Síntesis Libre de Fosfina de Puntos Cuánticos Núcleo-Capa ZnSe/CdS/ZnS con Supresión de Reabsorción y su Aplicación en Detección Sensible de CRP

Resumen

Describimos un protocolo libre de fosfina, en una sola olla, para crear puntos cuánticos (QDs) núcleo-capa ZnSe/CdS/ZnS que combinan alineaciones de banda tipo-II y tipo-I para suprimir reabsorción. Los QDs resultantes de emisión roja logran un impresionante 82 % de rendimiento cuántico de fotoluminiscencia (QY) y estabilidad óptica excepcional. Comparados con QDs tipo-I convencionales, los QDs compuestos exhiben desplazamiento de Stokes marcadamente mayor y reabsorción reducida, lo que se traduce en mayor salida de fluorescencia. Aprovechando estas propiedades, empleamos los QDs como etiquetas fluorescentes en un inmunoensayo ligado a fluorescencia (FLISA) para proteína C-reactiva (CRP). El ensayo alcanzó límite de detección (LOD) de 0.85 ng mL⁻¹ —15 % más sensible que FLISA basado en CdSe/ZnS (1.00 ng mL⁻¹). Estos hallazgos demuestran que QDs ZnSe/CdS/ZnS tipo-II/tipo-I son candidatos fuertes para diagnóstico biomédico y aplicaciones fotónicas.

Antecedentes

QDs núcleo/capa semiconductores poseen rasgos ópticos superiores —rangos amplios de emisión, altos rendimientos cuánticos (QYs) y robusta estabilidad química— volviéndolos etiquetas fluorescentes ideales para diagnóstico, imagen y optoelectrónica. Su estructura electrónica cae en tres categorías según alineación de banda: tipo-I, tipo-I inverso y tipo-II. QDs tipo-I confinan electrones y huecos en el núcleo, impulsando recombinación radiativa y aislando el núcleo activo de defectos superficiales. Sin embargo, el pequeño desplazamiento de Stokes (≈10 nm) común a QDs tipo-I causa reabsorción significativa, disminuyendo intensidad de emisión y limitando ensayos cuantitativos. QDs tipo-II separan electrones y huecos a través de núcleo y capa, produciendo emisión desplazada al rojo y pico de absorción de primer excitón aplanado. Esto reduce solapamiento espectral, suprime reabsorción y mejora detección cuantitativa. QDs ZnSe/CdS tipo-II abarcan emisión de azul-violeta a rojo con reabsorción suprimida, pero sus capas ricas en Cd pueden sufrir quenching inducido por trampas superficiales y biotoxicidad. Recubrir con capa externa ZnS tanto pasiva la superficie, mejora QY y limita lixiviación de Cd. Síntesis previas de QDs ZnSe/CdS/ZnS requirieron fosfinas tóxicas y purificación multi-paso, sin aplicaciones biológicas reportadas.

Aquí introducimos ruta libre de fosfina, en una olla, para producir QDs ZnSe/CdS/ZnS rojos de alta calidad que suprimen reabsorción. El método emplea precursor Se de baja toxicidad (ODE-Se) y oleato de zinc para formar núcleos ZnSe, seguido por crecimiento in-situ de capas CdS y ZnS sin purificación intermedia —facilitando producción escalable. Los QDs alcanzan 82 % QY con contenido reducido de Cd, y su gran desplazamiento de Stokes más perfil de absorción aplanado producen baja reabsorción. Finalmente, demostramos su primer uso como sondas fluorescentes en FLISA para CRP, logrando LOD de 0.85 ng mL⁻¹ —superando ensayo de referencia CdSe/ZnS.

