Síntesis de nanopartículas de SPIO y las aplicaciones posteriores en el etiquetado de células madre para la enfermedad de Parkinson

Materiales y método

Materiales

El acetilacetonato de hierro, TREG (trietilenglicol), dietilenglicol y PEG se adquirieron de Aladdin Industrial Corporation (shanghai, China). El bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio (MTT) se adquirió de Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China). El medio águila modificado de Dulbecco (DMEM), la tripsina-EDTA (0,25%) y el suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida y N-hidroxisuccinimida se adquirieron de Sigma-Aldrich (China). Se adquirieron N, N-dimetilformamida, alcohol etílico absoluto y acetato de etilo de Sinopharm Chemical Reagent Corporation. El agua ultrapura fue producida por los sistemas de purificación de agua pura y ultrapura de Millipore. CD90-FITC antihumano, CD45-PE antihumano, CD34-FITC antihumano y CD105-PE antihumano se adquirieron de Biolegend.

Síntesis de USPIO

El USPIO fue sintetizado por el método de poliol como investigación anterior [18, 19, 20, 21]. Los pasos del experimento son los siguientes:se mezclaron acetilacetonato de hierro 1 mmol y TREG 25 ml en un matraz de tres bocas, que se conectó al argón, al tubo de condensación esférico y al termómetro. Después de incubar con flujo de argón durante 15 min, la mezcla se calentó a 120 ° C (la velocidad de calentamiento es de 3 ° C / min) y se mantuvo durante 1 h, y luego la mezcla se calentó más a 250 ° C a la misma velocidad de calentamiento y se mantuvo durante 30 min. La mezcla de reacción se enfrió de forma natural a temperatura ambiente, se diluyó con 2 ml de alcohol etílico absoluto, seguido de precipitación con acetato de etilo. El sedimento se recogió por centrifugación a 8000 rpm durante 20 min y luego se resuspendió en alcohol etílico absoluto. El USPIO se almacenó en alcohol etílico absoluto a 4 ° C para su uso posterior.

Preparación de USPIO recubierto de PAA / PEG

El USPIO-PAA se adquirió de acuerdo con un informe anterior [22]. En detalle, se disolvieron 1,5 g de ácido poliacrílico (PAA) en 24 ml de dietilenglicol. Después de un flujo de argón de 5 min, la mezcla se calentó a 110ºC y se mantuvo hasta que la solución se volvió pelúcida. La solución de dispersión de etanol que contiene 28 mg de USPIO preparada en el paso anterior se añadió a la solución clarificada anterior después de la dispersión ultrasónica. La solución se calentó finalmente a 210 ° C a una velocidad de 3 ° C / min. La reacción se detuvo después de 2 h de reflujo y se enfrió naturalmente a temperatura ambiente. Después de enfriar, se añadió acetato de etilo a la solución de reacción para precipitar las NP de USPIO y luego se centrifugó a 8000 rpm durante 20 min para eliminar el sobrenadante. A continuación, el precipitado se dispersó en etanol, seguido de precipitación con acetato de etilo. Después de los procedimientos de lavado tres veces, el USPIO-PAA se dispersó en agua ultrapura para su uso posterior. Con el fin de mejorar la biocompatibilidad, vinculamos aún más el PEG a la superficie de las nanopartículas mediante la amidación mediada por EDC y NHS [23]. Se disolvieron 0,45 g de PEG en 5 ml de agua ultrapura y se añadieron a la dispersión de USPIO-PAA de 15 ml (contiene 35 mg de Fe) suplementada con 20 mg de EDC y 12 mg de NHS. La mezcla se agitó mecánicamente a temperatura ambiente durante 2 h, y luego se añadieron 10 ml de disolvente DMF, eliminando el agua a 40ºC en el aparato de evaporación rotatoria. Finalmente, se agregaron a la mezcla 40 mg de DEC y 24 mg de NHS, mezclando a temperatura ambiente durante 48 h. La solución de reacción se transfirió a una bolsa de diálisis en agua ultrapura durante 72 h, durante las cuales se reemplazó el agua ultrapura cada 12 h. La mezcla se transfirió adicionalmente a un tubo de ultrafiltración para recoger moléculas con una Mr> 30 kD mediante centrifugación a 4000 rpm durante 10 min. El producto final se disolvió en agua ultrapura y se almacenó a 4 ° C. En algunos casos, la disolución de SPIO-PAA / PEG en agua se recogió mediante centrifugación con un tubo de centrífuga de ultrafiltración (tamaño de poro> 30 KD, Millipore), y los sedimentos se secaron en un horno de vacío para experimentos adicionales.

