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Vesículas etosomales biocompatibles cargadas con nanopartículas de ácido 5-aminolevulínico / Au para terapia fotodinámica / fototérmica sinérgica transdérmica in vitro de cicatrices hipertróficas

Resumen

La vesícula etosomal cargada con nanopartículas de ácido 5-aminolevulínico / Au biocompatible (A / A-ES) se prepara mediante ultrasonidos para la terapia fotodinámica / fototérmica transdérmica sinérgica (PDT / PTT) de la cicatriz hipertrófica (HS). Utilizando ultrasonidos, las nanopartículas de Au (AuNP) se sintetizan y se cargan simultáneamente en vesículas etosomales (ES) sin agentes tóxicos, y el ácido 5-aminolevulínico (ALA) también se carga en ES con el 20% de la eficiencia de atrapamiento (EE). El A / A-ES preparado muestra una fuerte absorbancia en 600-650 nm debido al efecto de acoplamiento plasmónico entre los AuNP vecinos en el mismo A / A-ES, que puede estimular simultáneamente A / A-ES para producir calor y mejorar los rendimientos cuánticos de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante el uso de láser de 632 nm. El estudio de penetrabilidad transdérmica in vitro demuestra que A / A-ES actúa como un portador de fármacos altamente eficaz para mejorar la penetración de ALA y AuNP en el tejido de HS . Tomando fibroblastos de cicatriz hipertrófica humana (HSF) como dianas terapéuticas, la TFD / PTT sinérgica de HS indica que A / A-ES podría mejorar los rendimientos cuánticos de ROS por efecto fototérmico y resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR) de AuNP, lo que da como resultado un nivel alto de apoptosis o necrosis. En una palabra, el A / A-ES preparado muestra una mejor eficiencia sinérgica PDT / PTT para HSF que la PDT y PTT individuales, lo que alienta la perspectiva para el tratamiento de HS.

Antecedentes

La cicatriz hipertrófica (HS), un problema común e inevitable después de una lesión dérmica cutánea, tiene una dermis fibrótica mucho más gruesa que la piel normal [1, 2]. Histopatológicamente, la HS muestra los aumentos de fibroblastos cicatriciales hipertróficos (HSF), que están dispuestos en patrones ondulados, orientados a la superficie epitelial y forman estructuras nodulares [3]. Aunque varios tratamientos están disponibles clínicamente, existen muchos desafíos en los tratamientos de HS debido a las numerosas limitaciones. La terapia de inyección intralesional se usa ampliamente para las prácticas clínicas. Sin embargo, está limitado tanto por operaciones incómodas como por efectos secundarios, como hipopigmentación permanente y atrofia de la piel [4]. La presoterapia se limita a los efectos secundarios, como la isquemia tisular, así como a la disminución del metabolismo tisular [5]. Para superar estas limitaciones, la terapia con láser sirve como una modalidad tópica y no invasiva que se ha desarrollado y aplicado en tratamientos de HS durante más de 25 años, aprovechando las ventajas de la irradiación con láser [6]. Generalmente, la terapia con láser se puede dividir en terapia fotodinámica (TFD) y terapia fototérmica (PTT) según los diferentes principios.

La TFD se ha utilizado para tratar la HS con las ventajas de su alta selectividad y pocos efectos secundarios [7]. Su principio evoluciona en dos pasos:(a) los fotosensibilizadores se agregan preferentemente en HSF y (b) bajo la irradiación de un láser apropiado, los fotosensibilizadores producen especies citotóxicas de oxígeno reactivo (ROS) que conducen a la apoptosis de HSF [8, 9]. Entre varios fotosensibilizadores, se ha demostrado que el ácido 5-aminolevulínico (ALA) es un excelente candidato para la modalidad de tratamiento local en dermatología sin efectos secundarios significativos. Por lo tanto, la TFD basada en ALA (ALA-PDT) se ha utilizado ampliamente en el tratamiento de la HS con el permiso de comercialización de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. En 2010 [10]. Sin embargo, su eficacia es controvertida por dos limitaciones:(a) la escasa penetrabilidad del ALA tanto en el tejido HS como en el HSF y (b) los bajos rendimientos cuánticos de ROS. Para producir un efecto marcado, se aplica en la clínica un ALA de alta dosis o un láser de alto nivel. Desafortunadamente, el ALA en dosis altas daña la glándula sebácea y la epidermis, y el láser de alto nivel tiende a dañar los tejidos sanos. Por lo tanto, se ha prestado mucha atención a mejorar la penetrabilidad de ALA y los rendimientos cuánticos de ROS en el tratamiento con TFD de HS. Recientemente, se ha descubierto que las vesículas etosomales (EE), un liposoma diseñado específicamente, pueden superar la barrera en la HS para la administración tópica y lograr un progreso significativo [11, 12]. En nuestro trabajo anterior, el ES cargado con ALA preparado (ALA-ES) es capaz de entregar mucho más ALA en HS en comparación con el sistema de solución hidroalcohólica tradicional [13]. Por lo tanto, la EE puede mejorar la penetrabilidad del ALA para mejorar la eficacia de la TFD de la HS. Mientras tanto, una nueva modalidad de tratamiento sinérgico, que combina TFD con PTT, promete mejorar tanto los rendimientos cuánticos de ROS como la eficacia del tratamiento de HS.

