Puntos cuánticos CoFe₂O₄: terapia fototérmica/fotodinámica dual para CPCNP - Inducción apoptosis vía modulación PI3K/AKT

Resumen

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) se ha convertido en el segundo tumor maligno más diagnosticado mundialmente. Como nuestro interés prolongado en buscar nanomateriales para desarrollar estrategias terapias cáncer, aquí construimos novedosos puntos cuánticos CoFe₂O₄ (QDs) con destacadas propiedades sinérgicas fototérmicas/fotodinámicas que suprimen CPCNP eficientemente sin toxicidad aparente. Mostramos que combinación CoFe₂O₄-QDs + tratamiento NIR induce apoptosis células CPCNP. Además, tratamiento CoFe₂O₄-QDs + NIR también promueve generación especies reactivas oxígeno (ROS) para desencadenar muerte celular regulando vía PI3K/AKT. Más aún, tratamiento CoFe₂O₄-QDs + NIR elimina exitosamente xenoinjertos tumorales in vivo sin efectos tóxicos aparentes. En conjunto, reportamos que nanomateriales novedosos CoFe₂O₄-QDs exhiben efecto sinérgico mejorado terapia fototérmica (PTT) y terapia fotodinámica (PDT) matando CPCNP sin toxicidad, pudiendo ser fotosensibilizador prometedor terapia CPCNP.

Introducción

El cáncer es causa principal muerte y carga enorme familia y sociedad, entre los cuales cáncer pulmón segundo más diagnosticado y primero muerte relacionada cáncer 2020. Según reportes, CPCNP, ~85 % todos cánceres pulmón, caracterizado alta incidencia y mortalidad. Recientemente, a pesar opciones quirúrgicas, gran esfuerzo dado desarrollar quimioterapias o inmunoterapias tratar CPCNP. Por ejemplo, inhibidores EGFR-mutante e inhibidores KRAS probados efectivos y más nuevos inhibidores ALK en curso. Anti-PDL1 y anti-CLTA4, inhibidores puntos control inmunitario también brindan eficacia prometedora y prolongan beneficio supervivencia. Sin embargo, tasa respuesta estos fármacos difiere paciente a paciente y efectos secundarios, especialmente resistencia fármacos, no deben descuidarse. Por tanto, desarrollar estrategias terapéuticas novedosas, menos invasivas, es urgente y necesidad para investigación CPCNP y tratamientos clínicos.

Basado progresos recientes, uso nanomateriales realizar terapia fototérmica (PTT) y terapia fotodinámica (PDT) ha despertado tremenda atención y gran desarrollo como estrategia anti-cáncer y puede ser opción alternativa tratamiento clínico. PTT y PDT basadas nanomateriales caracterizadas menos invasión y baja toxicidad, poca probabilidad inducir resistencia fármacos. Con colaboración luz, mayormente NIR, nanomateriales localizados pueden elevar temperatura dentro tumor y convertir oxígeno a especies reactivas oxígeno (ROS) citotóxicas, causando muerte celular eliminar tumores. En este contexto, nanomaterial juega papel clave influir eficacia y garantizar seguridad. Aunque tales nanomateriales incluyen nanoestructuras metálicas, materiales basados carbono, nanopartículas poliméricas (PNPs) o compuestos semiconductores, tienen limitaciones propias. Por ejemplo, materiales basados carbono costosos y propiedad suspensión insatisfactoria, limitando aplicación gran escala y potencialidad clínica. Por tanto, más intentos deben abordarse generar nanomateriales más adecuados further uso.

