Un nuevo sistema analítico para evaluar propiedades fisicoquímicas de nanopartículas de plata en piel humana

Resumen

Para garantizar el uso seguro de nanopartículas de plata (nAg) en cosméticos, es necesario revelar las propiedades físicas de nAg dentro de la piel, ya que estas propiedades pueden cambiar durante el proceso de absorción percutánea. En este estudio, nuestro objetivo fue establecer un sistema analítico basado en espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente de partícula única (sp-ICP-MS) para determinar las propiedades físicas de nAg en la piel. Primero, optimizamos un método de pretratamiento para solubilizar muestras de piel y luego demostramos que la mayoría de las nAg se recuperaron con tratamiento de hidróxido de sodio manteniéndose en forma de partícula. Para separar la piel en epidermis y dermis, examinamos varias condiciones de irradiación por microondas. El análisis sp-ICP-MS indicó que la aplicación de 200 W por 30 s fue óptima, ya que esta condición aseguró separación completa de capas de piel sin cambiar las propiedades físicas de la mayoría de nAg. Finalmente, evaluamos la aplicación in vivo analizando la cantidad y propiedades físicas de Ag en epidermis, dermis y sangre periférica de ratones tras exponer la piel a nAg o Ag⁺. El análisis subsiguiente sp-ICP-MS indicó que nAg podían absorberse y distribuirse en capas más profundas en forma ionizada, mientras que Ag⁺ se absorbía y distribuía sin cambio en propiedades físicas. Este estudio indica que para obtener comprensión integral de la respuesta de piel tras exposición a nAg, es esencial considerar la distribución y tamaño de partícula no solo de nAg sino también de Ag⁺ liberado de nAg en la piel.

Introducción

Los avances tecnológicos recientes en nanotecnología han acelerado el desarrollo de nanopartículas diseñadas (ENP) que son partículas menores a 100 nm. Debido a sus propiedades beneficiosas, como penetración tisular mejorada y reacción de superficie, en comparación con materiales de tamaño micro o mayor, las ENP se usan ampliamente en varios productos, incluyendo cosméticos, alimentos y medicina [1-3]. Por ejemplo, nanopartículas de plata (nAg), uno de los tipos más comunes de ENP, se incorporan en cosméticos por sus propiedades antibacterianas resultantes de una liberación constante de iones de plata (Ag⁺) [4, 5]. Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas únicas asociadas con el pequeño tamaño de partícula de nAg pueden ser peligrosas. Se sabe que estas partículas pueden interrumpir barreras impenetrables, como la barrera hematoencefálica, e inducir inflamación [6]. Además, algunos estudios han reportado que las ENP pueden penetrar la barrera cutánea [7-9]. Por tanto, para determinar la seguridad del uso continuo de estas partículas, es importante entender los efectos tóxicos asociados con ENP que contienen nAg investigando la dinámica de estas partículas dentro de tejidos, como la piel.

Para garantizar seguridad, es indispensable entender los posibles riesgos asociados con el uso de ENP, lo que involucra conceptos integrativos de "peligros" (toxicidad potencial) y "condiciones de exposición". Mientras los peligros de ENP se han analizado mundialmente, solo unos pocos estudios han examinado las condiciones relativas a la exposición a ENP [10]. En particular, se ha reportado que nAg y Ag⁺ pueden cambiar sus propiedades físicas dentro del cuerpo. Por ejemplo, la ionización de nAg resulta en formación de nAg con menor tamaño de partícula y liberación de Ag⁺ [11]. Por el contrario, nAg con tamaño de partícula pequeño pueden detectarse en epitelio intestinal de ratas tras administración oral de acetato de plata [12]. Además, reportamos recientemente que comparado con nAg más pequeñas y Ag⁺, nAg más grandes se encuentran más fácilmente en leche materna de ratas lactantes expuestas a esas nAg [13]. Por tanto, nAg puede cambiar sus propiedades físicas en el cuerpo, lo que a su vez lleva a cambio en cinética. Así, para entender los riesgos involucrados, es necesario evaluar propiedades físicas, como tamaño de partícula, de estas partículas, y distinguir entre estas partículas e iones en el cuerpo.

En este respecto, aplicamos espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente de partícula única (sp-ICP-MS), que introduce un máximo de una partícula en el analizador por tiempo de permanencia. Es un método efectivo que puede usarse para determinar tamaño de partícula analizando intensidad de pico y concentración de partícula via tasas de pico. Partículas e iones pueden distinguirse analizando señales de pico y fondo [14]. Previamente optimizamos un método de pretratamiento para sp-ICP-MS en muestras biológicas para determinar semicuantitativamente propiedades físicas de ENP en varios órganos, como hígado, corazón, pulmones, riñones y bazo [15].

