Preparación de nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA y su aplicación en el tratamiento del daño celular H9c2 inducido por LPS

Materiales y métodos

Instrumentos experimentales

Se utilizaron los siguientes:balanza electrónica JA302 (Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); evaporador rotatorio RE52CS-1 (Fábrica de instrumentos bioquímicos de Shanghai Yarong); agitador magnético de temperatura constante con pantalla digital 78HW-1 (Hangzhou Instrument Motor Co., Ltd.); secador de aire eléctrico 101-OA (Tianjin Telester instrument Co., Ltd.); Espectrómetro de infrarrojos por transformada de Fourier NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); Espectrofotómetro UV-Vis (Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); microscopía electrónica de transmisión (TEM Glacios); oscilador de baño de agua de instrumento de extracción de dispersión ultrasónica JP-010S (China Jiemeng Co., Ltd.); instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real; instrumento de etiquetado de enzimas multifunción; microscopio invertido (empresa Olympus) microscopio de fluorescencia (Leica, Heidelberg, Alemania); incubadora de celdas de dióxido de carbono (empresa Thermo).

Reactivos experimentales

Se utilizaron los siguientes:nombre del reactivo pureza / especificación / número de lote de producción (fabricante):Icariin (95% / 1 g / DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); lipopolisacárido (Modelo 055-100 g / Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.); éter monometílico de polietilenglicol (Analytical Pure / 250 g / MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); diclorometano (Analytical Pure / 500 mL / 20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-dimetilaminopiridina (Analítica pura / 100 g / L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-hidroxisuccinimida (reactivo biológico / 100 g / RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); Método FastKing de un solo paso para eliminar la primera hebra del kit premezclado de síntesis de ADNc genómico (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); kit de detección de apoptosis (Biyuntian); Kit cuantitativo de fluorescencia verde SYBR (empresa QIAGENGmbH).

Síntesis de mPEG-COOH

Se pesaron mPEG (5,00 g), anhídrido succínico (SA, 0,40 g) y 4-dimetilaminopiridina (relación molar 1:1,5 / 1,5, 0,50 g) y se colocaron en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Se añadieron cincuenta mililitros de diclorometano, se calentó a reflujo y se agitó a 60ºC durante 2 h. El diclorometano se eliminó en un evaporador rotatorio a 35 ° C durante medio día, y se obtuvo un sólido blanco, que se mantuvo a temperatura ambiente y presión atmosférica durante medio día hasta que no apareció ningún residuo de éter. El polvo se disolvió en 50 mL de agua destilada secundaria y se dializó en una bolsa de diálisis de 2 kDa durante 48 h con el agua constantemente reemplazada. Se eliminó el SA disuelto y se filtró la sustancia no disuelta. Se obtuvo mPEG carboxilado (mPEG-COOH) liofilizando el filtrado y pesando.

Síntesis de polímero mPEG-icariina

mPEG-COOH (0,37 g), N -hidroxisuccinimida (0.024 g) y 4-dimetilaminopiridina (0.026 g) se pesaron en un matraz de fondo redondo de 250 mL, y luego se agregaron 10 mL de dimetilsulfóxido deshidratado (DMSO) como solvente y se agitó a temperatura ambiente durante la mitad un día para activar el grupo carboxilo. Luego, se colocaron 100 mg de estándar de Icariin en un tubo pequeño y se agregaron 5 mL de DMSO del cual se había eliminado el agua para disolver completamente el estándar. Luego, se añadió la muestra estándar al matraz de fondo redondo y se agitó durante 48 h bajo la protección de gas nitrógeno a temperatura ambiente. Después de la diálisis continua con agua destilada secundaria, la muestra estándar no contenía DMSO y confirmamos la eliminación de DMSO mediante UV. Luego, el material dializado se liofilizó en un liofilizador al vacío durante 48 h para obtener un producto de color amarillo claro, llamado polímero mPEG-ICA.

Preparación de nanopartículas (NP) de mPEG-ICA cargadas con ICA

Se pesó mPEG-ICA (5 mg) en un tubo pequeño, se disolvió en 2 mL de DMSO y luego se agitó en agua a 37 ° C durante 5 min. Se disolvieron cinco miligramos de ICA en una cantidad adecuada de DMSO y se colocaron en un vaso de precipitados pequeño, y se añadió lentamente mPEG-ICA y se disolvió en el DMSO y se añadieron 5 ml de agua destilada. Después, la solución se agitó en un agitador magnético a temperatura ambiente durante 15 min. Luego, el reactivo se dializó en una bolsa de diálisis 3500 y se dializó en agua durante 24 h, durante las cuales el agua se cambió constantemente, el disolvente DMSO se dializó limpio y las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA se obtuvieron después de la filtración.

