Ensamblaje de puntos de carbono en estructuras con estabilidad mejorada y actividad antibacteriana

Resultados y discusiones

Caracterización de los materiales

Investigaciones de tamaño

La Figura 2 muestra el SEM del polvo para CDF con un aumento relativamente menor (Figura 2a0) y mayor (Figura 2b0) después de la exposición al aire durante varias horas. Puede verse que las CDF estaban bien distribuidas y mostraban un tamaño medio de aprox. 25 nm. Se suponía que los CD mostraban tamaños pequeños mono-dispersos basados ​​en el estudio TEM y AFM (Archivo adicional 1:Figura S1), pero estas pequeñas partículas exhibieron agregación observando por SEM después de la exposición al aire durante un cierto tiempo (Archivo adicional 1:Figura S2 ). Por otro lado, los CDF mantuvieron su morfología aunque estuvieron expuestos al medio ambiente. Esto indicó que los CDF obtenidos son más prometedores para aplicaciones prácticas. Las CDF se caracterizaron además por TEM (Fig. 2b1). Se puede ver que los CDF exhibieron estructuras de ensamblaje con pequeños CD como bloques de construcción. El análisis de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HR-TEM) (Fig.2b2) reveló que el bloque de construcción de las CDF exhibía franjas de celosía con un espaciado d de 0.21 nm, correspondientes a la celosía plana (100) del grafito, que fue similar a los CD clásicos [23,24,25]. Por lo tanto, los CDF de ensamblaje no pierden la característica de los CD, que pueden combinar las ventajas tanto de los marcos grandes completos como de los pequeños bloques de construcción interiores.

SEM para CDF con relativamente menor ( a0 ) y mayor aumento ( b0 ); TEM ( b1 ) HR-TEM ( b2 ) de CDF

Potencial Zeta

Se utilizaron investigaciones de potencial zeta para medir el grado de repulsión electrostática de CD y CDF entre partículas cargadas adyacentes en el sistema disperso (Fig. 3). Se puede ver que el pico de potencial zeta de los CD no estaba bien presentado, que estaban expuestos al entorno ambiental. Además, se obtuvieron múltiples picos de potencial zeta con grandes desviaciones zeta (Tabla 1), lo que indica que los CD eran bastante inestables e irrepetibles. Por otro lado, el pico de potencial zeta para los CDF se centró en un rango relativamente estable. También tuvimos desviaciones zeta mucho más pequeñas basadas en mediciones de tres veces, lo que reveló que los CDF eran más estables y que los sistemas dispersos tenían muestras con mayor pureza.

Potencial Zeta de los CD ( a ) y CDF ( b )

Propiedades de fluorescencia

Los espectros de emisión de fluorescencia se utilizaron para controlar el proceso de ensamblaje de CD a CDF (Fig. 4). A medida que se titulaba la PEI, la emisión de fluorescencia a 350 nm se apagaba gradualmente (Fig. 4a). Pero no se observó un cambio significativo en el espectro de fluorescencia, lo que revela que no se produjo agregación. La estructura de ensamblaje de los CDF cambia todo el tamaño de los CD, lo que influye en la fluorescencia. Mientras tanto, los CD cercanos marcaban la fluorescencia entre sí. Además de esto, la química de la superficie juega un papel importante en las propiedades de fluorescencia. Los átomos de nitrógeno y azufre en la superficie de los CD pueden generar trampas de energía. La fluorescencia brillante de los CD se atribuye a la superficie del defecto con muchos grupos carbonilo y amino. Después de la funcionalización de PEI, la superficie de las CDF estaba dominada por los grupos amino, que apagaban la fluorescencia junto con los tamaños de crecimiento. La comparación del comportamiento de fluorescencia de CD y CDF fue examinada adicionalmente por TCSPC para comprender las rutas de recombinación de carga fotogeneradas de los materiales (Fig. 4b). La emisión se controló a 430 nm. Las desintegraciones de la fluorescencia requirieron un ajuste exponencial de dos componentes. Las constantes de tiempo y las amplitudes relativas se ajustan y resumen en la Tabla S1. Se pudo observar que la vida útil del componente dominante de los CD era de 2,45 ns, mientras que la del otro componente era de 7,47 ns. Por otro lado, la vida útil del componente dominante de los CD fue de 1,98 ns, mientras que el otro componente mostró una vida útil de 7,30 ns. No se observó ningún cambio significativo durante la vida útil entre los CD y los CDF, lo que también indicó que las propiedades de los CD no se modificaron sustancialmente durante el ensamblaje en CDF [26].

