Síntesis Asistida por Ácido Sulfúrico de Puntos de Polímero Carbonizado Rojo Brillante para Bioimagen de Dos Fotones

Resumen

Puntos de polímero carbonizado (CPDs) de emisión roja se fabricaron a partir de solución acuosa de p-fenilendiamina (p-PD) bajo influencia catalítica de ácido sulfúrico (H₂SO₄). Los SA-CPDs resultantes (diámetro promedio ≈5 nm) exhibieron la fotoluminiscencia más brillante entre ácidos probados, con rendimiento cuántico (QY) de 21.4% en agua y 16.5% rendimiento global. La excitación a 300-580 nm consistentemente produjo emisión a 600 nm, independiente de la longitud de onda de excitación. Cálculos de funcional de densidad indican que el crecimiento transversal de precursores protonados es energéticamente favorecido, impulsando la formación de CPDs nanoescalares. La fotoluminiscencia de dos fotones, emitiendo a 602 nm bajo excitación láser femtosegundo a 850 nm, se demostró para imagen de células HeLa, destacando el potencial de SA-CPDs en aplicaciones biomédicas.

Antecedentes

Los puntos de carbono (CDs) han atraído amplio interés debido a su excelente solubilidad en agua, estabilidad óptica, baja toxicidad y síntesis rentable. Se exploran en sensores electroquímicos, bioimagen, catálisis, dispositivos emisores de luz y optoelectrónica. Rutas bottom-up desde monómeros orgánicos, polímeros o productos naturales son preferidas para producción a gran escala. Grupos funcionales como –OH, –COOH, –C=O y –NH₂ sufren deshidratación y carbonización a temperaturas elevadas para producir nanopartículas fluorescentes.

Los CDs de emisión roja son particularmente valiosos para bioimagen por su mayor penetración tisular e interferencia de fondo mínima. Sin embargo, la mayoría de CDs muestran emisión dependiente de excitación, haciendo una fuente única y estable de fotones rojos rara. Isómeros de fenilendiamina (o-, m-, p-) se han usado para generar CDs azul, verde y rojo respectivamente. Trabajos recientes identificaron los puntos basados en p-PD como puntos de polímero carbonizado (CPDs) debido a su emisión independiente de excitación.

Aquí presentamos una síntesis hidrotérmica asistida por ácido sulfúrico, de alto rendimiento y sencilla de CPDs de emisión roja y demostramos su capacidad de imagen de dos fotones en células HeLa.

Métodos

Síntesis de CPDs Rojos de Sistemas p-PD Asistidos por Ácido

Investigamos H₂SO₄, HCl y HClO₄ como donantes de protones, etiquetando los CPDs resultantes como SA-CPDs, HC-CPDs y PA-CPDs. Las variables de reacción —ratio ácido-p-PD, concentración de precursor, temperatura y tiempo— se optimizaron sistemáticamente. Tras tratamiento hidrotérmico (200 °C, 2 h), el producto se purificó con hexano (removiendo p-PD no reaccionado) y etanol (removiendo ácido), seguido de centrifugación a 14,000 rpm, filtración por membrana 0.22 µm, y evaporación rotativa opcional para producir polvos secos.

Caracterización y Medición

TEM de alta resolución (JEM-2100, 200 kV) evaluó morfología y franjas de red. Espectros FT-IR se registraron con espectrómetro Prestige-21 usando ventanas KRS-5. Espectros de fluorescencia y UV-Vis se obtuvieron con espectrofotómetro F-2500 y espectrómetro Lambda 950, respectivamente. La emisión de dos fotones se midió en espectrógrafo de fibra (QE65000, Ocean Optics) acoplado a láser femtosegundo. Los rendimientos cuánticos se calcularon usando Rodamina B (QY = 56% en etanol) como referencia, siguiendo procedimiento en Archivo Suplementario 1.

Métodos de Cálculo

Cálculos de teoría de funcional de densidad (DFT) se realizaron con Gaussian 09 (B3LYP/6-311++G(d)) en modelo PCM agua para evaluar energética de vías de crecimiento longitudinal y transversal.

Cultivo y Tratamiento Celular

Células HeLa (4×10⁴ células mL⁻¹) se sembraron en DMEM (Gibco) e incubaron a 37 °C con 5% CO₂ por 24 h. SA-CPDs (40 µg mL⁻¹) se añadieron por 12 h, seguidos de lavados PBS. La imagen se realizó en microscopio confocal usando láser femtosegundo 850 nm (30 mW).

Resultados y Discusión

Optimización de Preparación para CPDs Rojos

Todos los sistemas ácidos produjeron CPDs rojos a temperaturas arriba de 180 °C (2 h). Temperaturas más altas (240 °C, 4-12 h) aumentaron tamaño de partícula y disminuyeron fluorescencia. Las condiciones óptimas fueron 200 °C, 2 h, con ratio ácido-p-PD de 1 para H₂SO₄ y 3 para HCl y HClO₄. El rango de concentración p-PD (0.02-0.20 mol L⁻¹) fue tolerante. Bajo estos parámetros, SA-CPDs lograron QY de 21.4% y 16.5% rendimiento, superando HC-CPDs y PA-CPDs.

Caracterización TEM y Análisis FT-IR

HR-TEM reveló CPDs esféricos monodispersos (diámetro promedio ≈5 nm) con espaciado de red 0.21 nm correspondiente a planos grafeno (100). Los espectros FT-IR indicaron mayor oxidación superficial en SA-CPDs, con características pronunciadas –OH y –COOH y señales –NH₂ reducidas, sugiriendo superficie más oxidada e hidrofílica.

Mecanismo Propuesto para Formación de CDs

Cálculos DFT muestran que el crecimiento transversal (−1,406 kJ mol⁻¹) es significativamente más favorable que el longitudinal (−616 kJ mol⁻¹), llevando a intermediarios planos que se autoensamblan en CPDs esféricos.

Propiedades Ópticas

SA-CPDs exhiben fuerte absorción UV a 290 nm (π→π*), con bandas adicionales a 430 y 510 nm (transiciones fenazina-amina). Los espectros de excitación pican cerca de 580 nm, coincidiendo con la emisión a 600 nm, y la fluorescencia permanece independiente de excitación a lo largo de 220-580 nm, confirmando la naturaleza CPD.

Imagen Celular

La excitación de dos fotones a 850 nm produjo emisión a 602 nm antes de pulverizar y 529 nm después, con intensidad aumentada. Imágenes confocales de células HeLa incubadas con SA-CPDs mostraron localización citoplasmática, con fluorescencia del canal verde más fuerte debido a la emisión desplazada hacia azul.

Conclusiones

Demostramos un método hidrotérmico simple, escalable, asistido por ácido sulfúrico para producir CPDs rojos brillantes (≈5 nm, QY = 21.4%, rendimiento = 16.5%). Los CPDs emiten a 600 nm bajo excitación 300-580 nm, y a 602 nm bajo excitación de dos fotones a 850 nm. Su fluorescencia de alto brillo independiente de excitación y eficiente captación celular los hacen candidatos prometedores para imagen de tejido profundo y otras bioaplicaciones.

Abreviaturas

CDs:

Puntos de carbono

CPDs:

Puntos de polímero carbonizado

HC-CPDs:

CPDs sintetizados de p-PD con asistencia HCl

PA-CPDs:

CPDs sintetizados de p-PD con asistencia HClO₄

SA-CPDs:

CPDs sintetizados de p-PD con asistencia H₂SO₄

QYs:

Rendimientos cuánticos

p-PD:

p-Fenilendiamina