL es 6,53 mGy; y el radio es de 4,8 cm. Todos los animales fueron escaneados en la dirección craneal a caudal desde la parte baja del tórax hasta la pelvis. Los datos de la TC se analizaron mediante imágenes y postratamiento.

Análisis histológico

Los órganos se extrajeron y fijaron en paraformaldehído al 4%, luego con solución de sacarosa de paraformaldehído al 30% una vez cada 2 días, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para examen histológico utilizando técnicas estándar. Las secciones se examinaron bajo un microscopio de contraste de fase invertido .

Evaluación de la función renal

Se utilizó un analizador bioquímico (Universidad médica de Jinzhou) para evaluar BUN, Crea, β ₂ -MG y CO ₂ en la sangre. La función renal se evaluó mediante los cambios en los niveles séricos de BUN, Crea, β ₂ -MG y CO ₂ antes y después de la inyección de nanopartículas de AuNS @ PEG en ratas.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± DE y se analizaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.) Y SPSS. Los grupos se compararon mediante el análisis de varianza unidireccional y la prueba de diferencia menos significativa. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de las nanopartículas AuNS @ PEG

Los nanomateriales ingresan al cuerpo humano y desempeñan el papel de detección. Las propiedades físicas y químicas de las nanopartículas se consideran primero antes de que entren en el sistema circulatorio [24, 25]. Como sabemos, hay dos factores clave en el desarrollo de nanosensas de alto rendimiento para la obtención de imágenes de TC in vivo y las propiedades de aclaramiento renal. Uno es una mayor funcionalización de la superficie; el otro es el control de tamaño.

Se utilizó una imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) a gran escala (Fig. 1a) para confirmar la estructura de las nanopartículas de AuNS @ PEG, que mostraba obvia la estructura estelar de las nanopartículas de AuNS @ PEG que se prepararon, y estas nanopartículas tenían los tamaños ideales alrededor 50 nm con alta uniformidad. Luego, los elementos de Au que se encuentran en el espectro de rayos X de dispersión de energía (EDX) de las nanopartículas de AuNS @ PEG también prueban la preparación de Au nanostar (Fig. 1c). Además, la composición en la superficie de las nanopartículas de AuNS @ PEG se caracterizó además por espectros XPS, y las Au4f, C1s y O1s derivadas de las nanoestrellas de Au y PEG se mostraron claramente en la Fig.1b, lo que también confirma la formación de AuNS. @PEG nanopartículas.

Micrografías electrónicas de transmisión de nanopartículas de AuNS @ PEG ( a ), XPS ( b ) y EDX ( c ) de las nanopartículas AuNS @ PEG

Las características anteriores demostraron la síntesis exitosa de nanopartículas de AuNS @ PEG.

CT Valor de las nanopartículas AuNS @ PEG

Las nanopartículas de Au se han utilizado ampliamente como agentes de contraste de CT debido a su mejor propiedad de atenuación de rayos X que los agentes de contraste de CT de molécula pequeña basados ​​en yodo convencionales. Yodo ( Z =53) ha sido históricamente el átomo de primera elección en el campo de las imágenes de TC. Para evaluar la viabilidad de las nanopartículas de AuNS @ PEG para imágenes de tomografía computarizada de rayos X, medimos los valores de CT (unidades Hounsfield, HU). La Figura 2a muestra que las nanopartículas de AuNS @ PEG tienen un valor CT más alto en comparación con el yodo y el agua DI a la misma concentración. Cuando aumentó la concentración de nanopartículas de AuNS @ PEG, la intensidad de la imagen de TC también aumentó continuamente con imágenes más brillantes. Al trazar el valor de CT (en HU) de AuNS @ PEG en función de la concentración (Fig. 2b), pudimos ver una atenuación lineal del valor de CT de las nanopartículas de AuNS @ PEG con las diferentes concentraciones. Estos resultados revelan que las nanopartículas de AuNS @ PEG son candidatas ideales para una nanosensda de imágenes de TC positiva.

