Nanopartículas de Óxido de Hierro Superparamagnético Ultrasmall para Rastreo de Células Madre en Terapia de Parkinson

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) se caracteriza por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo, y el método de trasplante de células madre proporciona una estrategia prometedora para el tratamiento. En estos estudios, rastrear los comportamientos biológicos de las células trasplantadas in vivo es esencial para una comprensión básica de la función de células madre y evaluación de efectividad clínica. En el presente estudio, desarrollamos unas nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético ultrasmall (USPIO) novedosas recubiertas con ácido poliacrílico (PAA) y metoxipolietilenglicol amina (PEG) por método de descomposición térmica y una modificación de dos pasos. Los NPs USPIO-PAA/PEG tienen un diámetro uniforme de 10.07 ± 0.55 nm y pico de absorción propio de los ligandos correspondientes, como se muestra por TEM y FTIR. MTT mostró que la supervivencia de células incubadas con NPs USPIO-PAA/PEG permaneció por encima del 96%. Los USPIO-PAA/PEG sintetizados tuvieron una buena tasa de relajación de 84.65 s⁻¹ Mm⁻¹, indicando que podrían ser eficientemente captados y rastreados por MRI. Además, las células madre derivadas de tejido adiposo humano primarias (HADSCs) fueron caracterizadas, marcadas con USPIO-PAA/PEG y trasplantadas al estriado de modelos de rata EP inducidos por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Las células marcadas pudieron ser rastreadas por MRI hasta 3 semanas después de la cirugía de trasplante; además, el trasplante con HADSCs marcadas atenuó significativamente las rotaciones inducidas por apomorfina en modelos EP y aumentó el número de neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra. En general, el desarrollo de NPs USPIO-PAA/PEG proporciona una herramienta prometedora para técnica de rastreo in vivo de terapia celular e identifica una estrategia novedosa para rastrear células madre con potencial terapéutico en EP.

Introducción

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo. El deterioro relativamente focal la hace una buena candidata para terapias basadas en células. Varios tipos de células, que van desde tejido mesencefálico fetal [1] hasta neuronas inducidas derivadas de células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) [2], han sido implicadas en el tratamiento de EP; sin embargo, preocupaciones éticas y el riesgo potencial de tumorigenicidad no pudieron evitarse durante la aplicación [3]. Las células madre mesenquimales (MSC) son una población de células madre multipotentes que se ha reportado en la última década como una herramienta terapéutica prometedora para enfermedades neurodegenerativas, incluyendo EP [4, 5]. Comparadas con otros tipos de células, las MSC muestran buena proliferación, disponibilidad generalizada en todo el cuerpo humano e inmunosupresión. Algunos estudios han mostrado que el trasplante intracraneal de MSC promueve neuroprotección, diferenciación neuronal e inmunomodulación [6,7,8]. En estos estudios, rastrear la viabilidad, migración e integración de células trasplantadas in vivo es esencial para una comprensión básica de la función de células madre y evaluación de efectividad clínica.

Para analizar mejor los efectos terapéuticos de las células trasplantadas, se han desarrollado varios trazadores. La seguridad y eficacia de los trazadores son los factores más críticos que influyen en la aplicación. Comparado con el marcado con proteínas fluorescentes [9], el rastreo usando partículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) no traería ninguna modificación genética a las células trasplantadas [10,11,12]. Varios estudios han usado SPIO como agente de contraste efectivo para visualizar y rastrear células trasplantadas [6, 13, 14]. Sin embargo, algunos SPIO comercialmente disponibles se han reportado que afectan las funciones normales de MSC [15,16,17]; por tanto, se han dedicado esfuerzos extensivos a desarrollar nuevos SPIOs. En el presente estudio, sintetizamos unas nanopartículas SPIO ultrasmall (USPIO) recubiertas con ácido poliacrílico (PAA) y una subsiguiente capa de metoxipolietilenglicol amina (PEG). Los nuevos USPIO-PAA/PEG muestran buena internalización celular y capacidad de rastreo MRI a largo plazo in vitro e in vivo. Además, las MSC derivadas de tejido adiposo humano (HADSCs) marcadas con USPIO-PAA/PEG mantuvieron las características biológicas, mejorando los deterioros conductuales e incrementando la inmunorreactividad TH en la substantia nigra de modelos animales de EP.