La piel comprende la epidermis, incluyendo el estrato córneo (SC), y la dermis, conteniendo vasos sanguíneos, vasos linfáticos y nervios [16]. Por tanto, la entrada de ENP en cada capa de piel puede inducir toxicidad en grados variables. Por ejemplo, la distribución de nanopartículas de dióxido de titanio en células queratinocitos de epidermis humana puede estimular producción de especies reactivas de oxígeno [17]. Además, en ratones sin pelo, exposición dérmica a nanopartículas de dióxido de titanio por 60 días no solo llevó a cambios patológicos, como dermis más delgada por toxicidad local, sino también a cambios patológicos en hígado, como necrosis de licuefacción por toxicidad sistémica que se extendió vía vasos sanguíneos en la dermis [18]. Adicionalmente, las respuestas biológicas en cada capa pueden variar dependiendo de propiedades físicas, como tamaño de partícula, y diferencias entre partículas e iones [19]. Para entender la seguridad del uso de nAg, es necesario entender las propiedades físicas y biodistribución de nAg tras exposición a piel.

Para resolver este problema particular, se necesita un enfoque que pueda pretratar la piel y separar sus capas sin causar pérdidas durante recuperación o cambios en propiedades físicas de ENP. Sin embargo, tal enfoque óptimo para la piel no se ha ideado.

En este estudio, optimizamos un enfoque de pretratamiento que determina semicuantitativamente las propiedades físicas de nAg, una ENP modelo, en cada capa de piel via sp-ICP-MS, y posteriormente evaluamos su efectividad in vivo.

Métodos

Ratones

Ratones Slc:ICR (hembras, 8 semanas) se compraron de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Los ratones se alojaron en habitación con ciclo luz-oscuridad: luces encendidas a 8 am y apagadas a 8 pm. Alimento y agua disponibles como pellets de comida y sistema de suministro de agua en la parte superior de la jaula. Todos los protocolos experimentales se realizaron bajo condiciones aprobadas por el comité de investigación animal de Universidad de Osaka, Japón.

nAg y Ag⁺

Suspensiones de nAg recubiertas con citrato con diámetros de 100 nm (nAg100) se compraron de nanoComposix (San Diego, CA, USA) como dispersiones de stock (1 mg/mL). Nitrato de plata (AgNO₃) se compró de Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japón), también como dispersiones de stock (1 mg/mL). RM8013, usado como estándar para calcular eficiencia de transporte, se compró del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (Gaithersburg, MD, USA). Cada tipo de nanopartícula se sonificó por 10 min antes de usar. Nanopartículas e iones también se vortexearon por 10 s antes de usar.

Reactivos

Hidróxido de sodio (NaOH, 0,1 mol/L) se compró de Nacalai Tesque Company (Osaka, Japón) y ácido nítrico (HNO₃, 70%) de Kanto Kagaku Chemical Industries (Tokyo, Japón). Solución salina fosfato amortiguada (PBS), pH 7, se preparó.

Optimización de métodos de pretratamiento

La epidermis y la dermis de cada ratón se separaron, mezclaron con PBS (relación p/v 1:10), y homogeneizaron. El homogenizado se mezcló con solución nAg100 de 100 ng/mL. La mezcla se trató con uno de los siguientes reactivos a relación v/v 1:1; 0,1 mol/L NaOH, 70% HNO₃, o PBS. Las muestras se incubaron por 3 h a 37 °C y se sometieron a sp-ICP-MS.

Separación de piel via irradiación por microondas

Cada ratón fue eutanasiado con isoflurano (Wako), tras lo cual una muestra de piel dorsal de 2 cm² (2 cm × 1 cm) se extirpó usando tijeras quirúrgicas y pinzas. Se tuvo cuidado especial para prevenir daño tisular durante el procedimiento de extirpación. Se usó horno de microondas (RE-SW-20-H, Sharp, Japón) para irradiar la piel a frecuencia de 2450 MHz. Las muestras de piel se colocaron en un plato y se pusieron en el centro del horno de microondas. De acuerdo con requisitos de prueba, las muestras de piel se irradiaron por 10, 30 y 60 s a 200, 600 y 900 W, respectivamente. Tras irradiación, las muestras se removieron rápidamente y cada epidermis y dermis se separaron rápidamente por raspado suave con pinzas quirúrgicas. Una solución nAg100 de 100 ng/mL se usó para análisis de tasa de recuperación y diámetro promedio de nAg tras irradiación (200 W, 30 s).