La intensidad de atenuación de rayos X de las nanopartículas de AuNS @ PEG en función de la concentración de Au ( a ) e imagen de TC de las nanopartículas de AuNS @ PEG en diferentes concentraciones (yodohidrina, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,75, 15,625 y 7,8125 ppm, respectivamente) ( b )

Ensayo de citotoxicidad

Fue crucial investigar la biocompatibilidad de las nanopartículas de AuNS @ PEG in vitro antes de que se utilizara en la obtención de imágenes de TC in vivo como agente de contraste. Se realizó un ensayo de MTT para evaluar su citotoxicidad en células de neuroglia. Después de la incubación con nanopartículas de AuNS @ PEG a diferentes concentraciones (25, 50, 100, 200, 500 y 1000 ppm, respectivamente) durante 24 h, se llevó a cabo un ensayo de viabilidad MTT de células de neuroglia. Se pudo observar que la viabilidad de las células después del tratamiento con nanopartículas de AuNS @ PEG en el rango de concentración estudiado es bastante similar al control, lo que indica claramente que las nanopartículas de AuNS @ PEG formadas tienen una buena citocompatibilidad a una concentración de hasta 200 ppm. . Incluso con una dosis relativamente alta de nanopartículas (1000 ppm), la viabilidad celular se mantuvo por encima del 90% (Fig. 3a).

Viabilidad celular de neuroglia incubada con diferentes concentraciones de nanopartículas de AuNS @ PEG durante 24 h ( a ); la apoptosis de células inducida por nanopartículas de AuNS @ PEG se muestra mediante citometría de flujo:control ( bi ), 25 ppm ( ii ), 50 ppm ( iii ), 100 ppm ( iv ), 200 ppm ( v ), 500 ppm ( vi ) y 1000 ppm ( vii )

La citocompatibilidad de las nanopartículas de AuNS @ PEG se confirmó además mediante el análisis de citometría de flujo de las células tratadas con las nanopartículas de AuNS @ PEG a diferentes concentraciones durante 2 h. En el análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con anexina V-APC y 7-AAD después del tratamiento con nanopartículas de PBS y AuNS @ PEG. Se utilizaron como control células de neuroglia tratadas con PBS sin tinción (Fig. 3bi). Se pudo observar que las células tratadas con las nanopartículas de AuNS @ PEG a concentraciones de 25, 50, 100, 200, 500 y 1000 ppm, respectivamente (Fig. 3bi-vii). Tomados junto con los resultados del ensayo MTT, nuestros resultados mostraron que las nanopartículas de AuNS @ PEG tienen una buena citocompatibilidad y no hubo ningún cambio evidente en la morfología celular después del tratamiento con las nanopartículas de AuNS @ PEG, lo que coincidió con los datos de MTT.

Biodistribución e imágenes de TC in vivo

Alentados por su alto rendimiento de contraste de CT en el experimento in vitro, hemos confirmado aún más la viabilidad de las nanopartículas de AuNS @ PEG como agente de contraste de CT in vivo. Se inyectaron por vía intravenosa nanopartículas de AuNS @ PEG (200 ppm) en las venas de la cola de la rata. Se eligió tal dosis de nanopartículas de AuNS @ PEG debido a los resultados de baja toxicidad y porcentaje de apoptosis de MTT y citometría de flujo y alta sensibilidad de CT. Las imágenes de TC de las regiones de órganos importantes se registraron antes de la inyección en la vena de la cola y en diferentes puntos de tiempo después de la inyección en la vena de la cola (Fig. 4). Nuestro estudio tiene como objetivo probar la capacidad de la tomografía computarizada y el aclaramiento renal. Por eso, destacamos el cambio del órgano del riñón y la vejiga en las imágenes de TC. La Figura 4a es la imagen de TC del riñón de rata antes de la inyección. En comparación con la preinyección, la imagen del riñón mejora mucho de 0,5 a 2 h (fig. 4b-d). La distribución dependiente del tiempo de las nanopartículas de AuNS @ PEG en la rata también fue rastreada por el valor de la señal de CT después de la inyección intravenosa. Las imágenes de riñón y vejiga mejoraron enormemente de 0,5 a 2 h, y el valor de HU de ellas aumentó de 95 a 464 y de 105 a 664. Después de 6 h después de la inyección, la intensidad del contraste de TC en el riñón de rata obviamente disminuyó con el tiempo ( Figura 4e). Después de 24 h después de la inyección, las imágenes de TC del órgano de la vejiga son completamente claras, mostrando las excelentes propiedades de depuración renal de las nanopartículas de AuNS @ PEG (Fig. 4f). Debido a su tamaño de partícula óptimo y funcionalización de la superficie, la eliminación de nanopartículas de AuNS @ PEG de la sangre durante la circulación puede ser muy lenta. Por lo tanto, estos resultados indican que las nanopartículas de AuNS @ PEG preparadas podrían ser una nanosonda única y prometedora para proporcionar imágenes de TC en tiempo real in vivo. Esto es beneficioso para futuras aplicaciones clínicas porque los agentes de contraste se pueden administrar a los pacientes en el hospital.