Caracterización de NP

El tamaño de partícula, la distribución del tamaño y la morfología de las muestras se analizaron mediante TEM. La capa de revestimiento se midió mediante tinción negativa. Después de la dispersión ultrasónica, el USPIO-PAA y el USPIO-PAA / PEG en solución acuosa se agregaron a la red de cobre de la membrana de soporte de carbono de malla 300, se secaron naturalmente y luego se colocaron en un microscopio electrónico de proyección (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) para observación.

El análisis de espectroscopía infrarroja se realiza en el espectrómetro FTIR Cary serie 600 de Agilent Technologies, donde el polvo de muestra seco se agrega directamente al tanque de muestra para su detección.

El contenido de Fe en la dispersión de USPIO-PAA / PEG se determinó mediante espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS), cuyo modelo es PerkinElmer Analyst 700. Primero, se configuró la solución estándar de hierro de 1, 2, 3, 4 y 5 μg / ml para extraer la curva estándar, y luego se disolvieron 100 μL de solución de dispersión USPIO-PAA o USPIO-PAA / PEG con ácido nítrico, y se determinó el contenido de hierro en un matraz aforado de 50 mL.

La resonancia magnética de las nanopartículas se realizó en escáneres clínicos con campo magnético de 3 T en el departamento de imágenes del primer hospital afiliado de la Universidad de Soochow. Las nanopartículas se dispersaron en una solución de gel de agarosa al 1% según la concentración correspondiente. Una vez solidificada la solución, se midió el tiempo de relajación transversal de las muestras mediante una secuencia de ecos múltiples. Exportando la adquisición de MRI en formato DICOM y luego usando RadiAnt DICOM Viewer para abrir, leer el valor de gris, importando los valores de gris de diferentes tiempos de eco en el origen para el ajuste, se obtuvieron los valores de tiempo de relajación transversal de las dispersiones USPIO con diferentes concentraciones.; finalmente, la tasa de relajación transversal r2 de las muestras de USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG se obtuvo mediante ajuste lineal con la tasa de relajación transversal de 1 / T2 y la concentración de Fe de las muestras. Los bucles de histéresis magnética de USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG se adquirieron mediante el uso del dispositivo Quantum Design DynaCool-9 en la Universidad de ciencia y tecnología de Suzhou de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [24].

Aislamiento e identificación de HADSC

Todos los estudios se realizaron de conformidad con los "Principios rectores éticos de la investigación con células madre de embriones humanos" (del Ministerio de Ciencia y Tecnología y el Ministerio de Salud de la República Popular China, 2003) y la Declaración de Helsinki. Las muestras adiposas se obtuvieron con consentimiento informado y aprobación ética del primer hospital afiliado de la Universidad de Soochow. El tejido adiposo se lavó y cortó en pequeños trozos después de extraer los vasos sanguíneos y el tejido conectivo bajo un microscopio anatómico. Los bloques se digirieron con colagenasa de tipo I (0,3 pzu / mL) a 37 ° C durante 30 min, seguido de centrifugación a 500 g durante 10 min. El sedimento celular se suspendió en DMEM + FBS al 10% y se sembró a una densidad de 8 × 10 ⁴ / cm ² . Después de 48 h, el medio viejo que contenía células flotantes se descartó y se reemplazó con medio nuevo.

Las HADSC se caracterizaron por citometría de flujo para marcadores de superficie que marcaban específicamente células madre mesenquimales (CD90 y CD105) y hematopoyéticas (CD34 y CD45). Se recolectaron un total de 1 x 105 células y se incubaron con anticuerpos conjugados con PE, FITC, APC / cy7 o PerCP contra anticuerpos monoclonales antihumanos de ratón CD34, CD45, CD90 y CD105 y controles de isotipo apropiados. Las células teñidas se analizaron con un citómetro de flujo (LSRFortessa, BD, EE. UU.) Y los datos se analizaron con el software FlowJo. Se seleccionaron cuatro fenotipos de CD90 +, CD105 +, CD34− y CD45− para los marcadores de superficie de HADSC. Los niveles de expresión de los marcadores de la superficie celular se identificaron mediante citometría de flujo (BD LSRFortessa).