Materiales y Método

Materiales

Acetilacetonato de hierro, TREG (trietilenglicol), dietilenglicol y PEG se compraron en Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China). Bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) se compró en Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China). Medio modificado de Dulbecco's eagle (DMEM), tripsina-EDTA (0.25%) y suero fetal bovino (FBS) se compraron en Thermo Fisher Scientific. Clorhidrato de 1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida e N-Hidroxi succinimida se compraron en Sigma-Aldrich (China). N, N-Dimetilformamida, alcohol etílico absoluto y acetato de etilo se compraron en Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Agua ultrapura fue producida por sistemas de purificación de agua pura y ultrapura Millipore. Antihuman CD90-FITC, antihuman CD45-PE, antihuman CD34-FITC y antihuman CD105-PE se compraron en Biolegend.

Síntesis de USPIO

El USPIO se sintetizó por método poliol como investigación previa [18,19,20,21]. Los pasos del experimento son los siguientes: acetilacetonato de hierro 1 mmol y TREG 25 mL se mezclaron en un matraz de tres cuellos, conectado a argón, tubo condensador esférico y termómetro. Después de incubar con flujo de argón por 15 min, la mezcla se calentó a 120℃ (tasa de calentamiento 3 °C/min) y se mantuvo por 1 h, y luego la mezcla se calentóさらに a 250 °C a la misma tasa de calentamiento y se mantuvo por 30 min. La mezcla de reacción se enfrió naturalmente a temperatura ambiente, se diluyó con 2 mL de alcohol etílico absoluto, seguido de precipitación con acetato de etilo. El sedimento se recogió por centrifugación a 8000 rpm por 20 min y luego se resuspendió en alcohol etílico absoluto. El USPIO se almacenó en alcohol etílico absoluto a 4 °C para uso posterior.

Preparación de USPIO Recubierto con PAA/PEG

El USPIO-PAA se adquirió según un reporte previo [22]. En detalle, ácido poliacrílico (PAA) 1.5 g se disolvió en 24 mL de dietilenglicol. Después de un flujo de argón de 5 min, la mezcla se calentó a 110 °C y se mantuvo hasta que la solución quedó clara. La solución dispersante en etanol que contenía 28 mg de USPIO preparada en el paso previo se agregó a la solución clarificada anterior después de dispersión ultrasónica. La solución se calentó finalmente a 210 °C a una tasa de 3 °C/min. La reacción se detuvo después de 2 h de reflujo y se enfrió naturalmente a temperatura ambiente. Después de enfriar, se agregó acetato de etilo a la solución de reacción para precipitar los NPs USPIO y luego se centrifugó a 8000 rpm por 20 min para remover el sobrenadante. El precipitado se dispersó luego en etanol, seguido de precipitación con acetato de etilo. Después de los procedimientos de lavado por tres veces, el USPIO-PAA se dispersó en agua ultrapura para uso posterior. Para mejorar la biocompatibilidad, vinculamos además PEG a la superficie de nanopartículas por amidación mediada por EDC y NHS [23]. 0.45 g de PEG se disolvió en 5 ml agua ultrapura y se agregó a la dispersión de 15 ml USPIO-PAA (contiene 35 mg Fe) suplementada con 20 mg EDC y 12 mg NHS. La mezcla se agitó mecánicamente a temperatura ambiente por 2 h, y luego se agregó 10 ml solvente DMF, removiendo agua a 40℃ en aparato de evaporación rotatoria. Finalmente, 40 mg DEC y 24 mg NHS se agregaron a la mezcla, mezclando a temperatura ambiente por 48 h. La solución de reacción se transfirió a una bolsa de diálisis en agua ultrapura por 72 h, durante las cuales el agua ultrapura se reemplazó cada 12 h. La mezcla se transfirió además a un tubo de ultrafiltración para recoger moléculas con Mr > 30 kD por centrifugación a 4000 rpm por 10 min. El producto final se disolvió en agua ultrapura y se almacenó a 4 °C. En algunos casos, SPIO-PAA/PEG disolviendo en agua se recogió por centrifugación con tubo de centrífuga de ultrafiltración (> 30 KD tamaño de poro, Millipore), y los pellets se secaron en horno de vacío para experimento posterior.