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

Se molieron cantidades apropiadas de polímeros estándar de ICA, mPEG-COOH y mPEG-ICA en un mortero de ágata, se mezclaron con cantidades apropiadas de polvo seco de KBr y se molieron en polvos finos. Después de presionar las tabletas, la mezcla se escaneó en un espectrómetro infrarrojo de Fourier con un rango de escaneo de 4000-4400 cm / mol ⁻¹ , y se registraron sus espectros infrarrojos. Se utilizaron ICA y mPEG-COOH para la caracterización del material, y el polímero mPEG-ICA se utilizó para la caracterización del producto.

Espectro de hidrógeno por resonancia magnética nuclear

Se disolvieron polímeros ICA, mPEG-COOH y mPEG-ICA en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) y se cargaron en el tubo de muestra, que se insertó en el rotor. Luego, la muestra se colocó en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de 500 MHz y se establecieron los parámetros de muestreo.

Espectro UV-Vis

Se añadió estándar de icariina (4,0 mg) a un matraz aforado de 25 ml, se añadió metanol a escala y luego se agitó y se disolvió hasta que se clarificó. Luego, se midieron con precisión alícuotas de 0,3 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml y 2,5 ml de solución estándar de icariina en matraces aforados de 25 ml y se añadió metanol para ajustar el volumen. A continuación, se midieron los valores de absorbancia de las soluciones en un espectrofotómetro ultravioleta a una longitud de onda de 270 nm (longitud de onda de absorción máxima), con metanol como control en blanco. Los datos se registraron para generar una regresión lineal.

El polímero mPEG-ICA (4,3 mg) se pesó con precisión en un matraz aforado de 25 ml, con metanol añadido a escala. La solución se agitó hasta que se disolvió y se clarificó. Luego, se midió con precisión una solución de muestra de 2.0 mL tres veces y se disolvió en un matraz aforado de 25 mL, con el volumen ajustado con metanol. Los valores de absorbancia de las soluciones se midieron luego en un espectrofotómetro ultravioleta a una longitud de onda de 270 nm (longitud de onda de absorción máxima), con metanol como control en blanco, y los datos se registraron tres veces, tomando el promedio. Luego, se calculó el contenido de icariin.

Las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA preparadas según el método anterior se colocaron en un matraz de 25 ml de capacidad, se añadió metanol a escala y el matraz se agitó hasta que la solución se disolvió y clarificó. Luego, se midió con precisión una solución de muestra de 2.0 mL tres veces y se disolvió en un matraz aforado de 25 mL, con el volumen ajustado con metanol. Los valores de absorbancia de las soluciones se midieron luego en un espectrofotómetro ultravioleta a una longitud de onda de 270 nm (longitud de onda de absorción máxima), con metanol como control en blanco, y los datos se registraron tres veces, tomando el promedio. Los datos se recopilaron para calcular el contenido promedio de ICA de nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA.

Caracterización de NP de mPEG-ICA cargados con ICA

Detección dinámica de dispersión de luz

Se utilizó un medidor de partículas de dispersión de luz dinámica (DLS; Zetasizer 3000hs, Malvern instruments, Malvern, Reino Unido) para medir la distribución del tamaño de partículas y el potencial de NP de mPEG-ICA cargadas con ICA. Las NP de mPEG-ICA y mPEG-ICA cargadas con mPEG-ICA recién preparadas se liofilizaron y redispersaron en agua destilada, se vertieron en una copa colorimétrica y luego se colocaron en un conjunto de muestras de analizador de tamaño de partículas de dispersión de luz dinámica para su detección. Cada muestra se analizó tres veces.

Observación de la morfología por TEM

La solución de NP de mPEG-ICA cargada con ICA (1,0 mg / ml) se dejó caer sobre una malla de cobre con una película de carbón y papel de filtro para secarla. La rejilla se colocó en el secador y se añadió ácido fosfotúngstico al 2% (p / p) y se dejó secar de forma natural durante 10 min. Luego, se observaron las características morfológicas de las NP de mPEG-ICA cargadas con ICA a un voltaje acelerado de 80 kV mediante microscopía electrónica de transmisión.

