Nanopartículas de mPEG cargadas con icariina: protección mejorada contra cardiotoxicidad inducida por LPS en células H9c2

Resumen

La icariina (ICA), un glicósido flavonol de Epimedium, exhibe propiedades cardioprotectoras, antioxidantes y antiinflamatorias pero sufre de pobre solubilidad en agua, eliminación rápida y baja biodisponibilidad oral. Sintetizamos un conjugado hidrofilo de éter monometílico de polietilenglicol (mPEG) (mPEG-ICA) mediante esterificación mediada por anhídrido succínico, y posteriormente encapsulamos ICA libre en el polímero por diálisis para formar nanopartículas (NPs) cargadas con ICA (ICA-mPEG-ICA NPs). La espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier (FT-IR) y resonancia magnética nuclear de protón (¹H-NMR) confirmaron la conjugación exitosa. La dispersión dinámica de luz (DLS) reveló un diámetro hidrodinámico promedio de 220 ± 13,7 nm con potencial ζ de +2,30 ± 1,33 mV, mientras la microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró morfología esférica uniforme. En tampón fosfato salino (PBS) a pH 7,4, las nanopartículas liberaron 52,8 ± 1,7 % ICA en 72 h; a pH 6,8, la liberación se aceleró a 75,7 ± 0,2 % en 48 h. In vitro, las NPs preservaron la viabilidad de células H9c2, redujeron fuga de lactato deshidrogenasa (LDH) e inhibieron apoptosis inducida por lipopolisacárido (LPS). Además, los niveles de ARNm de citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 se suprimieron marcadamente. Estos resultados demuestran que las NPs ICA-mPEG-ICA ofrecen una plataforma prometedora de nanomedicina para mitigar daño miocárdico mediado por LPS.

Introducción

El remodelado cardíaco tras lesión miocárdica es impulsado principalmente por señalización inflamatoria sostenida, particularmente a través de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-18. Estas citoquinas desencadenan estrés oxidativo, activación de fibroblastos y apoptosis de cardiomiocitos, comprometiendo finalmente la función cardíaca. La icariina (C₃₃H₄₀O₁₅) ha sido extensamente reportada para ejercer efectos inmunomoduladores, antioxidantes y antiapoptóticos en modelos preclínicos, sin embargo su potencial terapéutico está limitado por hidrofobicidad, eliminación sistémica rápida y pobre absorción oral. Los sistemas de nanotransportadores —como micelas, liposomas y nanopartículas poliméricas— han emergido como estrategias efectivas para mejorar solubilidad de fármacos, extender tiempo de circulación y lograr administración dirigida a tejido cardíaco inflamado, aprovechando el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR).

El éter monometílico de polietilenglicol (mPEG) ofrece hidrofilicidad superior, biocompatibilidad e inmunogenicidad mínima comparado con PEG lineal. Al unir covalentemente ICA a mPEG-COOH mediante enlace éster, creamos un anfífilo hidrofílico-hidrofóbico capaz de autoensamblarse en nanopartículas. El enlace éster es lábil a ácido, permitiendo liberación responsiva a pH de ICA en el microambiente ligeramente ácido (pH ≈ 6,8) característico de miocardio inflamado. Este estudio detalla la síntesis de mPEG-ICA, encapsulación de ICA en nanopartículas, caracterización fisicoquímica, perfil de liberación in vitro y evaluación de eficacia cardioprotectora contra lesión inducida por LPS en células H9c2.

Materiales y métodos

Instrumentos experimentales

Instrumentos analíticos clave incluyeron balanza electrónica JA302, evaporador rotatorio RE52CS-1, agitador magnético 78HW-1, secador de aire 101-OA, espectrómetro FT-IR NEXUS670, espectrofotómetro UV-Vis, TEM Glacios, dispersor ultrasónico JP-010S, sistema qPCR tiempo real, analizador de fluorescencia enlazado a enzimas, microscopio invertido Olympus, microscopio de fluorescencia Leica, e incubadora CO₂ Thermo.

Reactivos experimentales

Reactivos de grado analítico se obtuvieron de proveedores comerciales: Icariina (95 %, 1 g, DL070208), LPS (55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me (250 g, Sigma, MKBT7172), diclorometano (500 mL, Sinopharm), 4-dimetilaminopiridina (100 g, Aladdin), N-hidroxisuccinimida (100 g, Ruiyong), kit síntesis cDNA FastKing (Tiangen), kit apoptosis Biyuntian, kit qPCR SYBR Green (QIAGEN), entre otros.

Síntesis de mPEG-COOH

mPEG (5 g), anhídrido succínico (0,40 g) y DMAP (0,50 g) reaccionaron en 50 mL diclorometano a 60 °C por 2 h bajo reflujo. La mezcla se evaporó, y el sólido blanco resultante se purificó por diálisis (CO 2 kDa) contra agua por 48 h. El producto liofilizado produjo mPEG-COOH.