Espectros de emisión de fluorescencia a de CD como titulación de PEI y b de por vida para CD y CDF

Toxicidad

Para evaluar la seguridad de los materiales, se investiga la toxicidad de los CD y CDF para las células PC12. Se realizaron ensayos de MTT para investigar la influencia de los materiales en la viabilidad celular (Fig. 5). Después de la incubación de PC12 con CD y CDF, la viabilidad celular no se vio muy afectada en 24 h. Curiosamente, ambos materiales de carbono promueven la proliferación de PC12, que juega un papel importante en la terapia del daño nervioso. Estos resultados indican la baja toxicidad de los materiales, y los materiales son prometedores para la protección nerviosa con células PC12 involucradas [27].

Viabilidad celular de PC12 en presencia de CD ( a ) y CDF ( b ). Viabilidad celular (%) =(absorbancia del grupo experimental - absorbancia del grupo en blanco) / (absorbancia del grupo de control - absorbancia del grupo en blanco) × 100%

Investigaciones antibacterianas

Las actividades antibacterianas de las CD y las CDF se evaluaron inicialmente midiendo la densidad bacteriana en presencia de estos agentes a 600 nm [28]. La Fig. 6 muestra un efecto antibacteriano sustancial tanto de las CD como de las CDF contra las S. aureus y E. coli células. Especialmente, la viabilidad de S. aureus células era casi 0 cuando se utilizaron más de 30 µg / ml de los CDF. De manera similar, E. coli las células fueron desinfectadas tanto por CD como por CDF. Los CD mostraron múltiples cargas (Fig. 3a). Por otro lado, los CDF tenían cargas insignificantes (Fig. 3b), lo que podría suprimir la adhesión bacteriana bajo una repulsión débil, interactuando así con la superficie bacteriana más fácilmente. En comparación, los CDF muestran una mayor actividad antibacteriana basada en el fenómeno de que una proporción relativamente mayor de células muere cuando se utilizan más de 6 µg / ml de los materiales. La actividad antibacteriana mejorada de las CDF se atribuye posiblemente al efecto de sinergia de las CD como bloques de construcción, así como a las cargas superficiales más estables. Para comprender en profundidad el mecanismo antibacteriano, se midieron las ROS que podían oxidar DCFH no fluorescente a DFC fluorescente (Fig. 6C). Ambos materiales de carbono no indujeron significativamente la producción de ROS después de tratar E. coli . Sin embargo, las CDF mejoraron notablemente las ROS intracelulares mientras interactuaban con S. aureus . Dado que las ROS pueden dañar el ADN, el ARN y las proteínas de las bacterias, el valor mejorado facilitó la desinfección de las bacterias. Además, el ROS se estimuló con H ₂ O _2. Vale la pena señalar que todas las producciones de ROS se promocionaron drásticamente en comparación con H ₂ O ₂ tratamiento solo, mientras que los CDF mostraron la mayor mejora. Esto indicó la combinación de H ₂ O ₂ con estos dos materiales de carbono podría mejorar aún más la actividad antibacteriana, especialmente para los CDF.

Actividad antibacteriana de CD y CDF contra S. aureus ( a ) y E. coli ( b ), c Intensidad de fluorescencia de DCF a 525 nm, que muestra una relación lineal con el nivel de ROS, con el tratamiento de CD y CDF en ausencia y presencia de H ₂ O ₂ (100 μM)

Se informó anteriormente que algunos CD desinfectaban S. aureus , que se enumera en la Tabla 2 para su comparación. Los CDF actuales mostraron un MIC competitivo. Además, en lugar de solo disminuir la viabilidad celular investigada, los CDF promovieron la proliferación celular de PC12, lo que indica su versatilidad en el tratamiento de infecciones bacterianas.