Medición de la estabilidad

Los NP de mPEG-ICA cargados con ICA preparados se liofilizaron con manitol al 5% en un liofilizador al vacío durante 48 h, y luego las nanopartículas liofilizadas se redisolvieron en agua bidestilada para detectar los cambios en el tamaño de partícula y el valor de PDI .

Determinación de la carga de fármaco y la eficacia de atrapamiento

Se midió con precisión una solución de NP de mPEG-ICA cargada con ICA de 1,8 ml en un matraz aforado de 10 ml, se añadieron 0,2 ml de DMSO y se realizó una ecografía durante 2 min. Se determinó la absorbancia de la solución a 270 nm y se utilizó como blanco el polímero mPEG-ICA con el mismo disolvente. La absorbancia de la muestra determinada se sustituyó en la ecuación de la curva estándar y se calculó el contenido de Icariina. En el DMSO / H ₂ O =1/9 sistema disolvente, la ecuación de cuasi-curva de Icariin se midió a 270 nm y se calcularon la carga de fármaco (EE%) y la eficiencia de atrapamiento (LC%) de las nanopartículas.

• Carga de fármaco (EE%) =masa de nanopartículas de fármaco / masa total de nanopartículas de carga de fármaco × 100%

• Tasa de encapsulación (LC%) =masa de fármaco en nanopartículas / dosis × 100%.

Liberación de fármacos in vitro

Se colocaron cinco mililitros de ICA libre, polímero mPEG-ICA y NP de mPEG-ICA cargados con ICA en bolsas de diálisis (3500 kDa), que se sujetaron en ambos extremos y se dializaron en 25 mL de PBS (medio de liberación) a 37 ° C y Vibración ultrasónica de 100 rpm (pH =7,4). Se eliminaron dos mililitros en períodos de tiempo predeterminados (Tn, n =0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 y 72 h) y se reemplaza con una solución nueva del mismo volumen. Se realizó espectrofotometría UV-Vis para determinar la absorbancia del dializado a 270 nm en los diferentes tiempos. La relación porcentual de liberación de ICA se calculó como se describe, y se midieron tres muestras para calcular la liberación de fármaco promedio. El contenido de dializado se determinó mediante el método de curva estándar y la prueba de liberación se repitió 3 veces in vitro.

La fórmula de liberación del fármaco es Q % =( C _n × V + V _n Σ ⁿ _{t =0} C _i ) / (W _NP × LC%), donde W es el peso de NP, LC% es la carga de fármaco de nanopartículas, C _n es la concentración de la muestra en Tn, V es el producto total del medio de liberación (25 mL), Vn es el peso de la muestra (2 mL) y C _i es T _i ( yo =0, 0.5, 1,…., n h , V ₀ = C ₀ =0).

Publicación de NP de mPEG-ICA-ICA en diferentes medios de publicación

Se colocaron dos mililitros de solución NP de mPEG-ICA cargada con ICA en una bolsa de diálisis (4-88 kDa, valor de corte de peso molecular) y se colocaron en solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 y pH 6,8 (medio de liberación de PBS, 37 ° C, 25 mL). Luego, se recolectaron 2 mL de medio de liberación para muestreo y se reemplazaron con una solución nueva del mismo volumen a intervalos predeterminados (Tn, n =0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 y 48 h). La absorbancia del dializado a 270 nm en los diferentes tiempos se determinó mediante espectrofotometría UV-Vis. Se calculó la proporción porcentual de liberación de ICA y se midieron tres muestras para calcular la liberación promedio de fármaco.

Experimento de prueba celular

H9c2 (rata H9c2), una línea de mioblastos ventriculares de rata, se adquirió del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, China. Las células se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (Gibco, EE. UU.) A 37 ° C en un CO ₂ -Ambiente que contiene. Las células H9c2 se inocularon normalmente en una placa de cultivo de 10 cm [25]. Cuando las células crecieron hasta aproximadamente el 80%, se subcultivaron con tripsina al 0,25% (Gibco). Luego, las células se sembraron en las placas de cultivo correspondientes o placas de 96 pocillos para los siguientes estudios.