La diferenciación adipogénica y osteogénica de las HADSC se evaluó mediante tinción con Oil Red O y Alizarin Red, respectivamente. Las HADSC se cultivaron con medio de diferenciación adipogénica MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) o con el kit de diferenciación osteogénica OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Para la diferenciación adipogénica de HADSC, las células se evaluaron el día 14 mediante tinción cualitativa con Oil Red O para adipocitos maduros llenos de lípidos (VivaCell Biosciences, C37A00150). Para la diferenciación osteogénica de las HADSC, las células se evaluaron el día 21 mediante tinción con rojo de alizarina en busca de nódulos de calcio en osteocitos maduros (VivaCell Biosciences, C37C00150). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Nexcope invertido.

Captación celular in vitro de USPIO-PAA / PEG y evaluación de biocompatibilidad

Las HADSC se sembraron en una placa de 6 pocillos con una densidad de 1 × 10 ⁶ por pozo. Las células se incubaron con el medio que contenía USPIO-PAA / PEG (Fe 10 μg / mL y 0,1 μg / mL) durante 2 hs y se tiñeron con azul de Prusia (PB) para la identificación intracelular de Fe.

La biocompatibilidad de USPIO-PAA / PEG se determinó mediante colorimetría MTT y ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) (kit de proliferación EdU, Thermo). Para MTT, las HADSC se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10 ³ por pocillo e incubados con diferentes concentraciones (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg / mL) de USPIO-PAA / PEG 24 h, 48 ho 72 h. Se añadieron 20 µl de solución de MTT (5 mg / ml) a cada pocillo durante 4 h, seguido de 150 µl de dimetilsulfóxido para disolver los cristales. El valor de absorbancia de cada orificio se midió a una DO 570 nm usando un instrumento marcado con enzima (BioTek Synergy HT). Para el ensayo de EdU, las HADSC se incubaron con SPIO-PAA / PEG a 160 Fe μg / mL durante 72 h, seguido de la incubación con 10 μM de EdU durante 24 h. Las células se recolectaron, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se neutralizaron con una glicina de 2 mg / mL. Después de incubar las células de permealización con la solución de tinte (complejo Azide 647), se evaluaron las tasas de incorporación de EdU mediante citometría de flujo.

Modelo de DP inducido por 6-OHDA

Se utilizaron quince a veinte ratas Wistar macho (grado SPF, con un peso de 220 ± 20 g) para el rastreo in vivo de HADSC marcadas con USPIO-PAA / PEG en animales con EP. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Regulaciones en China (Regulaciones para la administración de asuntos relacionados con animales de experimentación, 2017) y fueron aprobados por el comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Academia de Ciencias de China. En todo momento, los animales se alojaron bajo iluminación controlada (ciclo de luz / oscuridad de 12/12 h, "encendido" a las 7 a.m.) con acceso ad libitum a alimentos y agua. El modelo de PD se preparó mediante inyección en 2 puntos de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) En el cuerpo estriado unilateral de ratas. Como se describió anteriormente [25, 26], las ratas se inyectaron estereotáxicamente con 3 μL de solución de 6-OHDA (5 μg / μL) en 2 coordenadas (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:- 4,0 a 6,0 mm; y AP:- 1,0 mm, ML:4,4 mm, DV:- 4,5 a 6,5 ​​mm), respectivamente. Se utilizaron pruebas de rotación inducida por apomorfina (0,5 mg / kg, por vía subcutánea) para probar la validez de los modelos de DP. Las ratas se inyectaron con apomorfina (0,5 mg / kg) por vía subcutánea 1, 2 y 3 semanas después del tratamiento con 6-OHDA, y se evaluaron las puntuaciones de rotación durante 30 min en campo abierto. El modelo de DP tiene más de 7 rotaciones por minuto inducidas por apomorfina y se consideró exitoso.