Caracterización de NPs

El tamaño de partícula, distribución de tamaño y morfología de las muestras se analizaron por TEM. La capa de recubrimiento se midió por tinción negativa. Después de dispersión ultrasónica, los USPIO-PAA y USPIO-PAA/PEG en solución acuosa se agregaron a la red de cobre de malla 300 de membrana de soporte de carbono, se secaron naturalmente y luego se pusieron en un microscopio electrónico de proyección (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) para observación.

El análisis de espectroscopía infrarroja se realizó en Espectrómetro FTIR Agilent Technologies Cary 600 Series, donde el polvo de muestra seco se agrega directamente al tanque de muestra para detección.

El contenido de Fe en dispersión USPIO-PAA/PEG se determinó por espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS), cuyo modelo es PerkinElmer Analyst 700. Primero, se configuró solución estándar de hierro de 1, 2, 3, 4 y 5 μg/mL para dibujar la curva estándar, y luego 100 μL de solución de dispersión USPIO-PAA o USPIO-PAA/PEG se disolvió con ácido nítrico, y el contenido de hierro se determinó en un matraz aforado de 50 mL.

La imagen de resonancia magnética de las nanopartículas se realizó en escáneres clínicos con campo magnético de 3 T en el departamento de imágenes del primer hospital afiliado de la Universidad de Soochow. Las nanopartículas se dispersaron en solución de gel de agarosa 1% según la concentración correspondiente. Después de que la solución solidificó, el tiempo de relajación transversal de las muestras se midió por secuencia multi-eco. Exportando la adquisición de MRI en formato DICOM y luego usando el Visor DICOM RadiAnt para abrir, leer el valor de gris, importando los valores de gris de diferentes tiempos de eco en origin para ajuste, se obtuvieron los valores de tiempo de relajación transversal de dispersiones USPIO con diferentes concentraciones; finalmente, la tasa de relajación transversal r2 de muestras USPIO-PAA y USPIO-PAA/PEG se obtuvo por ajuste lineal con la tasa de relajación transversal de 1/T2 y la concentración de Fe de las muestras. Los bucles de histéresis magnética de USPIO-PAA y USPIO-PAA/PEG se adquirieron usando dispositivo Quantum Design DynaCool-9 en Universidad de Ciencia y Tecnología de Suzhou según métodos descritos previamente [24].

Aislamiento e Identificación de HADSCs

Todos los estudios se hicieron de acuerdo con los 'Principios Rectores Éticos sobre Investigación de Células Madre Embrionarias Humanas' (del Ministerio de Ciencia y Tecnología y el Ministerio de Salud, República Popular China, 2003) y Declaración de Helsinki. Las muestras de tejido adiposo se obtuvieron con consentimiento informado y aprobación ética del primer hospital afiliado de la Universidad de Soochow. El tejido adiposo se lavó y cortó en trozos pequeños después de remover vasos sanguíneos y tejido conectivo bajo un microscopio anatómico. Los bloques se digirieron con colagenasa tipo I (0.3 pzu/mL) a 37 °C por 30 min, seguido de centrifugación a 500g por 10 min. El pellet celular se suspendió con DMEM + 10% FBS y se sembró a densidad de 8 × 10⁴/cm². Después de 48 h, el medio viejo que contenía células flotantes se descartó y se reemplazó con medio fresco.

Las HADSCs se caracterizaron por citometría de flujo para marcadores de superficie que etiquetan específicamente mesenquimales (CD90 y CD105) y hematopoyéticas (CD34 y CD45) células madre. Un total de 1 × 10⁵ células se cosecharon e incubaron con anticuerpos monoclonales antihumanos contra CD34, CD45, CD90 y CD105 conjugados con PE, FITC, APC/cy7 o PerCP y controles de isotipo apropiados. Las células teñidas se analizaron usando un citómetro de flujo (LSRFortessa, BD, USA), y los datos se analizaron usando software FlowJo. Cuatro fenotipos de CD90+, CD105+, CD34− y CD45− se seleccionaron para los marcadores de superficie de HADSCs. Los niveles de expresión de marcadores de superficie celular se identificaron por citometría de flujo (BD LSRFortessa).