La integridad de la membrana bacteriana después del tratamiento con CD y CDF se investigó mediante el experimento de tinción de vivo / muerto (Fig. 7). La tinción verde fluorescente de la FDA solo puede mostrar las células vivas, mientras que el IP rojo fluorescente tiñe específicamente las bacterias muertas con membranas rotas, pero las vivas con membranas bacterianas intactas no se tiñen [30, 31]. Como se muestra en las imágenes de fluorescencia, se observó una evidente fluorescencia roja en las muestras tratadas con CD y se observó una densidad mucho mayor de células muertas en las muestras tratadas con CDF.

Tinción FDA / PI S. aureus y E. coli en ausencia y presencia de CD y CDF a 30 µg / mL. Barra de escala, 200 µm

Basándonos en las comparaciones anteriores, llegamos a la conclusión de que los CDF son prometedores para matar células bacterianas tanto Gram positivas como Gram negativas. Por lo tanto, E. coli y S. aureus antes y después del tratamiento con 30 µg / ml de CDF se caracterizaron por SEM (Fig. 8). Como se muestra en la Fig. 8a, c, las bacterias antes del tratamiento con CDF exhiben una superficie regular. Sin embargo, después de incubar con CDF, la morfología de las células bacterianas que incluyen S. aureus (Fig. 8b) y d E. coli (Fig. 8d) cambió drásticamente. Además, las membranas de muchas células bacterianas se rompieron. Se observaron algunos materiales pequeños en la superficie de las bacterias, que se originaron a partir de las CDF adheridas. Esto indica que las CDF pueden desinfectar las células bacterianas dañando las membranas [32].

SEM para S. aureus ( a , b ) y E. coli antes ( a , c ) y después ( b , d ) el tratamiento con 30 µg / mL de CDF. Barra de escala:2 µm

Dado que tanto los CD como los CDF son fluorescentes, se investigaron 6 µg / ml de los agentes para obtener imágenes bacterianas durante el progreso de la desinfección. La imagen de S. aureus fue investigado y mostrado en la Fig. 9. Curiosamente, se encontró que tanto los CD como los CDF podrían usarse para obtener imágenes de S. aureus . Sin embargo, los CDF muestran una mayor eficiencia de absorción ya que las células bacterianas que observan desde los campos brillantes y oscuros casi se superponen. Por otro lado, solo una parte de S. aureus las células se tiñeron con los CD. Además, las densidades de células bacterianas fueron menores por el tratamiento de CDF, lo que representa CDF desinfectado S. aureus de manera más eficiente en comparación con los CD en las mismas dosis. Estos resultados también revelan que los CDF se pueden usar como tintes alternativos para obtener imágenes de varias células bacterianas.

Imágenes de S. aureus por la absorción de CD y CDF después de 12 h

Conclusiones

El ensamblaje de CD en CDF da como resultado una actividad antibacteriana más robusta. Se concluye que la estructura de ensamblaje permite propiedades más estables pero magnifica la actividad antibacteriana de los CD. Este trabajo también proporciona una nueva vía de ensamblaje de pequeños nanomateriales en marcos para aplicaciones más prácticas.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen en el artículo.

Abreviaturas

CD:

Puntos de carbono

CDF:

Marcos basados ​​en puntos de carbono

PEI:

Polietilenimina

E. coli :

Escherichia coli

S. aureus :

Staphylococcus aureus

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

HR-TEM:

TEM de alta resolución

XPS:

Espectros de fotoelectrones de superficie de rayos X

MIC:

Concentración mínima inhibitoria

NC:

Nanoclusters

TCSPC:

Recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo

CCK-8:

Ensayo del kit 8 de recuento celular

ROS:

Especies reactivas de oxígeno Ros

SEM:

Microscopio electrónico de barrido

ZP:

Potencial Zeta

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