Tratamiento celular con LPS o nanopartículas ICA

Las células H9c2 se dividieron en cinco grupos como sigue:(1) grupo de control:usando medio de cultivo normal, (2) grupo LPS:las células se trataron con 10 mg / L de LPS durante 24 h; (3) Grupo ICA:las células se trataron con 20 μmol / L ICA (1:1000, DMSO) y 10 mg / L LPS por la misma duración, (4) Grupo polímero mPEG-ICA:las células se trataron con 20 μmol / L de polímero de mPEG-ICA y la misma concentración final de LPS durante la misma duración; (5) Grupo mPEG-ICA NPS cargado con ICA:las células se trataron con NP de mPEG-ICA cargadas con ICA de 20 μmol / L y LPS 10 mg / L, con las otras condiciones iguales a las del grupo anterior.

MTT

La viabilidad celular de las nanopartículas de ICA contra la lesión de cardiomiocitos inducida por LPS se determinó mediante MTT. Brevemente, las células H9c2 se trataron con LPS y diferentes nanopartículas de ICA durante 24 h. Después de eso, las células se tiñeron con MTT a una concentración final de 0.5 mg / mL durante 4 ha 37 ° C y luego se agregaron 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver los cristales de tiroides. La densidad óptica se midió a 570 nm en un lector de microplacas (* / SpectraMax i3 Molecular Devices, Afganistán).

Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)

Para investigar el efecto de nano-ICA sobre el daño de H9c2 inducido por LPS, evaluamos la liberación de LDH en el medio de cultivo. Brevemente, de acuerdo con los tratamientos correspondientes durante 24 h, se recogió el medio de cultivo y se detectó LDH de acuerdo con el protocolo del LDH Detection Kit (Beyotime Biotechnology). Finalmente, el valor de DO se midió a 490 nm con un espectrómetro.

Tinción Hoechst 33,258

Se utilizó la tinción Hoechst 33.258 para observar la morfología nuclear mediante microscopía de fluorescencia. Después del tratamiento, las células H9c2 se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en tampón de paraformaldehído al 4% (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa), se aclararon con PBS y se tiñeron con Hoechst 33,258 a 37 ° C durante 15 min [26]. Después de la tinción, los aspectos morfológicos nucleares se observaron inmediatamente con un microscopio de fluorescencia (Leica, Heidelberg, Alemania). Índice de apoptosis =número de núcleos apoptóticos / núcleos totales × 100%.

Ensayo TUNEL (etiquetado terminal dUTP nick-end)

Para la detección de la integridad del ADN de las células H9c2, adoptamos la técnica TUNEL. Las células H9c2 se cultivaron en una placa de cultivo de 24 pocillos. Después del tratamiento, se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron con poliformaldehído al 4% durante 30 min [27]. Luego, se añadió Triton X-100 al 1% durante 5 min para aumentar la permeabilidad de la membrana celular. Luego, las células se tiñeron con un kit de detección en un solo paso TUNEL (Beyotime Biotechnology) de acuerdo con las instrucciones, y se observó la apoptosis celular con un microscopio de fluorescencia. La tasa de apoptosis de cada grupo se expresa como el porcentaje de núcleos fluorescentes verdes (TUNEL-positivos) con respecto a los núcleos totales (azul) (los núcleos se tiñen con DAPI) [28].

Citometría de flujo para detectar apoptosis

Para investigar más a fondo los efectos de diferentes nanopartículas de ICA en la apoptosis celular inducida por LPS, utilizamos el método de doble tinción de Anexina V-FITC / PI para analizar la tasa de apoptosis. Después del tratamiento con H9c2 como se describe anteriormente, las células se recolectaron y se resuspendieron en 195 μL de tampón de unión que contenía 10 μL de Anexina V-FITC y 5 μL de PI y luego se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de centrifugar a 1500 rpm durante 10 min a 4ºC, se aspiró el tampón de tinción y las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 100 µL de PBS. Finalmente, las muestras se midieron con un citómetro de flujo.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT – qPCR)