Administración transdérmica de nAg100 y Ag⁺

Ratonas Slc:ICR de 9 semanas se dividieron en 6 grupos de 3 ratones por grupo, según peso corporal. Los ratones se anestesiaron con isoflurano. El pelo en sus dorsos se afeitó con cortapelos (Panasonic®, Osaka, Japón) y navaja (Gillette®, Alemania). Luego, nAg100 y Ag⁺ (20 μg/cm²) se aplicaron directamente a área superficial de 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) de piel dorsal y se cubrieron firmemente con film plástico no absorbente. Un trozo de gasa del mismo tamaño se colocó sobre el film plástico. Una venda elástica auto adherente se usó para cubrir la gasa envolviendo alrededor de la piel y la piel se dejó cubierta por 5 días.

Pretratamiento de muestras de piel y sangre

Cinco días tras tratamiento, sangre periférica del plexo venoso retroorbitario y piel dorsal se colectaron para análisis. Luego, muestras de piel dorsal de 2,25 cm² (1,5 cm × 1,5 cm) se extirparon usando tijeras quirúrgicas y pinzas. Se tuvo cuidado especial para prevenir daño tisular durante extirpación. Capas SC se removieron secuencialmente usando trozos de 2 cm de cinta adhesiva (Scotch®, 3M), antes de separar epidermis de dermis. Los trozos de cinta se presionaron en el área tratada de piel dorsal tras lo cual se aplicó presión constante por 10 s. Se requirieron veinte trozos de cinta para remover todo el SC de cada ratón. Luego, dermis y epidermis se separaron con irradiación por microondas y homogeneizaron con PBS (relación p/v 1:10). Sangre colectada, así como homogenizados de dermis y epidermis, se trataron con 0,1 mol/L NaOH a relación v/v 1:1 e incubaron por separado por 3 h a 37 °C. Tras incubación, la masa total de plata en sangre, mezclas de epidermis y dermis se analizó con espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Cuantificación y evaluación de propiedades físicas de nAg y Ag⁺ se realizaron usando sp-ICP-MS.

Medición de masa total de plata

Para medir concentración total de plata en sangre, SC, epidermis y muestras de dermis, se usó sistema Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Las condiciones de análisis fueron: potencia RF 1550 W; gas portador 1,05 L/min Ar; tiempo de permanencia 100 ms. Las mediciones se repitieron tres veces en modo MS. Rodio se usó como estándar interno para Ag. Los elementos objetivo de análisis ICP-MS fueron ¹⁰³Rh y ¹⁰⁷Ag. Soluciones estándar de Ag y rodio se obtuvieron de Wako.

Análisis sp-ICP-MS y cálculo

Se usó Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) para análisis sp-ICP-MS. Condiciones de análisis: potencia RF 1550 W; gas portador 1,05 L/min Ar; tiempo de permanencia 10 ms; tiempo de análisis 30 s. Herramientas de cálculo de partícula única - RIKILT publicadas por Wagenen Food Safety Research (Wageningen University, Wageningen, Países Bajos) - se usaron para calcular tamaño de partícula [20].

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se condujeron usando software GraphPad Prism versión 5.0 para Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). La significancia estadística se estableció en P < 0,05.

Resultados y Discusión

Estrategias para construir método para determinar cantidad y propiedades físicas de nAg en cada capa de piel

Para determinar cantidad y propiedades físicas de nAg en cada capa de piel, es necesario solubilizar completamente muestras de piel y preparar muestras aptas para análisis sp-ICP-MS. También es esencial separar epidermis y dermis, sin pérdidas durante recuperación o cambios en propiedades físicas de nAg, porque nAg no absorbidos transdérmicamente a veces pueden eliminarse durante remoción de SC via stripping con cinta [21].

Respecto a solubilización de muestras de piel, hemos reportado previamente que pretratamiento con NaOH es técnica óptima para cuantificación y análisis de propiedades físicas de nAg en tejidos animales, como hígado, corazón, pulmones, riñones y bazo [16]. Por tanto, pretratamiento con NaOH se aplicó a muestras de piel en este estudio.

El tratamiento hidrotérmico, que conduce a ablandamiento de fibras de colágeno y digestión enzimática mejorada, promoviendo separación en unión epidérmico-dérmica (EDJ), se usa ampliamente para separar piel en capas epidérmica y dérmica [22]. Aunque estos tratamientos separan eficientemente capas de piel, nAg en las capas puede ionizarse en solución acuosa resultando en cambio en sus propiedades físicas. Se reporta que un pulso corto de irradiación por microondas permite separar piel en capas epidérmica y dérmica mediante generación de calor que disrumpe la EDJ [23, 24]. Por tanto, aplicamos irradiación por microondas sin incubación en solución por tiempo corto.