PTT es también un enfoque teranóstico extraordinario para diversas enfermedades [14, 15]. Hasta ahora, se ha aplicado con éxito en el tratamiento clínico de la HS [16]. Su mecanismo evoluciona recolectando energía de la luz, generando calor y luego dando como resultado la vaporización del tejido, la coagulación, la apoptosis de HSF y la desnaturalización del colágeno. Sin embargo, el PTT tiene efectos secundarios graves en el tratamiento de la HS, como supuración, ulceración y ardor, debido a su escasa selectividad hacia el tejido de la HS con láser de alto nivel [4]. Recientemente, PTT, nanotecnología puente, ha sido considerada como un tratamiento potencial de HS con efecto fototérmico altamente selectivo y mínimamente invasivo. Y lo que es más importante, basado en nanopartículas de Au (AuNP) como agentes fotoadsorbentes efectivos, se ha confirmado que el PTT mejora los rendimientos cuánticos de ROS por dos razones:(a) el PDT térmico aumenta significativamente la muerte celular apoptótica al mejorar la generación de ROS en una temperatura -dependiente, y [17] (b) AuNPs pueden conjugar con ALA y mejorar los rendimientos cuánticos de ROS debido a la resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR) [18, 19]. Por lo tanto, la terapia fotodinámica / fototérmica sinérgica (TFD / PTT) basada en ALA / AuNP promete superar las limitaciones actuales de la TFD y la PTT en el tratamiento de la HS.

Recientemente, la TFD / PTT sinérgica basada en AuNP se ha utilizado ampliamente en diversas terapias contra el cáncer mediante inyecciones [20, 21]. A diferencia de los cánceres, el HS es adecuado para la administración tópica [22]. Sin embargo, los haces de colágeno en la dermis de HS presentan grandes barreras para la penetración de ALA y AuNP, lo que restringe la eficacia del tratamiento sinérgico PDT / PTT para HS. Por lo tanto, cómo hacer que ALA y AuNP penetren simultáneamente en la HS es fundamental para la TFD / PTT sinérgica con máxima eficacia terapéutica y mínimo efecto secundario [23, 24]. Además, un PDT / PTT sinérgico basado en ALA / AuNP adecuado también debe satisfacer las siguientes condiciones:(a) Los AuNP pueden generar calor mediante el láser He-Ne que se utiliza en ALA-PDT, y (b) el sistema de administración debe ser alto biocompatible. Sin embargo, los diversos fotosensibilizadores / AuNP notificados no se pueden aplicar mediante una administración transdérmica tópica y un tratamiento de HS para la penetrabilidad y la mala biocompatibilidad [25].

En este documento, se desarrolla ES cargado con ALA / AuNP (A / A-ES) con excelente biocompatibilidad y penetrabilidad para PDT / PTT sinérgico de HS en este trabajo. El A / A-ES biocompatible se prepara mediante AuNP y ES cargados con ALA mediante un proceso de ultrasonidos sin ningún agente tóxico. El A / A-ES preparado muestra una fuerte absorbancia en el rango de 600 a 650 nm, como resultado del acoplamiento plasmónico entre los AuNP vecinos cocargados en A / A-ES. Esto permite el uso de láser He-Ne para estimular A / A-ES para generar simultáneamente calor y ROS, lo que podría promover la apoptosis de HSF. A / A-ES muestra una excelente penetrabilidad para administrar simultáneamente ALA y AuNP en HS en el estudio in vitro. Por último, tomando HSF como objetivo, se investiga la eficacia in vitro de la PDT / PTT para HS mediante la acumulación de protoporfirina IX intracelular (PpIX), los rendimientos cuánticos de ROS y la apoptosis de HSF. Además, TEM también observa la penetrabilidad en HSF. Debido al efecto sinérgico, A / A-ES facilita que tanto ALA como AuNP penetren simultáneamente en HS y HSF, provocando un mayor nivel de apoptosis celular en comparación con PTT o PDT individuales. En una palabra, A / A-ES es un sistema de administración transdérmica prometedor para la administración tópica de ALA y AuNP, tiene un gran potencial en la TFD / PTT sinérgica de HS y abre una nueva ventana para el tratamiento de HS.