La diferenciación adipogénica y osteogénica de HADSCs se evaluó por tinción Oil Red O y Alizarin Red, respectivamente. Las HADSCs se cultivaron con medio de diferenciación adipogénica MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) o Kit de Diferenciación Osteogénica OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Para diferenciación adipogénica de HADSCs, las células se evaluaron en día 14 por tinción cualitativa Oil Red O para adipocitos maduros llenos de lípidos (VivaCell Biosciences, C37A00150). Para diferenciación osteogénica de HADSCs, las células se evaluaron en día 21 por tinción Alizarin Red para nódulos de calcio en osteocitos maduros (VivaCell Biosciences, C37C00150). Las imágenes se adquirieron usando un microscopio invertido Nexcope.

Captación Celular In Vitro de USPIO-PAA/PEG y Evaluación de Biocompatibilidad

Las HADSCs se sembraron en una placa de 6 pozos con densidad de 1 × 10⁶ por pozo. Las células se incubaron con medio conteniendo USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL y 0.1 μg/mL) por 2 hs, y se tiñeron con tinción de azul de Prusia (PB) para identificación de Fe intracelular.

La biocompatibilidad de USPIO-PAA/PEG se determinó por colorimetría MTT y ensayo de incorporación de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) (kit de proliferación EdU, Thermo). Para MTT, las HADSCs se sembraron en una placa de 96 pozos a densidad de 5 × 10³ por pozo e incubaron con diferentes concentraciones (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) de USPIO-PAA/PEG 24 h, 48 h o 72 h. 20 μl de solución MTT (5 mg/mL) se agregaron a cada pozo por 4 h, seguido de 150 μL de dimetil sulfóxido para disolver los cristales. El valor de absorbancia de cada pozo se midió a OD 570 nm usando instrumento marcado con enzima (BioTek Synergy HT). Para ensayo EdU, las HADSCs se incubaron con SPIO-PAA/PEG a 160 Fe μg/mL por 72 h, seguido de incubación con 10 μM EdU por 24 h. Las células se recogieron, fijaron con 4% paraformaldehído y neutralizaron con 2 mg/mL glicina. Después de permeabilización, las células se incubaron con la solución de tinte (complejo Azide 647), las tasas de incorporación EdU se evaluaron por citometría de flujo.

Modelo EP Inducido por 6-OHDA

Quince-veinte ratas Wistar macho (grado SPF, pesando 220 ± 20 g) se usaron para rastreo in vivo de HADSCs marcadas con USPIO-PAA/PEG en animales EP. Todos los procedimientos se realizaron según Regulaciones en China (Regulaciones para la administración de asuntos concernientes a animales experimentales, 2017) y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Academia China de Ciencias. Durante todo el proceso, los animales se alojaron bajo iluminación controlada (ciclo luz/oscuridad 12/12-h, "encendido" a las 7 a.m.) con acceso ad libitum a comida y agua. El modelo EP se preparó por inyección de 2 puntos de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA) en el estriado unilateral de ratas. Como se describió previamente [25, 26], las ratas se inyectaron estereotáxicamente con 3 μL de solución 6-OHDA (5 μg/μL) en 2 coordenadas (AP: 1.2 mm, ML: 2.2 mm, DV: − 4.0 a 6.0 mm; y AP: − 1.0 mm, ML: 4.4 mm, DV: − 4.5 a 6.5 mm), respectivamente. Pruebas de rotación inducida por apomorfina (0.5 mg/kg, subcutáneamente) se usaron para probar la validez de modelos EP. Las ratas se inyectaron con apomorfina (0.5 mg/kg) subcutáneamente a 1, 2 y 3 semanas siguiendo tratamiento 6-OHDA, y las puntuaciones de rotación se evaluaron por 30 min en campo abierto. El modelo EP tiene más de 7 rotaciones por min inducidas por apomorfina y se consideró exitoso.