Se utilizó RT-qPCR para detectar los niveles de expresión de ARNm de marcadores inflamatorios, incluidos TNF-α, IL-1β e IL-6. Después de tratar las células H9c2 durante 24 h, se extrajo el ARN total con TRIzol como se describió anteriormente y se midió con un espectrofotómetro micro ultravioleta visible NanoDrop ™ One / OneC (Thermo, ND-ONEC-W, EE. UU.). El ADNc se sintetizó utilizando un kit ExScript RT y la amplificación se realizó en una máquina de PCR cuantitativa fluorescente (BIO-RAD CFX96 Touch *) con reactivo SYBR Green en las siguientes condiciones:95 ° C durante 5 min, 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s, y un total de 28 ciclos. Los cebadores utilizados en este estudio son los siguientes:

Actin ::

Adelante 5 ′ GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3 ′;

Invertir 5′-TTGATGTCACGCACGATTT-3 ′;

TNF-α ::

Adelante 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3 ′;

Invertir 5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3 ′;

IL-1β ::

Adelante 5′GGATGATGACGACCTGCTA 3 ′;

Invertir 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3 ′

IL-6 ::

Adelante 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3 ′;

Invertir 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3 ′.

La cantidad de cada gen diana se normalizó a la del gen de actina. Los experimentos se repitieron por triplicado.

Resultados y discusión

FTIR y H ¹ Espectros de RMN

A partir de los espectros mPEG-ICA, los picos de absorción de vibración por estiramiento de dos enlaces éster (–C =O–) estaban a 1700 ⁻¹ y 1740 ⁻¹ cm. En comparación con los espectros de mPEG-COOH, hubo un exceso de pico de vibración de estiramiento C =C a 1650 cm ⁻¹ , lo que indica que la síntesis de esterificación de ICA y mPEG-COOH tuvo éxito en la formación de mPEG-ICA (Fig. 1).

Espectros FTIR de mPEG-ICA ( A ), ICA ( B ) y mPEG-COOH ( C ). H ¹ Espectros de RMN de hidrógeno para mPEG-COOH y mPEG-ICA

Del espectro de hidrógeno mPEG-ICA, 12,6 ppm indica los grupos hidroxilo fenólicos ICA debido a la presencia de grupos de electrones de absorción fuerte –C =O que se mueven hacia el campo bajo. El pico de hidrógeno del anillo de benceno a aproximadamente 7,5 ppm y el área del pico de 3,5 ppm son muy grandes, juzgados como –CH ₂ –O– pico de hidrógeno en el polímero mPEG. Una gran cantidad de análisis muestra que la señal de hidrógeno de alquilo es de 0 a 2 ppm. Por tanto, se puede concluir que 1,7 ppm es el pico de hidrógeno del doble enlace en ICA. Los picos característicos de mPEG-COOH e ICA aparecen en los polímeros mPEG-ICA, lo que demuestra la síntesis exitosa de mPEG-COOH con ICA (Fig. 1).

Tamaño de partícula, potencial zeta y TEM

El tamaño medio de partícula de las nanopartículas de mPEG-ICA es de aproximadamente (145,0 ± 15,2) nm, y el valor del índice de dispersión (PDI) del polímero es (0,277 ± 0,00). El tamaño de partícula de las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA aumentó ligeramente, hasta aproximadamente (220,0 ± 13,7) nm, y el PDI fue (0,119 ± 0,00). Cuanto más pequeño es el PDI, más uniforme es la distribución de los NP de mPEG-ICA cargados con ICA. El potencial zeta de las nanopartículas de mPEG-ICA fue (0,439 ± 0,258) mV, y el potencial zeta de los NP de mPEG-ICA cargados con ICA fue (2,30 ± 1,33) mV. La microscopía electrónica de transmisión reveló que las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA eran esféricas, de morfología regular y de tamaño relativamente uniforme (Fig. 2).

Tamaño de partícula, potencial zeta y TEM de NP de mPEG-ICA cargadas con ICA

Eficiencias de encapsulación y carga de fármacos

El contenido de ICA en los NP de mPEG-ICA cargados con ICA se puede calcular mediante espectrofotometría ultravioleta. Se estableció la curva estándar de concentración de ICA y se obtuvo el contenido de ICA en el polímero calculando la concentración de fármaco basándose en la curva estándar. Según los cálculos, basados ​​en la absorbancia del polímero mPEG-ICA (1,2397 ± 0,1024), el contenido de ICA fue (0,4132 ± 0,0359) mg / mL, con la absorbancia de nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA (1,6289 ± 0,0923), y la El contenido de ICA fue (0.5496 ± 0.3234) mg / mL. Calculada de acuerdo con la fórmula del método, la carga de fármaco del polímero mPEG-ICA fue (16,5 ± 0,014)% y la tasa de encapsulación fue (41,3 ± 0,036)%; El contenido de carga de fármaco de los NP de mPEG-ICA cargados con ICA fue (21,9 ± 0,013)% y la tasa de encapsulación fue (54,9 ± 0,032)% (Tabla 1).