Resultados y discusiones

La caracterización de A / A-ES

La ecografía fue el parámetro clave en la preparación de A / A-ES por dos razones:(a) los AuNP se podían formar mediante ultrasonidos sin ningún agente tóxico, lo que dotó a A / A-ES de biocompatibilidad; (b) la ecografía podría reorganizar las bicapas lipídicas para formar más vesículas con tamaños pequeños y núcleos internos relativamente más grandes, lo que podría cargar más ALA y AuNP. En este trabajo, los AuNP se formaron como se describe en los siguientes esquemas:(a) radicales H • y OH • altamente reactivos se generaron dentro de las burbujas mediante la homólisis de H 2 O (Ec. 1), (b) los radicales oxidantes H • podrían abstraer el alfa H del CH 3 CH 2 OH y forman un radical reductor CH 2 • CH 2 OH (Ec. 2), y (c) durante una pirólisis dentro de las burbujas, el radical CH 2 • CH 2 OH podría reducir Au 3+ para formar AuNP (Ec. 3) [26].

$$ {\ mathrm {H}} _ 2 \ mathrm {O} \ to \ mathrm {H} \ bullet + \ mathrm {OH} \ bullet $$ (1) $$ \ mathrm {H} \ bullet + {\ mathrm {CH}} _ 3 {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {OH} \ to {\ mathrm {CH}} _ 2 \ bullet {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {OH} + {\ mathrm {H} } _2 $$ (2) $$ {\ mathrm {Au}} ^ {3 +} + {\ mathrm {CH}} _ 2 \ bullet {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {O} \ mathrm {H} + \ mathrm {OH} \ bullet \ to \ mathrm {AuNPs} + {\ mathrm {CH}} _ 3 {\ mathrm {CH}} _ 2 \ mathrm {O} \ mathrm {H} + {\ mathrm {H}} _2 \ mathrm {O} $$ (3)

Al principio, A / A-ES se verificó mediante UV-Vis (Fig. 1a). Tenía una fuerte absorbancia en el rango de 600-650 nm, como resultado del acoplamiento plasmónico entre AuNPs vecinos en el mismo A / A-ES [20]. Por lo tanto, podría usar irradiación láser de 632 nm para simultáneamente PDT y PTT para HS. Además, A / A-ES exhibió una distribución de tamaño relativamente estrecha y el tamaño promedio fue de 166 ± 83 nm, según el análisis DLS en la Fig. 1b. Curiosamente, se atribuyeron dos distribuciones de tamaño a los AuNP y A / A-ES descargados. Además, la gran diferencia entre dos distribuciones sugirió que la cantidad de A / A-ES era mucho mayor que la de AuNP descargados. La eficiencia del PDT dependía de la cantidad de ALA cargada en A / A-ES. Beneficiándose del método de carga activa de gradiente de pH transmembrana, el EE de ALA fue del 20%, que fue más alto que el de los trabajos publicados (menos del 10%) [27]. También se estudió la morfología de A / A-ES. En las imágenes SEM (Fig. 1c), A / A-ES apareció como vesículas lamelares esféricas intactas con un tamaño de 200 nm, y las AuNP se pudieron observar y cargar claramente en ES. Además de los AuNP, las laminillas se extendieron hasta la superficie de AuNP en la Fig. 1d, que era la característica de ES [28, 29]. Además, el A / A-ES preparado cargando diferentes números de AuNP tenían tamaños similares en el archivo adicional 1:Figura S1. Por lo tanto, A / A-ES se ajustó a la estructura estable y deformable bajo ultrasonidos, lo que facilita que A / A-ES se apriete a través del espacio estrecho en HS. En resumen, A / A-ES se preparó con éxito con un 20% de EE de ALA y una fuerte absorbancia a 600–650 nm. Su morfología también sería muy propicia para la penetrabilidad, que estaba en concordancia con el estudio de PDT / PTT in vitro en los siguientes.