Síntesis de polímero mPEG-ICA

mPEG-COOH (0,37 g) se activó con NHS (0,024 g) y DMAP (0,026 g) en 10 mL DMSO seco, luego reaccionó con 100 mg ICA (disuelto en 5 mL DMSO seco) bajo nitrógeno a temperatura ambiente por 48 h. Tras diálisis extensiva contra agua y liofilización, se obtuvo polímero mPEG-ICA.

Preparación de nanopartículas ICA-mPEG-ICA cargadas con ICA (NPs)

mPEG-ICA (5 mg) se disolvió en 2 mL DMSO y se mezcló con 5 mg ICA en DMSO, seguido de adición de 5 mL agua destilada. Tras 15 min agitación a temperatura ambiente, la mezcla se dializó (CO 3500 Da) por 24 h con cambios frecuentes de agua, luego se filtró para obtener NPs ICA-mPEG-ICA cargadas con ICA.

Espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier

Mezclas de muestras con KBr, prensadas en pastillas, y escaneadas de 4000 a 4400 cm⁻¹ para confirmar transformaciones de grupos funcionales.

Espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno

Muestras disueltas en DMSO-d₆ y analizadas en espectrómetro NMR 500 MHz para confirmar desplazamientos químicos consistentes con esterificación.

Espectro UV-Vis

Se generó curva de calibración de ICA a 270 nm; concentraciones de polímero y nanopartículas se cuantificaron usando esta curva.

Caracterización de NPs ICA-mPEG-ICA cargadas con ICA

Detección por dispersión dinámica de luz

Distribución de tamaño de partícula y potencial ζ se midieron con Zetasizer 3000hs tras liofilización y redispersión en agua; cada muestra se analizó en triplicado.

Observación de morfología por TEM

Suspensión NP 1,0 mg/mL se aplicó en rejillas de cobre recubiertas de carbono, teñidas con 2 % ácido fosfotúngstico, e imagenadas a 80 kV.

Medición de estabilidad

NPs liofilizadas con 5 % manitol, redispersadas en agua, y tamaño/PDI monitoreados para evaluar estabilidad de almacenamiento.

Determinación de carga de fármaco y eficiencia de encapsulación

Carga de fármaco (EE %) y eficiencia de encapsulación (LC %) se calcularon a partir de absorbancia UV-Vis usando fórmulas: EE = masa fármaco en NPs / masa total NPs × 100 %; LC = masa fármaco en NPs / masa fármaco inicial × 100 %.

Liberación de fármaco in vitro

NPs colocadas en 25 mL PBS (pH 7,4 o 6,8) a 37 °C con agitación 100 rpm. Muestras (2 mL) retiradas en intervalos definidos, reemplazadas con medio fresco, y analizadas por UV-Vis a 270 nm. Liberación acumulada (%) calculada usando ecuación estándar.

Experimento de prueba celular

Cardioblastos de rata H9c2 se cultivaron en DMEM + 10 % FBS a 37 °C/5 % CO₂. Células se sembraron en placas de 96 pocillos (10⁴ células/pocillo) para viabilidad, LDH, apoptosis y ensayos qPCR.

Tratamiento celular con LPS o nanopartículas ICA

Células divididas en cinco grupos: (1) control (sin tratamiento), (2) LPS (10 µg/mL) por 24 h, (3) ICA (20 µM) + LPS, (4) polímero mPEG-ICA (20 µM) + LPS, (5) NPs ICA-mPEG-ICA cargadas con ICA (20 µM) + LPS.

MTT

Tras 24 h tratamiento, se añadió 0,5 mg/mL MTT por 4 h. Formazán disuelto en DMSO y absorbancia medida a 570 nm.

Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)

Actividad LDH en sobrenadantes de cultivo cuantificada usando kit comercial; absorbancia leída a 490 nm.

Tinción Hoechst 33342

Morfología nuclear examinada tras 15 min tinción con Hoechst 33342 (1 µg/mL) e imagenada bajo microscopio de fluorescencia. Índice apoptosis = núcleos apoptóticos/núcleos totales × 100 %.

Ensayo TUNEL

Fragmentación ADN detectada usando kit TUNEL; núcleos apoptóticos contados como fluorescencia verde relativa a núcleos totales teñidos con DAPI.

Citometría de flujo para detectar apoptosis

Doble tinción Annexin V-FITC/PI realizada; poblaciones apoptóticas tempranas y tardías cuantificadas por citometría de flujo.

Reacción en cadena de polimerasa cuantitativa de transcripción reversa (RT-qPCR)

ARN extraído con TRIzol, retro-transcrito, y amplificado en sistema Bio-Rad CFX96 usando SYBR Green. Expresión génica de TNF-α, IL-1β, IL-6 y actina (housekeeping) normalizada a actina. Secuencias de cebadores listadas en manuscrito original.