Años recientes, puntos cuánticos (QDs), como nanomateriales novedosos, recibido gran atracción aplicaciones biomédicas por buena bio-compatibilidad, solubilidad y lo más importante superior foto-estabilidad y facile propiedad funcionalización superficie. Aprovechando estas propiedades, varios reportes usaron QDs como reactivos PDT novedosos y diseñados acompañar otras biomoléculas mejorar eficacia PDT tratamiento cáncer. Por ejemplo, Meng et al. reportaron GQD@MnO₂ multi-funcional inducido excitación dos-fotones mejorar eficacia PDT. Además, Kuo et al. generaron QDs dopados nitrógeno funcionalizados moléculas amino, mejorando también eficiencia PDT. Inspirados hallazgos interesantes, buscamos desarrollar QDs novedosos combinados nanomateriales base metal no noble que puedan traer efectos sinérgicos PTT/PDT en un nano-sistema. Por ejemplo, nanomateriales base Co bien estudiados metal no noble, conocidos como agentes PTT terapia tumor o imagen. Por tanto, sugerimos diseñar QDs base Co puede traer efectos sinérgicos PTT/PDT mejorados.

En este estudio, sintetizamos nanomateriales novedosos CoFe₂O₄-QDs exhiben efectos sinérgicos PTT y PDT mejorados matando CPCNP sin efectos tóxicos in vitro e in vivo, pudiendo ser fotosensibilizador prometedor terapia CPCNP.

Materiales y métodos

Síntesis CoFe₂O₄-QDs

CoFe₂O₄-QDs sintetizados mediante método hidrotérmico. Típicamente, 0,238 g CoCl₂·6H₂O y 0,808 g Fe(NO₃)₃·9H₂O disueltos 10 mL H₂O y 10 mL mezcla disolvente glicol propileno, agitado 10 min. Luego 4 mL dithranol amina añadido gota a gota, seguido agitación 30 min. Slurry obtenido transformado autoclave 50 mL acero inoxidable revestido Teflon. Autoclave mantenido 160 °C 3 h horno. CoFe₂O₄-QDs recogidos centrifugando 8500 rpm 10 min y enjuagados agua desionizada y etanol sucesivamente. Reactivos y materiales usados estudio en Tabla 1.

Caracterización CoFe₂O₄-QDs

Morfología y tamaño CoFe₂O₄-QDs preparados determinados por TEM y sistema EDS. Estructura cristalina analizada por difractómetro rayos X (Bruker Alemania) equipado radiación Cu Ka (k=0,15406 nm). Espectro absorbancia CoFe₂O₄-QDs detectado espectrofotómetro SHIMADZU UV-2600. Estados valencia elementos CoFe₂O₄-QDs determinados por medidas espectroscopía fotoemisión rayos X (XPS, VG ESCALAB 220I-XL, USA). Imagen térmica registrada cámara IR térmica (FLIR E50, USA).

Cultivo celular

Línea celular CPCNP NCI-H460 (H460) y A549 y células endoteliales vena umbilical humana (HUVECs) obtenidas ATCC y probadas micro-plasma negativas. H460 y A549 cultivadas RPMI-1640 suplementado 10 % suero fetal bovino (FBS) y 1 % Penicilina-Estreptomicina (Gibco). HUVECs cultivadas medio crecimiento células endoteliales (Sigma, #211-500). Todas células mantenidas oscuridad humedad 37 °C incubadora 5 % CO₂.

Detección citotoxicidad

Diferentes concentraciones trabajo (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/mL) CoFe₂O₄-QDs añadidas y cultivadas HUVECs 24 h. Tras incubación, medio cultivo cambiado y reactivo CCK-8 añadido cada pozo seguido 1 h incubación. Placas medidas 450 nm lector multimodo EnSpire™. Ratio viabilidad celular tomado 100 % control HUVECs.

Análisis apoptosis

H460 y A549 (2 × 10⁵) cultivadas placas 6 pozos overnight antes tratadas 1,0 mg/mL CoFe₂O₄-QDs combinado láser NIR 808 nm 5 min. Luego células lavadas y teñidas kit apoptosis Annexin-V/PI (BD; #556547) siguiendo instrucciones fabricante. Para ensayo apoptosis HUVECs, HUVECs incubadas diferentes concentraciones CoFe₂O₄-QDs. Ratio apoptosis determinado como descrito arriba.