un Espectros UV-Vis de ES, ALA y A / A-ES. b La distribución de tamaño de A / A-ES preparado. c , d Las imágenes SEM y TEM de A / A-ES

Estudio de penetrabilidad transdérmica in vitro de A / A-ES

La retención de A / A-ES fue un parámetro importante para evaluar la penetrabilidad y la eficiencia del tratamiento de A / A-ES. Por lo tanto, se investigó la cantidad de retención de ALA y AuNP en HS con diferentes tiempos mediante el uso de células de difusión de Franz. Como se muestra en la Fig. 2a, tanto ALA como AuNP alcanzaron rápidamente la retención máxima en las primeras 2 h, debido a la función de mejora de la penetración de ES. Después de alcanzar el máximo, las retenciones tanto de ALA como de AuNP disminuyeron continuamente porque A / A-ES penetró a través de todo el HS. Los resultados indicaron que el A / A-ES tenía suficiente penetrabilidad. En comparación con la dosis aplicada de ALA (2 mg), el 48% de ALA estaba en tejido HS, lo que favorecía la TFD de HS. Además, los mismos cambios de retención entre ALA y AuNP sugirieron que tanto ALA como AuNP se cargaron en ES de manera consistente con los resultados de los microscopios. Según el resultado, 2 h fue un tiempo de administración adecuado para uso tópico con la cantidad máxima de retención de A / A-ES. En nuestros trabajos anteriores, SE había sido considerado como un portador de fármacos altamente eficaz para mejorar la penetración del fármaco en el tejido de HS [13]. Por lo tanto, también se estudió la distribución y acción de A / A-ES en HS utilizando TEM en este trabajo. Como se muestra en la Fig. 2b, A / A-ES, como estructura intacta, se encontró en la dermis, lo que indica que A / A-ES podría penetrar de manera estable a través de la epidermis y en la dermis HS. En la dermis inferior que se muestra en la Fig. 2c, los ES y AuNP se observaron como un estado de separación, lo que sugiere que A / A-ES liberaría tanto ALA como AuNP. Curiosamente, las AuNP podrían ser agregadas en la dermis aunque no estuvieran cargadas en ES. Además, se encontró que más AuNP se acumulaban en la dermis en la Fig. 2d, lo que podría proporcionar el acoplamiento plasmónico entre AuNP vecinas para recolectar energía luminosa y generar calor. En resumen, el estudio de penetrabilidad transdérmica in vitro demostró que A / A-ES era un portador de fármacos altamente eficaz para mejorar la penetración de ALA y AuNP en el tejido HS, y las AuNP agregantes en la dermis estaban a favor de generar calor [20]. Por lo tanto, el A / A-ES mostró un gran potencial en PDT / PTT sinérgico para HS.

un la cantidad de retención de ALA y AuNP. b La distribución de A / A-ES en tejido HS. c La distribución de ES y AuNP en tejido HS. d AuNPs que se acumulan en el tejido HS

PDT / PTT in vitro de HSF

Ensayo de biocompatibilidad

Aunque la biocompatibilidad de las AuNP ha sido bien probada en un trabajo publicado, la biocompatibilidad de A / A-ES con HSF también debe estudiarse en este trabajo [30, 31]. Se incubaron diferentes concentraciones de ALA-ES, Au-ES y A / A-ES (según las concentraciones de ALA de 0,1 a 10 mM, Au-ES era la misma concentración de AuNP que A / A-ES) con HSF durante 12 h sin irradiación. El resultado mostró que no había citotoxicidad oscura en las concentraciones de no más de 2,0 mM con tasas de supervivencia celular superiores al 90%. Cuando las concentraciones fueron superiores a 2,0 mM, se detectó una ligera disminución en las tasas de supervivencia celular. Los resultados mostraron que A / A-ES tenía una excelente biocompatibilidad, y la TFD / PTT debe realizarse a una concentración de 2,0 Mm en los siguientes estudios (ca. 14% A / A-ES en medios de cultivo, v / v .) Fig. 3.