Trasplante de células e imágenes por resonancia magnética in vivo

Las HADC se incubaron con USPIO-PAA / PEG (la concentración de hierro fue de 10 μg / mL) durante 2 h cuando alcanzaron el 80% de confluencia. 3 semanas después de la preparación del modelo de DP, 3 × 10 ⁶ de HADC marcadas con USPIO-PAA / PEG o solución salina se inyectaron en el cuerpo estriado izquierdo de modelos de rata PD en la siguiente coordenada (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:- 4,0 a 6,0 mm). A los animales que recibieron trasplante se les administró buprenorfina (0,5 mg / kg) inmediatamente después de la cirugía y durante 2 días a partir de entonces. Estos animales fueron sometidos a las pruebas de rotación inducida por apomorfina 1, 2 o 3 semanas después de la cirugía de trasplante.

Para la resonancia magnética in vivo, se obtuvieron imágenes de los animales utilizando un sistema de imágenes de animales pequeños del sistema de imágenes in vivo (IVIS) (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.) En los días 3, 9, 15 y 21 después de la inyección de solución salina o HADSC.

Análisis histológico

Los cerebros de los modelos de rata restantes se recolectaron y seccionaron hasta un grosor de 30 mm para su análisis 3 semanas después del trasplante de células madre ( n =5 por grupo). Las secciones se incubaron con anti-tirosina hidroxilasa (TH, abcam, Inglaterra) y se visualizaron con anticuerpo anti-conejo de burro conjugado con Alexa-594 (Abcam). Se utilizó DAPI para contratinción con núcleos. Las imágenes se capturaron con el microscopio confocal Leica TCS SP5.

Análisis estadístico

Los datos numéricos se expresaron como la media ± DE. Los datos se sometieron a pruebas t de Student de 2 colas o ANOVA unidireccional utilizando GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.) Para evaluar la diferencia. * indica p <0.05 y NS indica que no hay diferencia significativa.

Resultados

La síntesis y caracterización de nanopartículas

El diseño experimental se muestra en la Fig. 1. Las NPs USPIO hidrófobas se prepararon utilizando el método de descomposición térmica. Como se muestra en la Fig. 2a-c, el diámetro de las NP de USPIO originales era de 4.07 ± 0.57 nm; al recubrir con PAA, el diámetro de las NP de USPIO-PAA aumentó a 6,34 ± 0,54 nm; una modificación adicional de las NP con PEG hace que el diámetro de las NP de USPIO-PAA / PEG alcance 10,07 ± 0,55 nm. Las tres nanopartículas tenían forma esférica y estaban uniformemente dispersas. El análisis estadístico mostró que hubo una diferencia significativa ( F =10, ** p <0.01, ## p <0.01) entre los diámetros de las NP de USPIO, USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG, lo que indica una modificación exitosa con PAA y PEG (Fig. 2d).

Ilustración esquemática del diseño experimental

Caracterización de nanopartículas. a – c Imágenes TEM representativas de NP de USPIO ( a ), NP USPIO-PAA ( b ) y NP USPIO-PAA / PEG ( c ). d El análisis estadístico indicó una diferencia significativa entre el tamaño de partícula de USPIO, USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG ( n =20 por grupo). e Infrarrojos por transformada de Fourier de nanopartículas de NP de USPIO, USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG. Las flechas indican el pico de absorción específico a 1728 cm ⁻¹ debido a la modificación de PAA, 1595 cm ⁻¹ y 3440 cm ⁻¹ debido a la modificación de PEG. Los datos numéricos se presentan como media ± DE, ** p <0.01 versus los NP de USPIO, ## p <0,01 frente a los NP de USPIO-PAA / PEG. La barra representa 20 nm

Al utilizar el método de absorción de infrarrojos, encontramos que USPIO-PAA tiene un pico de absorción de carbonilo obvio a 1728 cm ⁻¹ debido al pico de vibración por estiramiento del carbonilo en la molécula de PAA; USPIO-PAA / PEG tiene un pico de vibración de flexión en el plano de enlace carbono-nitrógeno a 1595 cm ⁻¹ y un pico de vibración de estiramiento del grupo hidroxilo a 3440 cm ⁻¹ (Figura 2e). Todos estos datos confirmaron además que las moléculas de PAA o PEG se han modificado con éxito en la superficie de las NP.