Detección ROS celular

H460 y A549 cultivadas placas 6 pozos overnight. Células incubadas con o sin 1,0 mg/mL 1 h y tratadas láser NIR 808 nm 5 min. Tras tratamientos, DCFH-DA añadido incubado 30 min seguido detección FACS excitación/emisión 485 nm/535 nm. Para ensayo inhibición ROS, inhibidor ROS NAC (Sigma; A7250) añadido según instrucciones fabricante. Datos further cuantificados software Flow-jo.

Análisis Western Blot

H460 y A549 tratadas como ensayo apoptosis, proteína célula completa extraída usando tampón lisis RIPA. Detección Western blot realizada como descrito antes. Anticuerpos usados: policlonal conejo anti-Bcl-2 (abcam; ab59348), monoclonal conejo anti-Bax (abcam; ab32503), policlonal conejo anti-P-PI3K (Bio-Vision; 3152-100), monoclonal conejo anti-P-AKT-S473 (CST; 4060S), monoclonal conejo anti-β-Actina (CST; 4970S), anticuerpo anti-conejo IgG HRP-enlazado (CST; 7074S). Cuantificación determinada usando software Image-J.

Estudio in vivo efecto anti-CPCNP combinación CoFe₂O₄ y NIR

Para determinar capacidad eliminación tumoral CoFe₂O₄-QDs, células H460 implantadas subcutáneamente 50 % MatriGel ratones NSG (N=8 cada grupo). Machos M-NSG 4-6 semanas obtenidos Shanghai Model Organisms (#NM-NSG-001) todos experimentos in vivo. Cuando tumor visualizado y volumen ~5 mm × 5 mm, ratones divididos aleatoriamente cuatro grupos: Control, solo NIR, solo CoFe₂O₄-QDs, CoFe₂O₄-QDs + NIR. Ratones grupos CoFe₂O₄-QDs solo y CoFe₂O₄-QDs + NIR inyectados intratumoralmente 50 µL CoFe₂O₄ (5,0 mg/kg) basado trabajo previo, Control y NIR inyectados 50 µL PBS. Tras inyección, láser NIR 808 nm (1 W/cm²) realizado grupos NIR y CoFe₂O₄-QDs + NIR 10 min, monitoreado equipo imagen térmica infrarroja. Volumen tumor registrado cada día calculado fórmula V = largo × ancho²/2. Una vez diámetro xenoinjertos ratones restantes ~15 mm, ratones sacrificados xenoinjertos fotografiados almacenados further detección. Todos experimentos animales y protocolos aprobados Comité Cuidado Uso Animales Institucional (IACUC) y Comité Bienestar Animal Hospital Universitario Pekín Shenzhen.

Análisis tinción H&E e inmunohistoquímica

Para evaluación patológica, xenoinjertos tumorales (N=3) cosechados día tras tratamiento cada grupo fijados formalina buffer 10 % incluidos parafina tinción H&E e detección IHC. Para evaluación toxicidad in vivo, riñón, hígado, pulmón, corazón y bazo ratones extraídos fijados evaluación patológica. Para tinción IHC, anticuerpo anti-Ki67 (Abcam; ab15580) usado. Cuantificación área positiva IHC realizada software Fiji.

Análisis estadístico

Todos experimentos, "N" representa número repeticiones o ratones usados indicado leyenda figura. Prueba t Student o ANOVA un sentido usado comparaciones estadísticas. P < 0,05 considerado significativo mientras "ns" muestra no significativo. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 indicados "*", "**", "***" respectivamente. Datos analizados GraphPad Prism 5.

Resultados

Características novedosos CoFe₂O₄-QDs

Primero, construimos CoFe₂O₄-QDs usando enfoque hidrotérmico bajo costo y simple. Imagen TEM CoFe₂O₄-QDs Fig. 1a, patrón uniforme estable diámetro ~3,4 nm (Fig. 1b). CoFe₂O₄-QDs preparados color marrón oscuro (Fig. 1b) excelente solubilidad agua. Imagen TEM alta resolución (Fig. 1c) mostró espaciado red (222) ~0,242 nm consistente parámetros cristalinos CoFe₂O₄-QDs. Además, espectro elementos (Fig. 1d) further confirmó componente elemento CoFe₂O₄-QDs Co y Fe, relación atómica Co/Fe ~1:2. Datos mostraron construcción exitosa CoFe₂O₄-QDs further investigación.