La viabilidad celular de HSF tras el tratamiento con ALA-ES, Au-ES y A / A-ES en la oscuridad durante 12 h

PDT / PTT para HSF

A / A-ES podría superar las barreras de permeabilidad de la superficie mediante la fusión de A / A-ES con la membrana HSF y luego liberar el ALA y AuNP directamente en el citoplasma celular [32]. Según el mecanismo de ALA-PDT, el ALA liberado de A / A-ES podría convertirse en PpIX en el citoplasma HSF. Con láser, PpIX produjo ROS citotóxicos que conducen a la apoptosis celular. Por lo tanto, se utilizó CLSM para estudiar la acumulación tanto de PpIX como de ROS en la figura 4 [33, 34]. Antes de la irradiación con láser, la fluorescencia roja de PpIX se distribuía principalmente en el citoplasma de HSF. La PpIX en HSF tratada con ALA-ES y A / A-ES fue mucho más que la PpIX autóloga en HSF tratada con Au-ES. Además, apenas se encontraron ROS en todos los HSF sin irradiación con láser, lo que también fue razonable. Después de la irradiación con láser, se redujeron las intensidades de PpIX en HSF tratado con ALA-ES y A / A-ES, y las ROS en estas células se pudieron encontrar fácilmente con gran intensidad. Mientras tanto, el HSF tratado por Au-ES no tuvo respuesta en PpIX y ROS porque no tenían suficiente PpIX autólogo. Curiosamente, A / A-ES podría promover más generación de ROS que ALA-ES en una comparación de la intensidad de ROS, que se atribuyó a los AuNP. Además, la morfología celular también proporcionó más información. El HSF tratado con ALA-ES presentó eumorfismo, mientras que el HSF tratado con Au-ES mostró protuberancias insalubres de la membrana plasmática. Por el contrario, el HSF tratado por A / A-ES se mostró como “ampollas” que sobresalían y se retraían, que era la característica de las células moribundas [35]. Estas diferencias en la generación de ROS y la morfología celular se atribuyeron al PTT basado en AuNP, que también se investigó mediante imágenes infrarrojas en la figura 5. De acuerdo con el mecanismo de AuNPs-PTT, AuNP en el citoplasma HSF podría absorber láser de 632 nm y generar suficiente calor para provocar la apoptosis o necrosis de las células bajo irradiación. Por lo tanto, los efectos fototérmicos de ALA-ES, Au-ES y A / A-ES se controlaron mediante el uso de una cámara termográfica de infrarrojos. En comparación, ALA-ES, Au-ES y A / A-ES obviamente tenían una temperatura más alta (41,3 ° C para Au-ES y A / A-ES, 36,5 ° C para ALA-ES) tras la irradiación. Después de que se retiró el láser, las temperaturas de todos disminuyeron rápidamente a un valor normal en 1 minuto, lo que sugiere que el tratamiento con irradiación con láser podría ser seguro [36]. Por lo tanto, los AuNP cargados en ES podrían proporcionar un PTT eficaz, que también se obtiene mediante un ensayo de apoptosis y necrosis. En resumen, A / A-ES podría mejorar los rendimientos cuánticos de ROS y proporcionar el efecto fototérmico para lograr una excelente eficiencia del tratamiento sinérgico PDT / PTT para HSF.

Imágenes confocales de HSF tratadas con ALA-ES, Au-ES y A / A-ES durante 6 h y seguidas sin / con irradiaciones. La barra de escala es de 100 μm

. Imágenes microscópicas infrarrojas de HSF tratado con ALA-ES, Au-ES y A / A-ES durante 6 h bajo ( a ) y después de la irradiación ( b )

Ensayo de apoptosis y necrosis

La eficacia de PDT / PTT se estudió más a fondo mediante la apoptosis y necrosis de HSF tratado con ALA-ES, Au-ES y A / A-ES bajo irradiación con láser. Se llevó a cabo un ensayo de apoptosis usando el análisis de citometría de flujo de Anexina V-FITC y tinción doble con yoduro de propidio (PI) (Fig. 6). Los resultados de un control mostraron que la irradiación con láser no afectó la viabilidad celular (Fig. 6a). Antes de irradiar, ALA-ES, Au-ES y A / A-ES mostraron una buena biocompatibilidad. Después de la irradiación, la proporción de HSF tratada con ALA-ES, Au-ES y A / A-ES tanto de necrosis como de apoptosis tuvo diferencias significativas. Brevemente, hubo una fracción más alta tanto de necrosis como de apoptosis de HSF tratada con A / A-ES, que estaba en consistencia con el resultado de CLSM. En la Fig.6e, el análisis estadístico de los experimentos reveló que la muerte celular necrótica aumentó al 61,8% con el tratamiento con A / A-ES, lo que indica que A / A-ES tenía una mejor eficiencia sinérgica de TFD / PTT para HSF que la TFD individual ( 47,7% de muerte de células necróticas) y PTT (24,3% de muerte de células necróticas). Curiosamente, el resultado también indicó que la TFD desempeñó un papel más eficaz en el tratamiento de la HS en comparación con la PTT, y la PTT basada en AuNP podría ayudar al efecto de la TFD. Estos resultados podrían explicarse como que A / A-ES podría mejorar los rendimientos cuánticos de ROS y proporcionar el efecto fototérmico para lograr una excelente eficiencia del tratamiento sinérgico PDT / PTT para HSF. Aunque el EE de ALA en A / A-ES fue mucho más bajo que el de ALA-ES (20 frente a 54%), hubo muerte celular necrótica similar tanto de A / A-ES como de ALA-ES (61,8 frente a 78 %). Este resultado podría explicarse porque A / A-ES podría mejorar los rendimientos cuánticos de ROS por efecto fototérmico y LSPR de AuNP.

