Marcos de puntos de carbono estables con eficacia antibacteriana superior

Resumen

Los puntos de carbono (CDs) se han usado ampliamente como antimicrobianos debido a su superficie activa, pero algunos CDs sufren inestabilidad. Por tanto, aplicaciones relativas como actividad antibacteriana pueden no ser fiables para uso a largo plazo. Aquí, sintetizamos CDs con fluorescencia azul mediante proceso hidrotérmico. Posteriormente, polietilenoimina (PEI) se aplicó para ensamblar CDs en marcos basados en CDs (CDFs). Los CDFs exhibieron fluorescencia apagada pero mostraron propiedades más estables basadas en investigaciones microscopio electrónico barrido y potencial zeta. Tanto CDs como CDFs muestran actividad antibacteriana contra Escherichia coli (E. coli) Gram-negativo y Staphylococcus aureus (S. aureus) Gram-positivo, pero CDFs exhibieron mejor rendimiento antibacteriano, y S. aureus pudo inhibirse completamente con concentración inhibitoria mínima 30 µg/mL. Esto revela que CDFs magnifican tanto estabilidad como actividad antibacteriana, siendo más prometedores para aplicaciones prácticas.

Resumen gráfico

Introducción

Las infecciones bacterianas suponen grave amenaza para vidas humanas, y desarrollo medicamentos efectivos desinfectar bacterias gran demanda. Varios antibióticos usados tratar infecciones bacterianas, pero abuso causa otros problemas como efectos secundarios y resistencia fármacos. Nanomateriales incluyendo polímeros antimicrobianos, nanomateriales metálicos y nanomateriales carbono se han usado como alternativas antibióticos clásicos. Ambos problemas resistencia fármacos y toxicidad se alivian. Recientemente, CDs y nanoclusters (NCs) bien aplicados combatir infecciones bacterianas porque son biocompatibles, activos y pueden limpiarse fácilmente por circulaciones debido tamaños ultra-pequeños. Especialmente, investigadores hallaron CDs muestran excelente capacidad captura radicales libres, más fuerte que muchos fármacos anti-infección tradicionales. Sin embargo, algunos antimicrobianos ultra-pequeños sufren pobre estabilidad debido mayor área superficie oxidativa. Es altamente deseable desarrollar agentes antibacterianos más efectivos combatir infecciones bacterianas uso largo plazo.

Para satisfacer demanda aplicaciones prácticas, antimicrobianos deberían tener: (a) Excelente estabilidad inalterada cierto tiempo ambiente ambiente; (b) Excelente biocompatibilidad y baja toxicidad; (c) Alta actividad antibacteriana. Nanomateriales mayores tienden ser más estables, pero podrían tener actividad antibacteriana relativamente más débil debido menor área superficie activa. Considerando debilidades nanomateriales pequeños y grandes, reportamos ensamblaje pequeños CDs en grandes CDFs simplemente añadiendo polietilenoimina (PEI) (Fig. 1). CDs no se fusionaron sino mantuvieron morfología como bloques construcción. Por tanto, CDFs enteros mostraron tamaños mayores pero demostraron excelente estabilidad sin perder propiedades activas CDs. Además, hallamos CDFs mostraron actividades antibacterianas mejoradas contra tanto E. coli Gram-negativo como S. aureus Gram-positivo comparado CDs, indicando rendimiento antibacteriano amplio espectro, aunque muchos CDs solo erradicaron bacterias Gram-positivas. Adicionalmente, CDFs promovieron proliferación células PC12 (línea celular feocromocitoma médula suprarrenal rata), mostrando gran potencial aplicaciones recuperación nerviosa. Este trabajo sugiere ensamblaje pequeños CDs en grandes CDFs no solo mejora estabilidad sino también magnifica actividad antibacteriana.

Materiales y métodos

Materiales e instrumentación

Espectros fotoelectrónicos rayos X superficie (XPS) registrados en instrumento ESCALAB250Xi. Microscopio electrónico transmisión (TEM) realizado por microscopio JEM-2100 operando 200 kV. Fluorescencia materiales obtenida usando espectrómetro fluorescencia F97. Tinción FDA/PI células bacterianas registrada modo tapping microscopio Leica DFC450C. Vida fluorescencia medida en sistema conteo fotón único correlacionado tiempo (TCSPC) usando espectrofluorómetro Nanolog (Horbia JY, Japón). Espectros espectroscopía ultravioleta-visible (UV-vis) obtenidos instrumento UV-1600. Imagen bacteriana observada microscopio confocal (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Todos reactivos grado analítico. Agua desionizada usada en experimentos. Kit conteo células-8 obtenido Beyotime Biotechnology.