Detección propiedades físicas CoFe₂O₄-QDs

Para determinar propiedades físicas CoFe₂O₄-QDs preparados, realizamos varias detecciones tras construcción. Con test determinación absorbancia NIR, CoFe₂O₄-QDs mostraron conversión fototérmica adecuada manera dependiente concentración y aumentos temperatura (ΔT) ajustables 0,3-18,9 °C (Fig. 2a). Además, concentración 1,0 mg/mL CoFe₂O₄-QDs, aumentando potencia radiación NIR 0,5-2,0 W/cm², ΔT ajustable 0,8-24,3 °C (Fig. 2b). Datos sugirieron rendimiento conversión fototérmica CoFe₂O₄-QDs dependiente concentración y potencia irradiación. Furthermore, estabilidad CoFe₂O₄-QDs conversión fototérmica disparada determinada irradiación periódica (Fig. 2c). Aunque eficiencia conversión luz-calor calculada 7,18 % (Fig. 2d), suficiente acompañar mejorar efecto PDT CoFe₂O₄-QDs. Además, longitud onda máxima CoFe₂O₄-QDs absorbe luz ~808 nm (Fig. 2e,f). En conjunto, datos sugieren CoFe₂O₄-QDs podrían desarrollarse agente sinérgico PTT/PDT prometedor terapia alternativa eliminación tumoral.

Evaluación citotoxicidad CoFe₂O₄-QDs hacia células normales

Puesto que nanopartículas ampliamente usadas como vehículos fármacos o intra-medio terapias tumorales, citotoxicidad CoFe₂O₄-QDs hacia células normales especialmente células epiteliales vasculares humanas debe confirmarse further uso. Por tanto, resultados previos, probamos diferentes concentraciones (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/mL) CoFe₂O₄-QDs. Tras co-cultivo HUVECs (línea celular epitelial humana normal), reactivo CCK-8 añadido detección viabilidad celular. No citotoxicidad obvia observada comparado grupo control (Fig. 3a). En este contexto, further ensayo apoptosis realizado lograr resultados consistentes mismas condiciones (Fig. 3b). Cuantificación ratio apoptosis indicó no diferencia significativa comparado grupo control (Fig. 3c). Datos mostraron CoFe₂O₄-QDs sin efecto tóxico aparente células normales, indicando potencial usarse como intermedio entrega fármacos.

Combinación NIR y CoFe₂O₄-QDs induce apoptosis CPCNP

Para determinar capacidad potencial eliminación cáncer CPCNP CoFe₂O₄-QDs, irradiación láser NIR (808 nm) realizada combinada incubación CoFe₂O₄-QDs in vitro. Luego, ensayo apoptosis llevado a cabo tras tratamientos, tanto H460 como A549 revelaron tasa apoptosis agresiva combinación CoFe₂O₄-QDs y láser NIR (Fig. 4a,b). Cuantificación mostró diferencia significativa comparado grupo control, mientras CoFe₂O₄-QDs solo o NIR solo mostraron no diferencia indicando CoFe₂O₄-QDs más NIR induce efecto anti-CPCNP (Fig. 4a,b). Sabido alteración nivel proteína Bcl-2/Bax importante determinar si células sufrirían apoptosis. Consistente esta idea, nivel proteína Bcl-2 y Bax determinado tanto H460 como A549 tras tratamientos (Fig. 4c,d). Como esperado, datos mostraron ratio Bcl-2/Bax disminuyó, considerado marcador apoptosis mediada mitocondrias. Por tanto, presentamos CoFe₂O₄-QDs más NIR da lugar efecto anti-CPCNP activando vía apoptosis mediada mitocondrias.