Ensayo de apoptosis de HSF tratado con ALA-ES ( b ), Au-ES ( c ) y A / A-ES sin / con irradiación láser ( d ), y el análisis estadístico de necrosis y necrosis vivas, apoptóticas tempranas y apoptóticas tardías ( e ). un fue el control. Láser (-) y (+) significan sin / con irradiación láser

Visualización de A / A-ES en HSF

Los cambios detallados de la morfología y estructura de HSF causados ​​por PDT / PTT también fueron investigados por microscopía óptica y TEM en la Fig. 7. Antes de irradiar, HSF tratado con crecimiento A / A-ES bien, adherencia firme de eumorfismo, indicando A / A- ES tuvo una excelente biocompatibilidad como se esperaba (Fig. 7a). En su imagen TEM, además de varios orgánulos en el citoplasma normal, el HSF tratado tenía una gran cantidad de AuNP que se agregaba en el citoplasma celular (los marcos en blanco en la Fig. 7c). Se podría explicar que la fusión de A / A-ES con membranas celulares podría entregar más AuNP y ALA en HSF. Por lo tanto, los AuNP podrían actuar como la fuente fototérmica más eficaz debido a un efecto de acoplamiento plasmónico más fuerte y mejorar los rendimientos cuánticos de ROS por LSPR. Curiosamente, como se muestra en el marco de trazos de la Fig. 7c, algunos AuNP estaban fuera de HSF debido a exocitosis, lo que demostró la excelente biocompatibilidad de A / A-ES una vez más. Después de la irradiación, HSF mostró la característica de células moribundas, es decir, las protuberancias de la membrana plasmática (Fig. 7b) [37]. Debido a ROS y al efecto fototérmico, la inflamación de las mitocondrias y la ruptura de la membrana externa, como los otros indicadores de muerte por HSF, se encontraron en el citoplasma de HSF (Fig. 7d) [35]. Además, también se encontró ES con su estructura de membrana característica (marcos rojos en la Fig. 7d). En resumen, A / A-ES podría facilitar la penetración de ALA y AuNP en HSF y destruir HSF mediante PDT / PTT sinérgico.

Las imágenes de microscopía óptica de HSF tratadas con A / A-ES antes ( a ) y después de la irradiación ( b ). Imágenes TEM de HSF tratadas con A / A-ES antes ( c ) y después de la irradiación ( d )

Conclusiones

Se preparó fácilmente A / A-ES biocompatible para PDT / PTT sinérgico in vitro de HS penetrando en HS y destruyendo HSF. Utilizando ultrasonidos, los AuNP se sintetizaron y cargaron simultáneamente en ausencia de agentes tóxicos. A / A-ES tuvo una fuerte absorbancia en 600-650 nm como efecto de acoplamiento plasmónico entre AuNPs vecinos en el ES con un alto EE para ALA (ca. 20%). El estudio de penetrabilidad transdérmica in vitro demostró que A / A-ES era un portador de fármacos altamente eficaz para mejorar la penetración de ALA y AuNP en el tejido de HS . PDT / PTT in vitro para HSF indicó que A / A-ES podría mejorar los rendimientos cuánticos de ROS por efecto fototérmico y LSPR de AuNP, causando un alto nivel de apoptosis o necrosis celular. En una palabra, A / A-ES biocompatible tuvo una mejor eficiencia sinérgica TFD / PTT para HSF que la TFD y PTT individuales, lo que fomenta la perspectiva para el tratamiento de la HS. El trabajo adicional se centrará en el estudio in vivo de PDT / PTT sinérgico para HS en modelos de cicatrices, y el trabajo relevante está en curso.