USPIO-PAA / PEG mostró buena respuesta magnética in vitro y biocompatibilidad con HADSC

La capacidad de obtención de imágenes in vitro de USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG se evaluó mediante los valores de escala de grises de las imágenes de resonancia magnética a diferentes concentraciones (equivalentes a las concentraciones de Fe). Después del ajuste, se obtuvieron los valores del tiempo de relajación transversal de las dispersiones a diferentes concentraciones. Al establecer la tasa de relajación transversal de 1 / T2 como la coordenada vertical y la concentración de Fe como la coordenada horizontal, la tasa de relajación transversal de USPIO-PAA se calculó como 107,94 s ⁻¹ mm ⁻¹ (Fig. 3a) y 84,65 s ⁻¹ mm ⁻¹ para USPIO-PAA / PEG (Fig. 3b). Ambas partículas mostraron buenas propiedades de imagen por resonancia magnética. Los bucles de histéresis magnética de SPIO-PAA y SPIO-PAA / PEG mostraron que el valor de magnetización de saturación de SPIO-PAA es 57 emu / g por encima de 10,000 Oe (Fig.3c), y el de SPIO-PAA / PEG es 40 emu / g por encima de 10.000 Oe (Fig. 3d). La fuerza coercitiva y la remanencia fueron cercanas a cero (Fig. 3c, d), lo que indica además que tanto SPIO-PAA como SPIO-PAA / PEG eran superparamagnetismo.

Respuesta magnética in vitro de los NP sintetizados de USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG. un , b IRM y tasa de relajación transversal de NP de USPIO-PAA ( a ) y NP USPIO-PAA / PEG ( b ). r ₂ representa la tasa de relajación. Las tasas de relajación de los NP de USPIO-PAA y USPIO-PAA / PEG fueron 107,94 s ⁻¹ mM ⁻¹ y 84,65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d bucles de histéresis magnética de NP USPIO-PAA ( c ) y NP USPIO-PAA / PEG ( d ). La histéresis magnética se midió a 295 k (21,85 ° C) con la intensidad máxima del campo magnético 50.000 Oe (5 Telsa). Los valores de magnetización de saturación fueron cercanos a 57 emu / g para SPIO-PAA y 40 emu / g para SPIO-PAA / PEG. La histéresis de magnetización en ambas curvas fue cercana a cero

Al incubar las NP de USPIO-PAA / PEG con HADSC durante un tiempo diferente, encontramos que las NP de USPIO-PAA / PEG no tienen efectos significativos en la supervivencia de las células ( p > 0,05). La viabilidad celular de las HADSC permanece por encima del 96% cuando la concentración de Fe equivalente oscila entre 0 y 160 μg / ml. Además, el aumento del tiempo de incubación (de 24 a 72 h) no induce una pérdida celular significativa en cada concentración de Fe (Fig. 4a). Se obtuvo una observación similar cuando se incubaron NP de USPIO-PAA / PEG con iPSC a diferentes concentraciones (Fig. 4b). Aunque las HADSC se trataron con 160 μg Fe / ml de USPIO-PAA / PEG durante 72 h, la capacidad de proliferación, según lo indicado por las tasas de incorporación de EdU, no se ha visto afectada por la presencia de USPIO-PAA / PEG (Fig. 4c). Todos estos datos indicaron la bioseguridad de los NP USPIO-PAA / PEG sintetizados.

Los NP de USPIO-PAA / PEG sintetizados muestran una buena biocompatibilidad y capacidad de etiquetado. un , b Se incubaron HADSC o iPSC con NP de USPIO-PAA / PEG en concentraciones variables (equivalentes a concentraciones de Fe a 0, 10, 20, 40, 80 y 160 μg Fe / mL) durante 24, 48 y 72 h, y la viabilidad celular se determinó mediante el método MTT y se muestra en a , b , respectivamente. No hay diferencia significativa entre las viabilidades a diferentes concentraciones de NP ( n =5) o tiempo de incubación ( n =5). c El análisis de citometría de flujo mostró que las tasas de incorporación de EdU fueron similares en las HADSC incubadas en presencia o ausencia de USPIO-PAA / PEG (160 μg Fe / mL durante 72 h). Las HADSC no tratadas con EdU se sirvieron como control negativo. d USPIO-PAA / PEG a 10 μg Fe / mL y el tiempo de incubación durante 2 h dieron como resultado una eficiencia de etiquetado de casi el 100% de las HADSC, según lo evaluado por la tinción con azul de Prusia. Tenga en cuenta que USPIO-PAA / PEG a 0,1 μg de Fe / ml (tiempo de incubación de 2 h) produjo una tinción de PB ligera pero uniforme en las HADSC. Los datos numéricos se presentan como media ± DE. La barra representa 20 μm