Imágenes de TC de rata antes de la inyección ( a ) y en diferentes momentos (0,5, 1, 2, 6 y 24 h) ( b - f ) después de la inyección intravenosa de nanopartículas de AuNS @ PEG (200 ppm)

Tinción H&E

Los cambios histológicos en los órganos de los ratones se realizaron después de 24 h después de la inyección de nanopartículas de AuNS @ PEG, y los resultados se muestran en la Fig.5. Podemos ver que no se observó ningún cambio obvio en la histología de los órganos principales. y lo más importante, no quedan nanopartículas de AuNS @ PEG residuales en estos órganos. Según los resultados anteriores, las nanopartículas de AuNS @ PEG exhibieron una buena biocompatibilidad y ninguna toxicidad in vivo obvia, lo que lo promete como un nuevo agente de contraste de imágenes de TC para la aplicación de medicamentos biológicos.

Secciones de tejido teñidas con H&E: a corazón, b hígado, c bazo, d pulmón, e riñón y f intestino. Las barras de escala representan 100 mm

Estudio de función renal de nanopartículas AuNS @ PEG

Para evaluar más a fondo la toxicidad in vivo de las nanopartículas de AuNS @ PEG, los parámetros de BUN, Crea, β ₂ -MG y CO ₂ se midieron para estudios de función renal; analizamos el suero. Estos valores permiten evaluar si la función renal de la rata es buena o no. Los valores de BUN pueden evaluar la función urinaria de la rata. El valor cambiante de Crea representa las diversas enfermedades en el cuerpo de la rata. El β ₂ -La concentración de MG está relacionada principalmente con la función tubular renal. Y el valor de CO ₂ Puede evaluar la función de acidificación del túbulo renal. A la rata se le administraron nanopartículas de AuNS @ PEG a una concentración de 200 ppm. El nivel de estos resultados se examinó 24 h después de la inyección, y no hubo diferencias entre antes y después de la inyección de nanopartículas de AuNS @ PEG en ratas (Tabla 1).

Conclusiones

En resumen, desarrollamos nanopartículas fáciles de AuNS @ PEG para aplicaciones en imágenes de TC. Las nanopartículas de AuNS @ PEG formadas tienen tamaños ultrapequeños, baja toxicidad, buena dispersabilidad en agua, hemocompatibilidad y citocompatibilidad en el rango de concentración dado. Los valores de CT muestran que las nanopartículas de AuNS @ PEG tienen una buena imagen brillante. Los resultados de las imágenes in vitro indican que las nanopartículas de AuNS @ PEG poseen fuertes propiedades de atenuación de rayos X como un nuevo agente de contraste para aplicaciones de imágenes de TC, que también fueron demostradas por las imágenes de TC de riñón de rata in vivo. Además, la distribución del estudio biológico y la exploración de la toxicidad in vivo muestran que las nanopartículas de AuNS @ PEG pueden metabolizarse y tienen una alta compatibilidad biológica. Por lo tanto, las nanopartículas de AuNS @ PEG pueden ser candidatos prometedores para aplicaciones médicas.

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