Métodos

Reactivos

Todos los reactivos se usaron tal como recibidos: CdO (99.99 %), ZnO (99.9 %), Se (99.9 %), 1-octadeceno (ODE, 90 %), 1-octanotiol (OT, 98 %), ácido oleico (OA, 90 %), PMAO, MES, y solventes estándar (aceite de parafina, acetona, hexanos, metanol). Constituyentes de buffer (NaOH, HCl, Na₂CO₃, NaHCO₃, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, H₃BO₃, Na₂B₄O₇·10H₂O, Tween-20) de Shanghai Sangon Co., Ltd. BSA y suero de ternera de Sigma. EDC, sulfo-NHS y microplacas de Thermo Fisher Scientific. Anticuerpo monoclonal anti-CRP de ratón y antígeno CRP de Abcam. Todos los químicos sin purificación adicional.

Precursor Se (0.1 M)

Se (6 mmol) se disolvió en 60 mL ODE y calentó a 220 °C por 180 min bajo nitrógeno, produciendo solución amarillo clara.

Precursores Zn y Cd

ZnO (30 mmol) combinado con 30 mL OA y 45 mL ODE, calentado a 310 °C bajo nitrógeno para formar solución clara; mezcla enfriada a 140 °C para inyección. Precursor Cd preparado idénticamente pero a 240 °C y concentración 0.2 M.

Síntesis de QDs ZnSe/CdS/ZnS Tipo-II/Tipo-I

Corrida típica comenzó calentando 4 mL precursor Se y 15 mL ODE a 310 °C. A esta temperatura, 2 mL precursor Zn inyectado rápidamente. Alícuotas tomadas a intervalos para monitorear desplazamientos PL ligados a crecimiento de partícula. Una vez que núcleo alcanzó tamaño deseado, temperatura bajó a 230 °C para crecimiento de capa CdS. Precursor Cd y OT (OT : catión = 1 : 1.2) añadidos gota a gota a 3 mL h⁻¹ mientras subía temperatura a 310 °C. Capa ZnS crecida por mismo método. QDs purificados por precipitación con acetona y redispersados en cloroformo.

QDs CdSe/ZnS Tipo-I

Estos QDs se sintetizaron siguiendo protocolos establecidos y usados para transferencia de fase y preparación FLISA idéntica a procedimiento ZnSe/CdS/ZnS.

Transferencia de Fase a Agua

Oligómero anfifílico polimaleico anhídrido-octadeceno (PMAO) usado para tornar QDs hidrofóbicos solubles en agua. QDs y PMAO disueltos en cloroformo (QD/PMAO = 1:7) con sonicación, luego cloroformo evaporado a 45 °C. Volumen igual de 0.1 M NaHCO₃ (pH 8.5) añadido para disolver complejo. QDs-PMAO resultantes retuvieron fluorescencia completa y exhibieron excelente estabilidad acuosa en amplio rango pH.

Conjugación QDs-Anticuerpo

QDs-PMAO activados con EDC/sulfo-NHS para enlazar grupos carboxilo a anticuerpos monoclonales CRP. Tras incubación en PBS y bloqueo BSA, conjugados lavados por centrifugación y almacenados en 50 µL buffer BS (5 mM, pH 8.0).

Preparación de Microplaca Recubierta con Anticuerpo

Pozos de microplaca recubiertos con 1.8 mg mL⁻¹ anticuerpo monoclonal CRP en buffer carbonato-bicarbonato 50 mM (pH 9.6), incubados a 4 °C por 24 h, lavados tres veces con 0.05 % Tween-20 en 10 mM PBS, bloqueados con 0.5 % BSA en PBS (pH 7.4) overnight. Placas secadas y almacenadas a 4 °C.

Cuantificación CRP por FLISA

En cada pozo, 100 µL de CRP estándar o muestra (diluida en buffer) añadido a placa recubierta, incubado a 37 °C por 30 min, lavado cinco veces. Luego, 100 µL sonda QDs-mAb (diluida en 10 % suero ternera/PBS) añadida, incubada y lavada igual.