Para identificar si las células podrían ser etiquetadas de manera efectiva por NP de USPIO-PAA / PEG, hemos incubado las HADSC con NP de USPIO-PAA / PEG a Fe equivalente a 10 μg / mL o 0.1 μg / mL durante 2 h. Como se muestra en la Fig. 4d, se observó un gran número de NP teñidas en azul en casi el 100% de las HADSC en presencia de USPIO-PAA / PEG (Fe 10 µg / ml). Aunque la dosis de USPIO-PAA / PEG se redujo a 0,1 µg Fe / ml, todavía observamos una tinción de PB bastante uniforme y dispersa en casi todas las HADSC. En comparación con algunos de los otros SPIO informados [14, 27, 28], USPIO-PAA / PEG exhibió una alta eficiencia de absorción celular.

Seguimiento a largo plazo de HADSC etiquetadas con NP de USPIO-PAA / PEG en modelos de ratas con enfermedad de Parkinson

Las HADSC marcadas con NP de USPIO-PAA / PEG se trasplantaron en el cuerpo estriado izquierdo del modelo de rata PD mediante inyección estereotáctica. Como se muestra en la Fig. 5, observamos una clara señal de resonancia magnética en el cuerpo estriado izquierdo 3 días después del trasplante de HADSC, lo que indica un seguimiento in vivo adecuado de las células trasplantadas. Una observación dinámica en D3, D9, D15 y D21 después del trasplante mostró que las células trasplantadas con marcaje NP se podían rastrear claramente hasta 3 semanas, y las señales de MRI no mostraron una reducción obvia durante el proceso. Estos resultados indican que las nanopartículas sintetizadas tienen un buen potencial para el rastreo in vivo de las células trasplantadas.

Imágenes de resonancia magnética representativas de los cerebros a los 3 días, 9 días, 15 días y 21 días seguidas de trasplante con HADSC de etiquetado USPIO-PAA / PEG o solución salina. Las imágenes de resonancia magnética de los controles correspondientes, es decir, ratas normales o modelo de rata PD inyectadas con solución salina, se mostraron en la primera y segunda filas, respectivamente. Tenga en cuenta que, en comparación con las señales negativas en el control, los cerebros de rata trasplantados con HADSC marcadas con USPIO-PAA / PEG mostraron señales de resonancia magnética claras y constantes hasta 21 días. La barra representa 5 mm

Los HADSC etiquetados con NP de USPIO-PAA / PEG mostraron efectos terapéuticos en el modelo de DP

Para evaluar si las HADSC marcadas con NP presentaban efectos terapéuticos, primero realizamos una caracterización fenotípica de las HADSC aisladas. Como se muestra en la Fig. 6a, las HADSC cultivadas eran células fusiformes. El análisis de citometría de flujo mostró que las HADSC eran marcadores altamente expresados ​​para células mesenquimales, como CD90 (> 99%) y CD105 (> 99%), mientras que pocos de ellos expresaban marcadores hematopoyéticos como CD34 y CD45 (Fig. 6b – g ). Las HADSC podían diferenciarse hacia linajes adipogénicos u osteogénicos en determinadas condiciones, y la capacidad de diferenciación se demostró mediante tinción con rojo de aceite O o rojo de alizarina, respectivamente (Fig. 5h). Obsérvense las gotitas de lípidos o los nódulos calcificados en las HADSC diferenciadas, mientras que no existe tal estructura en las células HEK293 de control (Fig. 6h). Todos estos indican que las HADSC cumplen los criterios de las células mesenquimales.