Combinación CoFe₂O₄-QDs y NIR induce generación ROS vía vía PI3K/AKT

Disfunción mitocondrias siempre lleva nivel ROS generado upregulado, causa muerte celular CPCNP. En este contexto, realizamos detección ROS tras tratamiento CoFe₂O₄-QDs más NIR en H460 y A549. Resultados mostraron inmensa liberación ROS grupo combinación, indicando efecto PDT mejorado inducido CoFe₂O₄-QDs incluso baja eficiencia transmisión fototérmica (Archivo adicional 1: Fig. S1A,B). Furthermore, nivel proteína relacionado vía señalización PI3K/AKT también reducido, sugiriendo alteración ROS regulada vía PI3K/AKT, llevando alteración nivel expresión proteína Bcl-2/Bax (Fig. 4c,d, Archivo adicional 1: Fig. S1C,D). Para confirmar idea, inhibidor ROS NAC añadido revertir fenómeno (Fig. 5a,b). Luego, expresión PI3K/AKT determinada rescatada tras tratamiento NAC, further confirmando liberación ROS tras tratamiento CoFe₂O₄-QDs más NIR regulada vía PI3K/AKT (Fig. 5c,d). Estos hallazgos apoyan fuertemente idea que combinación CoFe₂O₄-QDs y NIR conduce efecto sinérgico PTT y PDT matando células CPCNP induciendo apoptosis dependiente disfunción mitocondrias (ROS).

Evaluación in vivo anti-CPCNP combinación CoFe₂O₄-QDs y NIR

Basado resultados in vitro, next investigamos efecto anti-CPCNP combinación CoFe₂O₄-QDs y NIR tratamiento modelo ratones portadores tumor CPCNP. Ratones M-NSG implantados subcutáneamente células H460. Tras inyección intratumoral CoFe₂O₄-QDs, irradiación láser NIR causó aumento rápido temperatura ~56 °C monitor equipo detección térmica (Fig. 6a,b). Moreover, tinción histopatológica mostró área necrosis extensa observada grupo combinación indicando CoFe₂O₄-QDs más NIR causó muerte celular tumoral resultado eliminación tumor (Fig. 6c,d). Further tinción IHC mostró área positiva Ki-67 reducida agresivamente comparado otros grupos tras tratamiento combinacional indicando xenoinjertos tratados ya no proliferan (Archivo adicional 2: Fig. S2A,B). Next, seguimiento 12 días tras tratamiento CoFe₂O₄-QDs y NIR. Como esperábamos, tamaño y peso xenoinjertos tumorales otros grupos crecieron notablemente pero no grupo tratamiento CoFe₂O₄-QDs y NIR (Fig. 6e,f), apoyando idea combinación CoFe₂O₄-QDs y NIR podría eliminar completamente xenoinjertos tumorales in vivo. Respecto efecto citotóxico CoFe₂O₄-QDs, al menos período observación, no efecto adverso obvio detectado resultados análisis histopatología órganos importantes ratones (Archivo adicional 2: Fig. S2C). Datos arriba proporcionaron fuerte evidencia CoFe₂O₄-QDs podrían desarrollarse reactivo novedoso PTT/PDT tratamiento CPCNP.

Discusión

Años recientes, investigación desarrollo estrategias anti-CPCNP logrado tremendo progresos. Tanto medicina precisión blanco oncogén mutante específico CPCNP adicto como terapias bloqueo puntos control inmunitario brindan futuro prometedor tratamientos clínicos. Sin embargo, dada complejidad y heterogeneidad microambiente tumoral y riesgo subyacente pérdida antígeno tumoral, sigue siendo cuello botella bajar tasa resistencia fármacos siguiente estado evasión inmunitaria, llevando recaída tumoral corto tiempo. Por tanto, buscar tratamientos novedosos o intermedios terapias CPCNP es urgente. Entre enfoques emergentes, nanomateriales valorados y listados frontales agentes efectivos eliminación cáncer. Aprovechando tamaño pequeño, buenas biocompatibilidades y habilidades transmisión térmica, varios nanomateriales ejercen excelentes capacidades eliminación cáncer investigaciones recientes.