Resultados y discusión

Espectros FTIR y ¹H NMR

Los espectros FT-IR mostraron absorciones características de carbonilo éster a 1700 y 1740 cm⁻¹, confirmando conjugación exitosa. ¹H-NMR reveló señales de hidroxilo fenólico a 12,6 ppm, protones aromáticos a 7,5 ppm y protones metileno de cadena PEG a 3,5 ppm, confirmando presencia de ambos moieties ICA y mPEG.

Tamaño de partícula, potencial zeta y TEM

Los NPs de polímero núcleo promediaron 145 ± 15,2 nm (PDI = 0,277), mientras NPs cargados con ICA se expandieron a 220 ± 13,7 nm (PDI = 0,119). Los potenciales zeta cambiaron de +0,44 ± 0,26 mV a +2,30 ± 1,33 mV tras carga, indicando estabilidad coloidal mejorada. Imágenes TEM confirmaron morfología esférica uniforme (Fig. 2).

Carga de fármaco y eficiencias de encapsulación

Análisis UV-Vis produjo carga de fármaco 21,9 ± 0,013 % y eficiencia de encapsulación 54,9 ± 0,032 % para NPs cargadas con ICA, superando NPs solo de polímero (carga = 16,5 %; EE = 41,3 %). Estos valores son consistentes con la carga terapéutica deseada.

Determinación de estabilidad

Tras liofilización con 5 % manitol, NPs redispersadas exhibieron aumento moderado de tamaño a 255 nm (PDI = 0,326) pero mantuvieron uniformidad aceptable, confirmando estabilidad de almacenamiento (Fig. 3).

Liberación de fármaco mPEG-ICA-ICA in vitro

En PBS pH 7,4, ICA libre liberó 77,2 % en 12 h, mientras NPs mPEG-ICA liberaron 44,1 % en 72 h. NPs cargadas con ICA liberaron 52,8 % en 72 h a pH neutro y 75,7 % en 48 h a pH 6,8, reflejando liberación acelerada responsiva a pH (Fig. 4).

Viabilidad celular H9C2 y liberación lactato deshidrogenasa

Ensayos MTT revelaron no citotoxicidad de ICA, mPEG-ICA o NPs cargadas con ICA a 20 µM. Tras exposición a LPS, viabilidad cayó a 50,0 % (control = 100 %). Tratamiento con ICA, mPEG-ICA y NPs cargadas con ICA restauró viabilidad a 55,9 %, 61,0 % y 65,4 % respectivamente (p < 0,05) (Fig. 5, 6).

Ensayos LDH mostraron aumento significativo en fuga enzimática tras tratamiento LPS; ICA, mPEG-ICA y NPs cargadas con ICA redujeron marcadamente liberación LDH, con efecto más pronunciado para NPs cargadas con ICA (Fig. 7).

Apoptosis celular inducida por LPS

Tinción Hoechst 33342 reveló condensación y fragmentación cromatín en células tratadas con LPS; NPs cargadas con ICA atenuaron significativamente morfología apoptótica (Fig. 8). Ensayo TUNEL cuantificó tasas apoptosis: LPS indujo 47,6 % apoptosis, reducida a 35,5 % (ICA), 26,5 % (mPEG-ICA) y 17,9 % (NPs cargadas con ICA). Citometría de flujo corroboró hallazgos, mostrando apoptosis total 35,9 % en LPS versus 16,7 % (NPs cargadas con ICA) y 19,2 % (mPEG-ICA) (Fig. 9-10).

ARNm citoquinas inflamatorias en células H9c2 inducidas por LPS

RT-qPCR demostró que LPS elevó marcadamente transcritos TNF-α, IL-1β e IL-6. Tratamiento con ICA, mPEG-ICA y NPs cargadas con ICA suprimieron estas citoquinas, con NPs cargadas con ICA logrando la regulación descendente más sustancial (Fig. 11).

Estos hallazgos confirman que NPs ICA-mPEG-ICA cargadas con ICA proporcionan cardioprotección mejorada al administrar ICA directamente a miocardio inflamado, reduciendo estrés oxidativo, apoptosis y producción de citoquinas inflamatorias.

Conclusión

Hemos fabricado exitosamente NPs ICA-mPEG-ICA cargadas con ICA mediante enfoque híbrido químico-físico que mejora marcadamente solubilidad ICA, capacidad de carga y liberación sostenida responsiva a pH. En células H9c2 desafiadas con LPS, estas NPs restauraron viabilidad celular, atenuaron fuga LDH, inhibieron apoptosis y suprimieron expresión de citoquinas proinflamatorias más efectivamente que ICA libre o polímero solo. Los datos respaldan el potencial de NPs ICA-mPEG-ICA cargadas como nanomedicina dirigida para tratar lesión cardíaca inflamatoria.