Trasplante Celular e Imagen MRI In Vivo

Las HADCs se incubaron con USPIO-PAA/PEG (concentración de hierro 10 μg/mL) por 2 h cuando alcanzaron 80% de confluencia. 3 semanas después de preparación del modelo EP, 3 × 10⁶ de HADCs marcadas con USPIO-PAA/PEG o salina se inyectaron en el estriado izquierdo de modelos de rata EP en la siguiente coordenada (AP: 1.2 mm, ML: 2.2 mm, DV: − 4.0 a 6.0 mm). Los animales que recibieron trasplante fueron administrados con buprenorfina (0.5 mg/kg) inmediatamente después de cirugía y por 2 días después. Estos animales fueron sometidos a pruebas de rotación inducida por apomorfina a 1, 2 o 3 semanas después de la cirugía de trasplante.

Para MRI in vivo, los animales se imaginaron usando un sistema de imagen de animales pequeños (IVIS) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) en los días 3, 9, 15 y 21 siguientes a la inyección de salina o HADSCs.

Análisis Histológico

Los cerebros de los modelos de rata restantes se cosecharon y seccionaron a un espesor de 30 μm para análisis 3 semanas post-trasplante de células madre (n = 5 por grupo). Las secciones se incubaron con anti-tirosina hidroxilasa (TH, abcam, Inglaterra) y se visualizaron con anticuerpo anti-conejo donkey conjugado con Alexa-594 (Abcam). DAPI se usó para contraste de núcleos. Las imágenes se capturaron usando microscopio confocal Leica TCS SP5.

Análisis Estadístico

Los datos numéricos se expresaron como media ± DE. Los datos se sometieron a pruebas t de Student de 2 colas o ANOVA de una vía usando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) para evaluar la diferencia. * indica p < 0.05 e NS indica diferencia no significativa.

Resultados

Síntesis y Caracterización de Nanopartículas

El diseño experimental se muestra en la Fig. 1. Los NPs USPIO hidrofóbicos se prepararon usando el método de descomposición térmica. Como se muestra en la Fig. 2a–c, el diámetro de los NPs USPIO originales fue 4.07 ± 0.57 nm; al recubrir con PAA, el diámetro de NPs USPIO-PAA aumentó a 6.34 ± 0.54 nm; una modificación adicional de los NPs con PEG hace que el diámetro de NPs USPIO-PAA/PEG alcance 10.07 ± 0.55 nm. Las tres nanopartículas eran esféricas en forma y dispersadas uniformemente. El análisis estadístico mostró que había diferencia significativa (F = 10, **p < 0.01, ##p < 0.01) entre los diámetros de NPs USPIO, USPIO-PAA y USPIO-PAA/PEG, indicando una modificación exitosa con PAA y PEG (Fig. 2d).

Nanopartículas de Óxido de Hierro Superparamagnético Ultrasmall para Rastreo de Células Madre en Terapia de Parkinson

Usando el método de absorción infrarroja, encontramos que USPIO-PAA tiene un pico de absorción de carbonilo obvio a 1728 cm⁻¹ debido al pico de vibración de estiramiento de carbonilo en la molécula PAA; USPIO-PAA/PEG tiene un pico de vibración de flexión en plano de enlace carbono-nitrógeno a 1595 cm⁻¹ y un pico de vibración de estiramiento de grupo hidroxilo a 3440 cm⁻¹ (Fig. 2e). Todos estos datos confirmaron además que moléculas PAA o PEG se han modificado exitosamente a la superficie de NPs.