Colectivamente, propusimos una estrategia (ilustrada en Fig. 1), validada analizando tasas de recuperación y cambios de propiedades físicas de nAg en cada capa de piel.

Optimización de métodos de pretratamiento para detectar nAg100 en epidermis y dermis

Nos referimos a nuestro estudio previo para optimizar método de pretratamiento para solubilizar muestras de piel. Ishizaka et al. [15] reportaron que, entre varios reactivos solubilizantes, como NaOH y HNO₃, pretratamiento con NaOH fue óptimo. Así, probamos HNO₃ y NaOH como reactivos de solubilización ácida y alcalina, respectivamente. Los homogenizados de epidermis y dermis separados de muestras de piel de ratón se mezclaron con nAg100 para obtener concentración final de Ag de 100 ng/mL seguido de tratamiento con cada reactivo solubilizante a 37 °C. Primero, evaluamos tasa de recuperación de Ag tras tratamiento con estos reactivos. Análisis ICP-MS indicó que tasa de recuperación casi 100% se logró solo con tratamiento NaOH y HNO₃ (Fig. 2a). Luego, para evaluar cambios en propiedades físicas por cada tratamiento, analizamos concentraciones de recuperación de cada partícula e ión. Análisis sp-ICP-MS indicó que nAg100 se ionizó casi completamente por HNO₃. Esto sugirió que HNO₃, como reactivo ácido, disolvió las partículas y las convirtió en iones, como también se reportó en estudio previo [15]. En contraste, la mayoría de nAg100 tratado con NaOH permaneció como partículas, no como iones (Fig. 2b). Así, NaOH permitió que la mayoría de nAg100 permaneciera en forma de partícula. Finalmente, se evaluaron distribuciones de diámetros de partícula para analizar propiedades físicas en detalle. Tratamiento con HNO₃ cambió diámetro promedio de partícula de 100 nm a 40 nm, correspondiente a ionización de nAg100. Por el contrario, el diámetro promedio de partícula tras tratamiento NaOH fue aproximadamente 100 nm, correspondiente al tamaño de partícula inicial (Fig. 2c). Esto sugirió que pretratamiento con NaOH fue óptimo para detectar nAg100 en piel de ratón.

Separación de muestras de piel en epidermis y dermis via irradiación por microondas y evaluación de tasas de recuperación y cambios en propiedades físicas de nAg

Para separar muestras de piel en capas epidérmica y dérmica, aplicamos diferentes condiciones de irradiación por microondas relevantes a nuestro estudio y reportadas previamente como exitosas [24] y comparamos su rendimiento respecto a separabilidad de piel y cambios en propiedades físicas. Se observó que bajo condiciones de 200 W por 10 s, 600 W por 30 s, 600 W por 60 s, 950 W por 30 s y 950 W por 60 s, la piel no se separó en capas epidérmica y dérmica (Fig. 3a). Además, la piel solo se separó parcialmente en capas epidérmica y dérmica bajo condiciones de 200 W por 60 s, 600 W por 10 s y 950 W por 10 s. En contraste, la piel se separó completamente en capas epidérmica y dérmica solo tras irradiación a 200 W por 30 s. Estos resultados indican que irradiación a 200 W por 30 s es óptima para separación de capas de piel.

Para verificar si esta irradiación por microondas a 200 W por 30 s afectó propiedades físicas de nAg100, determinamos propiedades físicas de Ag en capas epidérmica y dérmica. Los homogenizados de epidermis y dermis, cada uno mezclado con 100 ng/mL de nAg100, respectivamente, se lizaron usando NaOH e irradiaron a 200 W por 30 s. Análisis sp-ICP-MS reveló que la mayoría de nAg100 tratado con irradiación por microondas permaneció como partículas, al igual que el grupo no tratado (Fig. 3b). Para analizar propiedades físicas en detalle, también se evaluaron distribuciones de diámetros de partícula. El diámetro promedio fue casi 100 nm, correspondiente al tamaño de partícula inicial (Fig. 3c). Estos hallazgos sugieren que irradiación por microondas de muestras de piel a 200 W por 30 s es un enfoque prometedor para separar eficientemente piel en capas epidérmica y dérmica sin cambiar propiedades físicas de nAg100.