Caracterización de HADSCs. un Una imagen representativa bajo el microscopio de contraste de frase que muestra que las HADSC tienen un fenotipo típico en forma de huso. b – g Las HADSC se incubaron con anticuerpos conjugados con diferentes tintes contra marcadores CD45, CD105, CD34 y CD90 y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Los diagramas de dispersión se muestran en b, c , y los histogramas se muestran en d – g . Tenga en cuenta que la mayoría de las células se expresaron CD90 y CD105, pero no CD34 y CD45. h La diferenciación adipogénica y la diferenciación osteogénica de las células HADSC frente a las células HEK293 se evalúan mediante tinción con rojo aceite O o rojo alizarina, respectivamente. La barra representa 20 μm

Las rotaciones inducidas por apomorfina fueron 17,1 ± 1,79, 28,7 ± 1,77 y 31,86 ± 1,72 por minuto en la 1ª, 2ª y 3ª semanas después de la inyección de 6-OHDA, lo que confirma el establecimiento exitoso del modelo de PD en ratas. Como se muestra en la Fig.7, los números de rotación de los modelos de ratas con EP se redujeron a 32,59 ± 1,12, 31,85 ± 1,98 y 31,54 ± 1,73 en la 1ª, 2ª y 3ª semanas, seguidos del trasplante de HADSC marcadas con NP en el cuerpo estriado del lado de la lesión. El análisis estadístico reveló una diferencia significativa entre los grupos administrados con solución salina y con HADSC a partir de la segunda semana después de la cirugía de trasplante ( p <0.01 en la segunda semana, p <0,01 a la 3ª semana; n =5 en cada grupo), lo que indica que las HADSC etiquetadas con NP mejoran las alteraciones del comportamiento en los modelos de EP.

Los modelos de rata PD se administraron con solución salina o HADSC marcadas con USPIO-PAA / PEG en el cuerpo estriado ipsilateral afectado con 6-OHDA, y se puntuaron y compararon los números de rotación por minuto. Hay una reducción significativa de los números de rotación en la 2ª, 3ª semanas después de que las ratas con PD recibieron HADSC, en comparación con las ratas con PD correspondientes que recibieron solución salina. ns indica un cambio insignificante y ** indica p <0,01. n =5 para cada grupo

La EP se caracteriza por la pérdida de neuronas que expresan tirosina hidroxilasa (TH) en la sustancia negra. Mediante el uso de inmunotinción contra TH, encontramos que 6-OHDA reduce las neuronas que expresan TH en la sustancia negra, y el trasplante con HADSC en el cuerpo estriado de modelos de rata PD podría aliviar dicha reducción (Fig. 8). Combined with the observation that cell transplantation alleviates the behavioral impairments of PD rats, we concluded that USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs exert therapeutic effects in PD rat models.

Immunostaining against TH in the substantia nigra of the rats receiving saline (a , d , g ), PD rats receiving saline (b , e , h ) or PD rats receiving USPIO-PAA/PEG NPs-labeled HADSCs (c , f , yo ). The area in the dashed frame indicates the compact area of substantia nigra (SNc) and the ventral tegmental area (VTA). Images in the boxes of d , e , f are enlarged and shown in g , h , yo , respectivamente. There are less TH-expressing cells in the SNc and VTA regions in the rats receiving 6-OHDA injection, as compared to the controls receiving saline. Following by HADSC transplantation, more of TH-expressing cells in the SNc of PD rats could be observed. The bar represents 100 μm

Discusión

Cell therapy is a promising strategy for the treatment of neurodegenerative diseases and has been in the front edge of preclinical research over the last 20 years [29, 30]. Tracing the transplanted cells is an indispensable part for the clarification of underlying mechanisms as well as the evaluation of clinical effects; however, it is challenging and to some extent, hampered the application of cell therapy [31, 32]. Computed tomography (CT), near-infrared fluorescence imaging (NIFI) and MRI are the most commonly used methods for the in vivo tracking of transplanted cells [31, 32]. Compared to the rather high radiation of CT and low sensitivity of NIFI, MRI shows good imaging of deep tissue, high contrast and low ionizing radiation, making it a good candidate for the in vivo tracing [33,34,35,36]. The development of proper tracers for MRI therefore becomes an indispensable part of promoting the application of cell therapy.