Preparación CDs y CDFs

L-cisteína (1,0 g) disuelta 10,0 mL agua desionizada y mezclada bien. pH solución ajustado 9,0 con NaOH 1,0 M. Solución transferida reactor hidrotérmico calentada 160 °C 24 h. Tras enfriar temperatura ambiente, solución resultante sometida diálisis bolsa diálisis (corte MW 7000) un día. CDs obtenidos usados caracterizaciones y experimentos siguientes. Para preparación CDFs, 40 µL 1% PEI añadido 1 mL CDs. Mezcla reposó 1 h. Producto purificado diálisis mismo método purificación CDs. Para caracterización HR-TEM, muestras concentradas volumen pequeño, transferidas columna gel sílice, eluidas metanol y diclorometano obtener productos further purificados.

Evaluación toxicidad

Células PC12 sembradas placas 96 pozos 12 h luego incubadas CDs y CDFs diferentes concentraciones. Número células viables investigado usando ensayo Kit Conteo Células-8 (CCK-8). 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) (5 mg/mL PBS) añadido 1/10 volumen cultivo, células devueltas incubadora. Tras eso sobrenadantes descartados y 200 µL dimetil sulfoxido (DMSO) añadido cada pozo. Cristales disueltos agitando placas 10 min. Absorbancia 490 nm medida usando Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Pozos control blanco incluidos todas medidas absorbancia.

Experimento antibacteriano

E. coli y S. aureus incubados ausencia y presencia CDs y CDFs 37 °C 250 rpm agitación. Crecimiento células bacterianas caldo Lisogenia (LB) medido Microreader 600 nm (OD600). Medio LB usado control blanco. OD600 representa densidad celular, viabilidad celular relativa calculada comparando células cultivadas presencia materiales grupo control (OD600 células bacterianas ausencia CDs o CDFs). Bacterias vivas/muertas evaluadas protocolo tinción FDA/PI.

Detección especies reactivas oxígeno (ROS)

Producción ROS intracelular medida células bacterianas antes y tras tratamiento CDs y CDFs 12 h, con sonda 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) siguiendo instrucciones. Fluorescencia detectada longitud onda emisión 525 nm excitación 488 nm.

Resultados y discusiones

Caracterización materiales

Investigaciones tamaño

Fig. 2 muestra SEM polvo CDFs con magnificaciones relativamente menor (Fig. 2a0) y mayor (Fig. 2b0) tras exposición aire varias horas. CDFs bien distribuidos tamaño promedio ~25 nm. CDs suponían mostrar tamaños mono-dispersos pequeños basado estudios TEM y AFM (Archivo adicional 1: Figura S1), pero estas partículas pequeñas exhibían agregación observando SEM tras exposición aire cierto tiempo (Archivo adicional 1: Figura S2). Por otro lado, CDFs mantuvieron morfología aunque expuestos ambiente. Esto indica CDFs obtenidos más prometedores aplicaciones prácticas. CDFs further caracterizados TEM (Fig. 2b1). CDFs exhiben estructuras ensamblaje con pequeños CDs como bloques construcción. Análisis microscopía transmisión alta resolución (HR-TEM) (Fig. 2b2) reveló bloques construcción CDFs exhiben franjas red distancia 0,21 nm, correspondiente plano red (100) grafito, similar CDs clásicos. Por tanto, CDFs ensamblados no pierden característica CDs, pudiendo combinar ventajas marcos grandes enteros y bloques construcción interiores pequeños.

Potencial zeta

Investigaciones potencial zeta usadas medir grado repulsión electrostática CDs y CDFs entre partículas cargadas adyacentes sistema disperso (Fig. 3). Pico potencial zeta CDs no bien definido, expuestos ambiente. Además, múltiples picos potencial zeta obtenidos con grandes desviaciones zeta (Tabla 1), indicando CDs bastante inestables y no repetibles. Por otro lado, pico potencial zeta CDFs enfocado rango relativamente estable. También tuvimos desviaciones zeta mucho menores basado tres mediciones, revelando CDFs más estables y sistemas dispersos muestras mayor pureza.

Propiedades fluorescencia

Espectros emisión fluorescencia usados monitorear proceso ensamblaje CDs a CDFs (Fig. 4). Con titulación PEI, emisión fluorescencia 350 nm se apagó gradualmente (Fig. 4a). Pero no corrimiento significativo espectros fluorescencia observado, revelando no ocurrió agregación. Estructura ensamblaje CDFs cambia tamaño entero CDs, influyendo fluorescencia. Además, CDs cercanos marcan fluorescencia cada uno. Así como esto, química superficie juega papel importante propiedades fluorescencia. Átomos nitrógeno y azufre superficie CDs pueden generar trampas energía. Fluorescencia brillante CDs atribuye superficie defectuosa muchos grupos carbonilo y amino. Tras funcionalización PEI, superficie CDFs dominada grupos amino, apagando fluorescencia junto tamaños crecientes. Comparación comportamiento fluorescencia CDs y CDFs further examinada TCSPC entender vías recombinación cargas foto-generadas materiales (Fig. 4b). Emisión monitorizada 430 nm. Decaimientos fluorescencia requirieron ajuste exponencial dos componentes. Constantes tiempo y amplitudes relativas ajustadas resumidas Tabla S1. Vida componente dominante CDs 2,45 ns, otro componente 7,47 ns. Por otro lado, vida componente dominante CDs 1,98 ns, otro componente 7,30 ns. No cambio significativo vida observado entre CDs y CDFs, indicando propiedades CDs no cambiaron sustancialmente al ensamblar CDFs.