Determinación de estabilidad

El tamaño de partícula de las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA preparadas mediante el método de diálisis fue (220,0 ± 13,7) nm, y el PDI fue (0,119 ± 0,00). Después de liofilizar en manitol al 5% durante 48 h, las nanopartículas se pueden volver a disolver en agua para formar nanopartículas estables. El tamaño de partícula era de 255 nm y el PDI era de (0,326 ± 0,00), que era un poco más grande que el de las nanopartículas de diálisis (Fig. 3).

Estabilidad de NP de mPEG-ICA cargadas con ICA

Liberación de fármaco mPEG-ICA-ICA in vitro

En la Fig. 4, la liberación de ICA depende en gran medida del pH del medio de liberación. Dentro del medio de liberación de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, se liberó icariina libre (77,21 ± 0,15)% en 12 horas y se liberó por completo. Debido a que las NP de mPEG-ICA cargadas con fármacos icariin pueden aumentar la liberación de nanopartículas, la liberación de nanopartículas de mPE-ICA se libera a (44,08 ± 0,12)% en 72 h, y las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA alcanzaron (52,80 ± 1,70) %. Las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA se colocaron en una solución tampón de pH 6,8, y encontramos que la liberación de fármacos mediada por nanopartículas alcanzó (75,66 ± 0,17)% en 48 h. Esto se debe probablemente a que algunas NP de mPEG-ICA cargadas con ICA tenían NP despolimerizadas o moléculas de mPEG-ICA se rompen en las NP. Estas observaciones indicaron que la liberación de ICA fue más favorable en condiciones ácidas de pH 6,8. También indicó que las características de liberación de las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA eran beneficiosas para el tratamiento local de la lesión inflamatoria miocárdica, porque las lesiones locales conducen a un foco con un entorno débilmente ácido.

A Liberación de ICA de NP de mPEG-ICA cargadas con ICA en PBS a pH 7,4. B Liberación de ICA de NP de mPEG-ICA cargadas con ICA en PBS a pH 7,4 y pH 6,8 a 37 ° C in vitro

Viabilidad de las células H9C2 y liberación de lactato deshidrogenasa

Primero, para observar la citotoxicidad de las nanopartículas de mPEG-ICA cargadas con ICA, agregamos fármaco libre (ICA 20 µM), NP de mPEG-ICA y NP de mPEG-ICA cargadas con ICA a las células H9c2, y los resultados de MTT no mostraron una citotoxicidad marcada de las nanopartículas (Fig. 5). Luego, exploramos más a fondo si podrían proteger las células H9c2 contra la lesión inducida por LPS (Fig. 6). Después del tratamiento con LPS durante 24 h, la viabilidad celular se redujo a (50.0 ± 3.22)% (grupo de control 100%), donde el tratamiento con ICA, NP de mPEG-ICA y NP de mPEG-ICA cargadas con ICA aumentó significativamente la viabilidad de las células H9c2 por (55,94 ± 1,06)%, (60,97 ± 2,615)% y (65,36 ± 1,214)%, respectivamente ( P <0.05).

Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments

Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P  < 0.01 vs. con; # P  < 0.05 and, ## P  < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P  < 0.01 versus con; ##P  < 0.01 versus LPS treatment group; *&P  < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P  ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. B Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; B apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P  < 0.0001 vs. con; ###P  < 0.005 vs. LPS; &&P  < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)

A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. B . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P  < 0.01 compared with con; #P  < 0.05 compared with LPS; &P  < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS group; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P  < 0.05 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.

Disponibilidad de datos y materiales

Not applicable.

Abreviaturas

mPEG:

Polyethylene glycol monomethyl ether

ICA:

Icariin

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

NMR:

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

DLS:

Dynamic light scattering

TEM:

Transmission electron microscope

TNF:

Tumor necrosis factor

EPRs:

Permeability and retention functions

SA:

Succinic anhydride

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide

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