Caracterización

Espectros UV-vis absorción y PL registrados con espectrofotómetro Ocean Optics PC2000-ISA. QYs medidos relativo a Rodamina 101 (QY = 100 %) en etanol. Imagen TEM empleó JEOL JEM-2010 a 200 kV. Análisis de fase usó D8-ADVANCE XRD con radiación Cu-Kα (λ = 1.54 Å). Diámetros hidrodinámicos determinados por dispersión dinámica de luz (Nano-ZS 90, Malvern).

Resultados y Discusión

La evolución de espectros UV-vis y PL durante crecimiento de capas se ilustra en Figura 1. Núcleo ZnSe desnudo muestra absorción 420 nm y emisión 428 nm (FWHM = 17 nm). Añadir monocapa CdS expande desplazamiento de Stokes a 54 nm, con absorción 497 nm y emisión 551 nm (FWHM = 38 nm). Crecimiento posterior de capa CdS desplaza PL a 629 nm y ensancha FWHM a 52 nm, reflejando acoplamiento excitón-fonón mejorado. Pico de absorción de primer excitón aplanado y fuerte absorción onda corta (<500 nm) juntos reducen solapamiento espectral, suprimiendo efectivamente reabsorción. Capa ZnS subsecuentemente desplaza emisión hacia azul y estrecha FWHM a 43 nm, mientras QY sube de 20 % a 82 % a través de secuencia crecimiento CdS/ZnS.

Figura 2 confirma evolución estructural: picos XRD se agudizan y desplazan a posiciones wurtzita CdS y ZnS, indicando crecimiento multi-capa exitoso y transición zinc-blenda a wurtzita. Imágenes TEM revelan QDs esféricos monodispersos expandiéndose de 3.90 nm (núcleo) a 11.92 nm (núcleo/capa completo). Espaciamientos reticulares HRTEM (0.32 nm ZnSe, 0.35 nm CdS, 0.31 nm ZnS) coinciden con XRD, confirmando fidelidad composicional.

Análisis EDS muestra ratios Cd/(Zn+Cd) aumentan durante crecimiento capa CdS por intercambio catiónico a >200 °C, pero contenido total Cd permanece bajo (~13 %) comparado a QDs tipo-I CdSe/CdS/ZnS típicos (~40 %). Esta carga Cd reducida disminuye biotoxicidad.

Transferencia de fase a medios acuosos vía PMAO preserva intensidad PL y morfología, confirmado por UV-vis, PL, TEM y espectros FTIR. Espectros FTIR demuestran apertura exitosa de anillo anhídrido y formación COOH en superficie QD.

Pruebas de estabilidad demuestran QDs hidrofóbicos retienen 85 % PL tras purificaciones repetidas, y QDs encapsulados PMAO mantienen >85 % PL tras 400 h en PBS, pH 1–13, y hasta 90 °C (remanente 76 % PL). Resultados confirman idoneidad para ensayos biológicos.

Conjugación con anticuerpos CRP reduce intensidad PL ~40 % por pérdidas de separación pero preserva forma espectral. DLS muestra aumento diámetro hidrodinámico de 46 nm (QDs-PMAO) a 120 nm (QDs-mAb), confirmando conjugación exitosa sin agregación.

Usando QDs-mAb en FLISA produce clara respuesta dosis-respuesta cuadrática (R² = 0.9991) sobre 0–400 ng mL⁻¹. LOD de 0.85 ng mL⁻¹ supera referencia CdSe/ZnS por 15 %. Experimentos de recuperación muestran 83.6–105.9 % precisión en concentraciones baja, media y alta de CRP, subrayando fiabilidad del ensayo.

Conclusiones

Hemos desarrollado síntesis escalable libre de fosfina de QDs núcleo/capa ZnSe/CdS/ZnS con reabsorción suprimida que combinan estructuras de banda tipo-II y tipo-I. Los QDs entregan alto QY (82 %), gran desplazamiento de Stokes y excelente estabilidad, habilitando FLISA altamente sensible para detección CRP (LOD = 0.85 ng mL⁻¹). Estas propiedades posicionan QDs ZnSe/CdS/ZnS como herramientas prometedoras para diagnóstico biomédico y dispositivos optoelectrónicos.