SPIO is a simple and reliable labeling strategy for MRI visualization. To achieve long-term in vivo tracing of the transplanted cells, the SPIO particles is required to have a uniform and ultrasmall size, since large particles may lead to uneven distribution of the tracers and interfere with the normal blood circulation [33]. Moreover, the internalization efficiency and biocompatibility of nanoparticles are another important index to evaluate the tracers. Nanoparticles usually enter cells through liquid phase endocytosis [37], receptor-mediated endocytosis [38] and phagocytosis [39]. To achieve a better cellular uptake, the SPIO particles are usually modified with intermediate ligands [18, 40, 41].

Besides cell tracking, SPIO has also been applied for drug delivery [42]. The tissue distribution and pharmacokinetic clearance are important index for both applications. Compared to the NPs-PAA, NPs-PAA/PEG showed longer retention time in blood and slower urinary clearance [43]. NPs densely coated with PEG provide much more uniform distribution over mucosal epithelial surfaces, including the gastrointestinal tract [44], respiratory system [45, 46] and brain tumor [42], etc. Moreover, PEG coating reduces the attachment of proteins and formation of corona, which in turn might promote uniform distribution of the NPs at the cost of reduced uptake [47]. As a potential good diagnostic and therapeutic tool, the labeling capacity of SPIO-PAA/PEG to MSCs and its further application in brain disorders such as PD have not been well studied, and the present study was designed to answer this question. In the present study, we synthesized a novel ultrasmall USPIO-PAA/PEG nanoparticles, modifying the SPIO cores with PAA and PEG ligands, respectively. The USPIO-PAA/PEG NPs have uniform ultrasmall diameter (10.07 ± 0.55 nm), good dispersion in aqueous solution, biocompatibility with various cell types as well as good magnetic response effect in vitro and in vivo. Importantly, the signals of labeled HADSCs could be clearly detected under MRI after brain transplantation for up to three weeks, indicating the good potential for clinical application.

PD is characterized by a progressively loss of dopaminergic neurons in the substania nigra, and by the deficiency of dopaminergic levels in the dopaminergic networks [1]; the most affected one is the nigrostriatal pathway including the striatum. In the present study, we transplanted USPIO-PAA/PEG-labeled HADSCs into the striatum of PD rat models, and found that such transplantation improved the behavioral impairments; moreover, it attenuated the loss of dopaminergic neurons in the substania nigra to some extent. Similarly, Ardeshir et al. reported that transplanting the MSCs derived from rat adipose tissues attenuated apomorphine-induced rotations in PD models [48]. Different from transplanting fetal midbrain tissues [49] or dopaminergic neural progenitors [50], HADSCs exert its therapeutic effects mainly through the paracrine effects [51, 52], rather than substituting for the impaired tissues. Studies have shown that MSCs act as promoters of immunomodulation, neuroprotection and neuronal differentiation, and these effects are essentially mediated by the secretome released by MSCs [6, 7, 51]. Our result is consistent with these observations; moreover, it indicates that the novel USPIO-PAA/PEG tracers did not interfere with the neuroprotection effects of HADSCs.

Conclusiones

We have developed a novel USPIO-PAA/PEG tracers showing high cell uptake efficiency, excellent biocompatibility and long-term MRI tracing capacities. The HADSCs labeled with USPIO-PAA/PEG could be traced with MRI for 3 weeks after cell transplantation. Moreover, the labeled HADSCs significantly attenuated the behavioral impairments of PD models, and increase the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra. The development of USPIO-PAA/PEG tracer may provide a promising tool in stem cell research and application.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen en el artículo.

Abreviaturas

SPIO:

Small superparamagnetic iron oxide

USPIO:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide

PAA:

Polyacrylic acid

PEG:

Methoxypolyethylene glycol amine

HADSCs:

Human adipose-derived stem cells

USPIO-PAA/PEG:

Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles coating with the polyacrylic acid and methoxypolyethylene glycol amine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

Computed tomography

NIFI:

Near infrared fluorescence imaging

IRM:

Imágenes por resonancia magnética

TH:

Tyrosine hydroxylase

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

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