USPIO-PAA/PEG Mostró Buena Respuesta Magnética In Vitro y Biocompatibilidad con HADSC

La capacidad de imagen in vitro de USPIO-PAA y USPIO-PAA/PEG se evaluó por los valores de escala de grises de imágenes MRI a diferentes concentraciones (equivalentes a concentraciones de Fe). Después del ajuste, se obtuvieron los valores de tiempo de relajación transversal de las dispersiones a diferentes concentraciones. Estableciendo la tasa de relajación transversal de 1/T2 como coordenada vertical y la concentración de Fe como coordenada horizontal, la tasa de relajación transversal de USPIO-PAA se calculó como 107.94 s⁻¹ mm⁻¹ (Fig. 3a), y 84.65 s⁻¹ mm⁻¹ para USPIO-PAA/PEG (Fig. 3b). Ambas partículas mostraron buenas propiedades de imagen MRI. Los bucles de histéresis magnética de SPIO-PAA y SPIO-PAA/PEG mostraron que el valor de magnetización de saturación de SPIO-PAA es 57 emu/g arriba de 10,000 Oe (Fig. 3c), y el de SPIO-PAA/PEG es 40 emu/g arriba de 10,000 Oe (Fig. 3d). La fuerza coercitiva y remanencia estuvieron cerca de cero (Fig. 3c, d), indicando además que tanto SPIO-PAA como SPIO-PAA/PEG eran superparamagnetismo.

Al incubar NPs USPIO-PAA/PEG con HADSCs por diferentes tiempos, encontramos que NPs USPIO-PAA/PEG no tiene efectos significativos en la supervivencia de células (p > 0.05). La viabilidad celular de HADSCs permanece por encima del 96% cuando la concentración equivalente de Fe varió de 0 a 160 μg/mL. Además, el aumento del tiempo de incubación (de 24 a 72 h) no induce pérdida celular significativa en cada concentración de Fe (Fig. 4a). Una observación similar se obtuvo cuando NPs USPIO-PAA/PEG se incubaron con iPSCs a diferentes concentraciones (Fig. 4b). Aunque HADSCs fueron tratadas con 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG por 72 h, la capacidad de proliferación, indicada por tasas de incorporación EdU, no se vio afectada por la presencia de USPIO-PAA/PEG (Fig. 4c). Todos estos datos indicaron la bioseguridad de los NPs USPIO-PAA/PEG sintetizados.

Para identificar si las células podían ser marcadas efectivamente por NPs USPIO-PAA/PEG, incubamos HADSCs con NPs USPIO-PAA/PEG a Fe equivalente 10 μg/mL o 0.1 μg/mL por 2 h. Como se muestra en la Fig. 4d, un gran número de NPs teñidas de azul se observaron en casi 100% de HADSCs en presencia de USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL). Aunque la dosis de USPIO-PAA/PEG se redujo a 0.1 μg Fe/ml, aún observamos tinción PB bastante uniforme y dispersa en casi todas las HADSC. Comparado con algunos otros SPIOs reportados [14, 27, 28], USPIO-PAA/PEG exhibió alta eficiencia de captación celular.

Rastreo a Largo Plazo de HADSCs Marcadas con NPs USPIO-PAA/PEG en Modelos de Rata EP

HADSCs marcadas con NPs USPIO-PAA/PEG fueron trasplantadas al estriado izquierdo de modelo de rata EP por inyección estereotáxica. Como se muestra en la Fig. 5, observamos una señal MRI clara en el estriado izquierdo 3 días después del trasplante de HADSC, indicando un rastreo in vivo adecuado de las células trasplantadas. Una observación dinámica en D3, D9, D15 y D21 después del trasplante mostró que las células trasplantadas con marcado NP pudieron ser rastreadas claramente hasta 3 semanas, y las señales MRI no mostraron reducción obvia durante el proceso. Estos resultados indican que las nanopartículas sintetizadas tienen buen potencial para el rastreo in vivo de células trasplantadas.

HADSCs Marcadas con NPs USPIO-PAA/PEG Exhibieron Efectos Terapéuticos en Modelo EP

Para evaluar si HADSCs marcadas con NPs exhibieron efectos terapéuticos, primero realizamos una caracterización fenotípica de las HADSCs aisladas. Como se muestra en la Fig. 6a, las HADSCs cultivadas eran células en forma de huso. El análisis de citometría de flujo mostró que las HADSCs expresaban altamente marcadores para células mesenquimales, como CD90 (> 99%) y CD105 (> 99%), mientras que pocas de ellas expresaban marcadores hematopoyéticos como CD34 y CD45 (Fig. 6b–g). Las HADSCs podían diferenciar hacia linajes adipogénicos u osteogénicos bajo ciertas condiciones, y la capacidad de diferenciación se mostró por tinción Oil Red O o Alizarin Red, respectivamente (Fig. 5h). Nótese las gotas de lípidos o nódulos calcificados en HADSCs diferenciadas, mientras que no hay tal estructura en células control HEK293 (Fig. 6h). Todo esto indica que HADSCs cumplen los criterios de células mesenquimales.