Experimentos y métodos

La preparación de A / A-ES

Ciento ochenta miligramos de fosfatidilcolina (PC, lecitina de soja al 95,8%, Lipoid GmbH, Alemania) disueltos en 1,8 ml de CH 3 CH 2 OH, 0,6 ml de HAuCl 4 (10 mM, Aladdin, Shanghai, China) y 3,6 ml de solución tampón de citrato de ALA (CBS, 0,01 M, 12 mg de ALA, pH 4,0), a su vez, se añadieron gota a gota a la solución de PC. La mezcla se agitó a 700 rpm durante 10 min para preparar la solución precursora. Como se muestra en el Esquema 1, la solución precursora se puso en un entorno ultrasónico a 200 W durante 30 min, hasta que adquirió un color rojo vino brillante. Luego, la solución de reacción se llevó a cabo con una centrífuga (8000 rpm, 20 min) para eliminar el HAuCl 4 residual. y PC. Por último, la deposición se volvió a dispersar en 3 ml de solución hidroalcohólica de ALA (ALA-HA, 2 mg / ml de ALA, etanol al 30%) y se incubó mediante un método de carga activa de gradiente de pH transmembrana de acuerdo con nuestro trabajo anterior [13]. En la incubación, una gran cantidad de ALA sindicalizado exterior se difundió a través de las bicapas de ES en el núcleo acuoso ácido interno de ES, y luego, se protonaron y atraparon en ES. Después de la incubación, se ha preparado A / A-ES. En este trabajo, ALA-ES se preparó de acuerdo con nuestro trabajo anterior con la misma concentración de ALA que A / A-ES. Se preparó ES cargado con AuNP (Au-ES) como A / A-ES sin ALA con la misma concentración de AuNP que A / A-ES.

Diagrama esquemático de la preparación de A / A-ES

La caracterización de A / A-ES

A / A-ES se tiñeron negativamente con ácido fosfotúngstico (1,5% en peso) y luego se observaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEOL, Japón, voltaje de aceleración de 120 kV). A / A-ES también se examinó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, JEOL, Japón, voltaje de aceleración de 10 kV). La distribución de tamaño A / A-ES se determinó mediante análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) en un sistema de inspección NiComp 380ZLS (Nicomp, EE. UU.). El ALA se determinó mediante un enfoque de derivatización de fluoresceamina, y el detalle se muestra en el archivo adicional 1. La eficiencia de atrapamiento (EE) de ALA determinada por un método de ultrafiltración se muestra en el archivo adicional 1. Finalmente, los espectros UV-Vis se llevaron a cabo en un Espectrofotómetro Varian Cary 50 UV-Vis (Perkin Elmer, EE. UU.).

Estudio de penetrabilidad in vitro de Franz Diffusion Cells

El estudio de penetrabilidad de A / A-ES se llevó a cabo utilizando células de difusión de Franz con 2,8 cm 2 área de permeación efectiva. Las células receptoras, incluidos los compartimentos donante y receptor, se mantuvieron a 37 ° C mediante un baño de agua circulante. Los tejidos de HS se recolectaron con consentimiento informado en el Noveno Hospital Popular de Shanghai y las pautas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 aprobadas por el Noveno Hospital Popular de Shanghai. Se montó tejido HS fresco sin tejido graso (menos de 24 h después de la escisión) en un compartimento receptor con el estrato córneo hacia arriba hasta el compartimento donante. Se añadió un mililitro de A / A-ES al compartimento donante y, a continuación, se cubrió el compartimento donante con parafilm para evitar la evaporación. Después de la penetración con diferente tiempo, los tejidos de HS se lavaron rápidamente para eliminar el A / A-ES residual en la superficie de HS. Para acumular la cantidad de retención de ALA y AuNP en HS, los tejidos de HS se cortaron en trozos pequeños y el ALA de los tejidos de HS se extrajo mediante diálisis en PBS durante 24 h. Las soluciones de extracto se analizaron para determinar la cantidad de retención de ALA en tejido HS. Los tejidos HS retenidos en las bolsas de diálisis también se analizaron para determinar la cantidad de retención de AuNP mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Después de permear con ALA-ES durante 2 h, el tejido de HS se lavó, se prefijó, se deshidrató, se infiltró y se post-fijó. Después de incrustados en resinas epoxi, se cortaron en ultrasecciones (50 nm de espesor, perpendiculares a la epidermis) y se observaron utilizando TEM a un voltaje de aceleración de 120 kV.