Colectivamente, estos resultados indican que habíamos desarrollado exitosamente un sistema para determinar semicuantitativamente las propiedades físicas de nAg100 en cada capa de piel. Específicamente, el método implica: (i) remoción de nAg100 no absorbidos transdérmicamente removiendo SC con método de stripping con cinta [21]; (ii) separación de piel en capas epidérmica y dérmica via irradiación por microondas; (iii) solubilización de epidermis y dermis con tratamiento NaOH; y (iv) determinación semicuantitativa de propiedades físicas de Ag en cada capa de piel usando sp-ICP-MS.

Evaluación práctica determinando cantidad y propiedades físicas de nAg100 y Ag⁺ en capas de piel de ratón In Vivo

Para evaluar aplicación práctica de este enfoque, analizamos cantidad y propiedades físicas de Ag en epidermis y dermis así como en sangre periférica, tras exponer piel de ratón a nAg100 y Ag⁺ in vivo. Cinco días tras exposición, separamos piel en epidermis y dermis bajo condiciones optimizadas para irradiación por microondas y solubilizamos estas usando NaOH, como se describió en sección previa. Análisis ICP-MS indicó que Ag estaba presente en todos los tejidos (epidermis, dermis y sangre) de todos los grupos. En dermis y sangre, Ag en grupo expuesto a Ag⁺ tendió a aumentar, comparado con grupo expuesto a nAg100 (Fig. 4a). Los datos sugirieron que aunque ambas formas iónica y de partícula fueron absorbidas percutáneamente y distribuidas como se reportó previamente [8, 9], fue más fácil para las formas iónicas infiltrarse en capas de tejido más profundas que para las formas de partícula.

Luego, evaluamos la relación de nAg y Ag⁺ en cada muestra. En grupo expuesto a Ag⁺, casi todo Ag se detectó en forma iónica en epidermis, dermis y sangre, indicando que Ag⁺ fue absorbido y distribuido percutáneamente sin cambio en propiedades físicas. Por el contrario, en grupo expuesto a nAg100, aproximadamente 70% de Ag en epidermis y dermis estaba presente en forma de partícula, mientras que el Ag restante estaba ionizado. Además, Ag detectado en sangre periférica fue casi totalmente ionizado y la forma de partícula apenas se detectó (Fig. 4b). Finalmente, evaluamos tamaño de partícula en capas epidérmica y dérmica, donde principalmente se detectaron formas de partícula. Análisis sp-ICP-MS reveló que tamaños de partícula detectados en ambas capas fueron aproximadamente 70-80 nm, correspondiente a la tasa a la que nAg100 se ioniza (Fig. 4c). Estos datos sugieren que cuando la piel se expone a nAg100, puede absorberse y distribuirse mientras se ioniza.

Como se reportó previamente, los ligandos de superficie de nanopartículas afectaron su absorción en la piel [25, 26]. Por ejemplo, nanopartículas de oro modificadas con grupo amino se absorbieron en piel de ratón y humana en mayor medida que nanopartículas de oro modificadas con grupo carboxilo en experimentos ex vivo [25]. Además, análisis de dinámica molecular indicó que la capacidad de penetración en piel disminuyó de nanopartículas de oro neutras hidrofóbicas a catiónicas a aniónicas en ese orden [26]. En este respecto, se infirió en este estudio que nAg100 era menos probable que penetrara el SC en la epidermis, la barrera cutánea inicial, porque nAg100 estaba modificado con citrato y cargado negativamente. Por tanto, la razón de que las partículas se observaran en dermis y sangre podría ser que las partículas penetraron a través de poros así como a través de la epidermis.

También se ha reportado que la penetrabilidad de nanopartículas de oro mejoró por modificación con péptidos penetrantes de células, como Tat y R7 [25]. Por tanto, en el futuro, modificaciones similares pueden considerarse para nAg para entregarlas más profundo en la piel. Además, puede ser necesario reducir el tamaño de nAg, porque el efecto de la modificación de superficie es mayor con mayor área superficial específica.

Conclusiones

En este estudio, desarrollamos un enfoque de pretratamiento para determinar semicuantitativamente las propiedades físicas de nAg100 en cada capa de piel con sp-ICP-MS. Usando este enfoque, mostramos que la exposición de piel a nAg100 puede resultar en nAg100 ionizándose, absorbiéndose y distribuyéndose en capas más profundas. Por tanto, para entender respuestas biológicas o toxicidad asociadas con exposición de piel a nAg100, puede ser necesario considerar no solo la distribución de nAg100 y su tamaño de partícula, sino también la de Ag⁺ de nAg100, que se funde en tejidos cutáneos. Por tanto, este enfoque muestra promesa como técnica fundamental que puede usarse para análisis de riesgo.