Las rotaciones inducidas por apomorfina fueron 17.1 ± 1.79, 28.7 ± 1.77 y 31.86 ± 1.72 por min en la 1ra, 2da y 3ra semanas después de inyección 6-OHDA, confirmando el establecimiento exitoso del modelo de rata EP. Como se muestra en la Fig. 7, los números de rotación de modelos de rata EP se redujeron a 32.59 ± 1.12, 31.85 ± 1.98 y 31.54 ± 1.73 en la 1ra, 2da y 3ra semanas seguidas por trasplante de HADSCs marcadas con NPs en el estriado del lado de la lesión. El análisis estadístico reveló diferencia significativa entre los grupos administrados con salina y HADSC desde la 2da semana después de la cirugía de trasplante (p < 0.01 en 2da semana, p < 0.01 en 3ra semana; n = 5 en cada grupo), indicando que HADSCs marcadas con NPs mejoran los deterioros conductuales en modelos EP.

La EP se caracteriza por la pérdida de neuronas que expresan tirosina hidroxilasa (TH) en la substantia nigra. Usando inmunotinción contra TH, encontramos que 6-OHDA reduce las neuronas que expresan TH en la substantia nigra, y el trasplante con HADSCs en el estriado de modelos de rata EP podría aliviar tal reducción (Fig. 8). Combinado con la observación de que el trasplante celular alivia los deterioros conductuales de ratas EP, concluimos que HADSCs marcadas con NPs USPIO-PAA/PEG ejercen efectos terapéuticos en modelos de rata EP.

Discusión

La terapia celular es una estrategia prometedora para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y ha estado en el borde de la investigación preclínica durante los últimos 20 años [29, 30]. Rastrear las células trasplantadas es una parte indispensable para la clarificación de mecanismos subyacentes así como la evaluación de efectos clínicos; sin embargo, es desafiante y en cierta medida, obstaculizó la aplicación de terapia celular [31, 32]. Tomografía computarizada (CT), imagen de fluorescencia infrarroja cercana (NIFI) y MRI son los métodos más comúnmente usados para rastreo in vivo de células trasplantadas [31, 32]. Comparado con la radiación bastante alta de CT y baja sensibilidad de NIFI, MRI muestra buena imagen de tejido profundo, alto contraste y baja radiación ionizante, haciéndola una buena candidata para rastreo in vivo [33,34,35,36]. El desarrollo de trazadores adecuados para MRI se vuelve pues una parte indispensable para promover la aplicación de terapia celular.

SPIO es una estrategia de marcado simple y confiable para visualización MRI. Para lograr rastreo in vivo a largo plazo de células trasplantadas, las partículas SPIO requieren tener un tamaño ultrasmall y uniforme, ya que partículas grandes pueden llevar a distribución desigual de trazadores e interferir con la circulación sanguínea normal [33]. Además, la eficiencia de internalización y biocompatibilidad de nanopartículas son otro índice importante para evaluar trazadores. Las nanopartículas usualmente entran en células a través de endocitosis de fase líquida [37], endocitosis mediada por receptores [38] y fagocitosis [39]. Para lograr mejor captación celular, las partículas SPIO usualmente se modifican con ligandos intermedios [18, 40, 41].