En nuestro estudio, desarrollamos novedosos CoFe₂O₄-QDs aplicables como intermedio tratamientos CPCNP induciendo apoptosis células tumorales efectos sinérgicos PTT y PDT. Como otros nanomateriales, CoFe₂O₄-QDs exhibieron excelente biocompatibilidad estudios mostraron no toxicidad obvia células normales y órganos mayores. Aunque hallamos tasa transmisión térmica no alta como otros nanomateriales, suficiente CoFe₂O₄-QDs inducir apoptosis células cáncer bajo activación láser NIR. CoFe₂O₄-QDs muestra buena relación lineal absorbancia luz estudio y potencialmente genera ROS combinación láser NIR, further prueba CoFe₂O₄-QDs actuar fotosensibilizador ventajoso. Next further optimizar estructura o añadir elementos termo-sensibles CoFe₂O₄-QDs podría alcanzar mayor tasa transmisión térmica mejores efectos sinérgicos PTT y PDT. Además, aplicar fármacos químicos o anticuerpos superficie CoFe₂O₄-QDs factible, pudiendo traer eficiencia eliminación superior. Por ejemplo, enfoque enlazar anticuerpos anti-PDL1 o anti-CTLA4 a CoFe₂O₄-QDs podría ser terapia combinacional prometedora romper microambiente inmunosupresor dentro tumores, nuestro próximo interés full usage CoFe₂O₄-QDs.

Además, mecanismo CoFe₂O₄-QDs matando CPCNP elucidado estudio. Confirmamos CoFe₂O₄-QDs induce apoptosis CPCNP mainly through ROS secretion after NIR laser activated synergistic PDT and PTT effects. Exceso ROS genera estrés oxidativo células tumorales directamente causa daño ADN, que a su vez activa vías señalización downstream, induce muerte células tumorales. Entre los cuales, evidencia creciente mostrado vía PI3K/AKT podría regularse ROS celular y lleva disfunción mitocondrias. Bien aceptado que upon activation, AKT fosforilada PI3K por tanto inactiva proteína pro-apoptótica Bax y protege células apoptosis. Además, AKT fosforilada también capaz estabilizar complejo MDM2/p53, regula supervivencia celular. En este contexto, papel tal vía secreción ROS inducida CoFe₂O₄-QDs investigado. Como esperado, hallamos ROS excesivo causado CoFe₂O₄-QDs downreguló significativamente expresión vías PI3K/AKT por tanto causa apoptosis células tumorales activando Bax pero inactivando proteína Bcl-2. Hallazgo further confirmado añadiendo inhibidor ROS, revirtió expresión PI3K/AKT y disminuyó producción ROS. Dado vía PI3K/AKT conocida regular supervivencia y muerte celular, especialmente células cáncer, entender tal mecanismo CoFe₂O₄-QDs matando CPCNP ayudaría desarrollar más opciones terapias combinacionales.

En resumen, desarrollar fotosensibilizadores novedosos terapia alternativa eliminación tumoral, construimos exitosamente CoFe₂O₄-QDs usando enfoque hidrotérmico bajo costo y fácil manera este estudio. CoFe₂O₄-QDs tienen amplia absorbancia NIR, buena biocompatibilidad y habilidad conversión fototérmica. Además, comparado QDs reportados previamente, CoFe₂O₄-QDs exhibieron efecto sinérgico PTT/PDT matando tumores CPCNP, representando agente multifuncional prometedor further fototerapias CPCNP. Además, con irradiación NIR, CoFe₂O₄-QDs matan CPCNP mainly through inducing ROS generation via regulating Bcl-2/Bax expression through upstream PI3K/AKT signaling pathway. Respecto capacidad eliminación tumoral in vivo, CoFe₂O₄-QDs combinado NIR elimina completamente xenoinjertos tumorales CPCNP sin efectos tóxicos obvios. Estos hallazgos prueban CoFe₂O₄-QDs posee aplicaciones prometedoras desarrollarse reactivo novedoso eliminación CPCNP.

Conclusión

En definitiva, CoFe₂O₄-QDs sintetizados exhiben efectos sinérgicos PTT/PDT superiores suprimiendo CPCNP induciendo generación ROS regulando vía PI3K/AKT, arrojando luz investigación mecanismo y aplicaciones establecimientos fotosensibilizadores novedosos.