Toxicidad

Para evaluar seguridad materiales, toxicidad CDs y CDFs células PC12 investigada. Ensayos MTT realizados investigar influencia materiales viabilidades celulares (Fig. 5). Tras incubación PC12 con CDs y CDFs, viabilidades celulares no afectadas mucho 24 h. Interesantemente, ambos materiales carbono promueven proliferación PC12, papel importante terapia daño nervioso. Resultados indican baja toxicidad materiales, prometedores protección nerviosa con células PC12 involucradas.

Investigaciones antibacterianas

Actividades antibacterianas CDs y CDFs evaluadas inicialmente midiendo densidad bacteriana presencia estos agentes 600 nm. Fig. 6 muestra efecto antibacteriano sustancial tanto CDs como CDFs contra tanto S. aureus como E. coli. Especialmente, viabilidad células S. aureus casi 0 cuando >30 µg/mL CDFs usados. Similarmente, células E. coli desinfectadas tanto CDs como CDFs. CDs mostraron múltiples cargas (Fig. 3a). Por otro lado, CDFs cargas insignificantes (Fig. 3b), podría suprimir adhesión bacteriana bajo repulsión débil interactuando superficie bacteriana más fácilmente. Por comparación, CDFs muestran mayor actividad antibacteriana basado fenómeno que proporción relativamente mayor células muertas cuando >6 µg/mL materiales usados. Actividad antibacteriana mejorada CDFs posiblemente atribuida efecto sinergia CDs como bloques construcción así como cargas superficiales más estables. Para entender profundamente mecanismo antibacteriano, ROS que oxidan DCFH no fluorescente a DFC fluorescente medido (Fig. 6C). Ambos materiales carbono no indujeron significativamente producción ROS tras tratar E. coli. Sin embargo, CDFs mejoraron notablemente ROS intracelular interactuando S. aureus. Como ROS pueden dañar ADN, ARN y proteínas bacterianas, valor mejorado facilitó desinfección bacterias. Además, ROS estimulado con H₂O₂. Vale notar producciones ROS todas promovidas dramáticamente comparado tratamiento H₂O₂ solo, mientras CDFs mostraron mayor mejora. Indicó combinación H₂O₂ con estos dos materiales carbono podría further mejorar actividad antibacteriana, especialmente CDFs.

Algunos CDs reportados previamente desinfectando S. aureus, listados Tabla 2 comparación. CDFs actuales mostraron MIC competitivo. Además, en lugar solo disminuir viabilidad células investigadas, CDFs promovieron proliferación células PC12, indicando versatilidad tratando infecciones bacterianas.

Integridad membrana bacteriana tras tratamiento CDs y CDFs investigada experimento tinción vivo/muerto (Fig. 7). Tinción verde fluorescente FDA solo muestra células vivas, mientras rojo fluorescente PI tiñe específicamente bacterias muertas membranas rotas, pero vivas con membranas intactas no tiñen. Como mostrado imágenes fluorescencia, fluorescencia roja obvia vista muestras tratadas CDs y mayor densidad células muertas vista muestras tratadas CDFs.

Basado comparaciones anteriores, concluimos CDFs prometedores matar tanto células bacterianas Gram-positivas como Gram-negativas. Por tanto, E. coli y S. aureus antes y tras tratar 30 µg/mL CDFs caracterizados SEM (Fig. 8). Fig. 8a,c, bacterias antes tratamiento CDFs exhiben superficie regular. Sin embargo, tras incubar CDFs, morfología células bacterianas incluyendo S. aureus (Fig. 8b) y E. coli (Fig. 8d) cambió drásticamente. Además, membranas muchas células bacterianas se rompieron. Algunos materiales pequeños observados superficie bacterias, originados CDFs adheridos. Indica CDFs desinfectan células bacterianas dañando membranas.

Dado tanto CDs como CDFs son fluorescentes, 6 µg/mL agentes investigado imagen bacteriana durante progreso desinfección. Imagen S. aureus investigada mostrada Fig. 9. Interesantemente, hallamos tanto CDs como CDFs podían usarse imagen S. aureus. Sin embargo, CDFs muestran mayor eficiencia captación ya que células bacterianas observando campos claro y oscuro casi solapaban. Por otro lado, solo parte células S. aureus teñida CDs. Además, densidades células bacterianas menores tratamiento CDFs, representando CDFs desinfectaron S. aureus más eficientemente comparado CDs mismas dosis. Estos resultados también revelan CDFs pueden usarse colorantes alternativos imagen diversas células bacterianas.

Conclusiones

Ensamblaje CDs en CDFs resulta actividad antibacteriana más robusta. Se concluye estructura ensamblaje permite propiedades más estables pero magnifica actividad antibacteriana CDs. Este trabajo también proporciona nueva vía ensamblaje nanomateriales pequeños en marcos aplicaciones más prácticas.