Además del rastreo celular, SPIO también se ha aplicado para administración de fármacos [42]. La distribución tisular y clearance farmacocinético son índices importantes para ambas aplicaciones. Comparado con NPs-PAA, NPs-PAA/PEG mostró mayor tiempo de retención en sangre y clearance urinario más lento [43]. NPs densamente recubiertas con PEG proporcionan distribución mucho más uniforme sobre superficies epiteliales mucosas, incluyendo tracto gastrointestinal [44], sistema respiratorio [45, 46] y tumor cerebral [42], etc. Además, el recubrimiento PEG reduce la adherencia de proteínas y formación de corona, lo que a su vez podría promover distribución uniforme de NPs a costa de captación reducida [47]. Como herramienta potencial buena de diagnóstico y terapia, la capacidad de marcado de SPIO-PAA/PEG a MSCs y su aplicación adicional en trastornos cerebrales como EP no han sido bien estudiados, y el presente estudio fue diseñado para responder esta pregunta. En el presente estudio, sintetizamos unas nanopartículas USPIO-PAA/PEG novedosas ultrasmall, modificando los núcleos SPIO con ligandos PAA y PEG, respectivamente. Los NPs USPIO-PAA/PEG tienen diámetro ultrasmall uniforme (10.07 ± 0.55 nm), buena dispersión en solución acuosa, biocompatibilidad con varios tipos de células así como buena respuesta magnética in vitro e in vivo. Importantemente, las señales de HADSCs marcadas pudieron ser detectadas claramente bajo MRI después de trasplante cerebral por hasta tres semanas, indicando buen potencial para aplicación clínica.

La EP se caracteriza por una pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra, y por la deficiencia de niveles dopaminérgicos en las redes dopaminérgicas [1]; la más afectada es la vía nigroestriatal incluyendo el estriado. En el presente estudio, trasplantamos HADSCs marcadas con USPIO-PAA/PEG en el estriado de modelos de rata EP, y encontramos que tal trasplante mejoró los deterioros conductuales; además, atenuó la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra en cierta medida. Similarmente, Ardeshir et al. reportaron que trasplantar MSCs derivadas de tejidos adiposos de rata atenuó rotaciones inducidas por apomorfina en modelos EP [48]. Diferente de trasplantar tejidos mesencefálicos fetales [49] o progenitores neuronales dopaminérgicos [50], HADSCs ejerce sus efectos terapéuticos principalmente a través de efectos paracrinos [51, 52], en lugar de sustituir tejidos dañados. Estudios han mostrado que MSCs actúan como promotores de inmunomodulación, neuroprotección y diferenciación neuronal, y estos efectos son esencialmente mediados por el secretoma liberado por MSCs [6, 7, 51]. Nuestro resultado es consistente con estas observaciones; además, indica que los nuevos trazadores USPIO-PAA/PEG no interfirieron con los efectos de neuroprotección de HADSCs.

Conclusiones

Hemos desarrollado unos trazadores USPIO-PAA/PEG novedosos mostrando alta eficiencia de captación celular, excelente biocompatibilidad y capacidades de rastreo MRI a largo plazo. Las HADSCs marcadas con USPIO-PAA/PEG pudieron ser rastreadas con MRI por 3 semanas después del trasplante celular. Además, las HADSCs marcadas atenuaron significativamente los deterioros conductuales de modelos EP, e incrementaron el número de neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra. El desarrollo de trazador USPIO-PAA/PEG puede proporcionar una herramienta prometedora en investigación y aplicación de células madre.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos que apoyan las conclusiones de este artículo están incluidos dentro del artículo.

Abreviaturas

SPIO:: Óxido de hierro superparamagnético pequeño
USPIO:: Óxido de hierro superparamagnético ultrasmall
PAA:: Ácido poliacrílico
PEG:: Metoxipolietilenglicol amina
HADSCs:: Células madre derivadas de tejido adiposo humano
USPIO-PAA/PEG:: Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético ultrasmall recubiertas con ácido poliacrílico y metoxipolietilenglicol amina
6-OHDA:: 6-Hidroxidopamina
CT:: Tomografía computarizada
NIFI:: Imagen de fluorescencia infrarroja cercana
MRI:: Imagen de resonancia magnética
TH:: Tirosina hidroxilasa
TEM:: Microscopio electrónico de transmisión

Optimización de Hipertermia Desencadenada por NIR con Nanopartículas Cs<sub>0.33</sub>WO<sub>3</sub> para Tratamiento de Cáncer Hepático HepG2 Optimización del Espesor de Capa Guía de Luz de Zafiro para Mejorar Eficiencia de Extracción de Luz en UV-LED

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

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