PDT / PTT in vitro para HSF

Cultivo celular

El HSF se aisló y cultivó mediante un método común de la siguiente manera:los trozos de tejido HS frescos (1 mm 3 , menos de 6 h después de la escisión) se digirieron usando colagenasa tipo I (Invitrogen, EE. UU.) para lograr una suspensión de células individuales. El HSF creció en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, EE. UU.) Que contiene un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco, EE. UU.) A 37 ° C y un 5% de CO 2 . El medio de cultivo debe cambiarse cada 3 días, y las células se pasaron cuando el 80% de confluencia. Los pases de dos y tres celdas se utilizaron en los siguientes experimentos.

Ensayo de biocompatibilidad

En la evaluación de la biocompatibilidad de A / A-ES, se sembraron HSF en placas de 96 pocillos a 2 × 10 3 células / pocillo. El medio de cultivo se reemplazó con medio libre de FBS y ALA-ES, Au-ES y A / A-ES recién preparados en diferentes concentraciones, respectivamente. Después de 12 h, se midió la viabilidad celular utilizando un kit de recuento celular 8 (CCK-8, Dojindo, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Procedimiento PDT / PTT

Se sembraron HSF en placas de 12 pocillos a 4 × 10 4 células / pocillo. Después de 12 h, los medios de cultivo, respectivamente, que contienen ALA-ES, Au-ES y A / A-ES recién preparados (14%, v / v ), se reemplazaron con el medio libre de FBS durante 6 h. Después del tratamiento, HSF se lavó con PBS y se incubó en medio de cultivo durante 1 h. Luego, fueron irradiados por láser He-Ne (longitud de onda de 632 nm, 40 mW / cm 2 , Instituto de Tecnología Láser de Shanghai, China) con 20 min. Luego, el medio de cultivo se reemplazó con DMEM reciente que contenía FBS al 10% durante otras 24 h en preparación para experimentos posteriores. Además, HSF tratado con A / A-ES e irradiación fue prefijado, deshidratado e incrustado para preparar ultrasecciones para el examen TEM.

Ensayo de generación intracelular de PpIX y ROS

La acumulación intracelular de PpIX y la generación de ROS en HSF se detectaron utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM, Leica TCS SP5, Alemania). El ensayo de generación de ROS se realizó utilizando un DCFH-DA y siguió las instrucciones del fabricante. El cubreobjetos con células se montó en un portaobjetos de vidrio y se observó a 405 nm de excitación / 635 nm de emisión para PpIX y 488 nm de excitación / 560 nm de emisión para ROS. Todos los datos fueron analizados por el software LAS AF.

Ensayo de apoptosis y necrosis

La apoptosis y necrosis de HSF se analizaron mediante citometría de flujo después de la tinción doble con anexina V-FITC y la tinción doble con yoduro de propidio (PI). Las muestras se prepararon de acuerdo con el protocolo del kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC / PI y luego se analizaron por BD FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, EE. UU.). El análisis de datos se realizó con el software FlowJo 7.6.

Análisis estadístico

Los datos se presentaron como media ± DE, a menos que se indique lo contrario. La significancia estadística se determinó mediante una prueba de estudiante de dos colas ( P <0.05) a menos que se indique lo contrario.

Abreviaturas

A / A-ES:

Vesícula etosomal cargada con nanopartículas de ácido 5-aminolevulínico / Au

ALA:

Ácido 5-aminolevulínico

ALA-ES:

ES cargado con ALA

ALA-PDT:

PDT basado en ALA

Au-ES:

ES cargado con AuNP

AuNPs:

Nanopartículas de Au

CLSM:

Microscopía de escaneo láser confocal

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

EE:

Eficiencia de atrapamiento

ES:

Vesículas etosomales

FBS:

Suero fetal bovino

HS:

Cicatriz hipertrófica

HSF:

Fibroblastos de cicatriz hipertrófica

ICP-MS:

Espectrometría de masas de plasma de acoplamiento inductivo

LSPR:

Resonancia de plasmón de superficie localizada

PDT:

Terapia fotodinámica

PDT / PTT:

Terapia fotodinámica / fototérmica

PpIX:

Protoporfirina IX

PTT:

Terapia fototérmica

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión


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