Vesículas etosomales biocompatibles co-cargadas con ácido 5-aminolevulínico y nanopartículas oro: estrategia sinérgica fotodinámica/fototérmica transdérmica para tratamiento cicatrices hipertróficas

Resumen

Reportamos vesícula etosomal biocompatible (A/A-ES) co-cargada con ácido 5-aminolevulínico (ALA) y nanopartículas oro (AuNP) preparada por ultrasonicación sin reactivos tóxicos. A/A-ES exhibe banda absorción plasmónica pronunciada 600–650 nm, habilitando activación simultánea fotodinámica (PDT) y fototérmica (PTT) usando láser 632 nm. Estudios transdérmicos in vitro confirman A/A-ES entrega tanto ALA como AuNP eficientemente en tejido cicatriz hipertrófica (CH), alcanzando 48 % retención ALA tras 2 h. Ensayos celulares con fibroblastos cicatriz hipertrófica (FCH) demuestran A/A-ES eleva marcadamente producción especies reactivas oxígeno (ROS) y generación calor, llevando apoptosis y necrosis mejoradas comparado con PDT o PTT solos. Estos resultados destacan A/A-ES como plataforma tópica prometedora para PDT/PTT sinérgica de CH.

Antecedentes

Cicatrices hipertróficas (CH) surgen de deposición excesiva colágeno dérmico y caracterizadas por piel engrosada, fibrótica que puede deteriorar función y estética. Tratamientos convencionales —incluyendo inyecciones intralesionales, prendas presión, y terapia láser— a menudo sufren eficacia limitada, incomodidad, o efectos adversos como hipopigmentación y atrofia tisular. Terapia fotodinámica (PDT) usando ácido 5-aminolevulínico (ALA) ofrece citotoxicidad selectiva vía generación ROS, aún utilidad clínica limitada por pobre penetración piel y bajo rendimiento ROS. Terapia fototérmica (PTT), particularmente con nanopartículas oro (AuNP) que convierten luz a calor mediante resonancia plasmónica superficie localizada (LSPR), puede amplificar producción ROS y ablar selectivamente tejido cicatriz, pero altas potencias láser arriesgan daño piel circundante.

Combinar PDT y PTT en plataforma única promete beneficios sinérgicos: generación ROS mediada ALA puede amplificarse por calor AuNP, mientras efecto fototérmico puede aumentar temperatura local, incrementando aún más rendimientos ROS. Vesículas etosomales (ES) proveen transportador deformable, base lípido que mejora entrega transdérmica fármacos hidrofílicos y lipofílicos. Trabajos previos demostraron ES cargadas ALA (ALA-ES) superaron significativamente soluciones acuosas entregando ALA a tejido CH. Sin embargo, integrar AuNP en ES manteniendo biocompatibilidad y entrega eficiente permanece desafiante. Aquí presentamos síntesis facile basada ultrasonicación de A/A-ES que encapsula simultáneamente ALA y AuNP sin solventes tóxicos, logrando alta captura ALA (≈20 %) y fuerte absorción 600–650 nm.

Resultados y discusiones

Caracterización A/A-ES

Ultrasonicación sirvió dos propósitos: (1) generó AuNP in-situ vía reducción mediada radicales AuCl₄⁻, obviando agentes reductores tóxicos; (2) indujo reorganización bicapa lipídica, produciendo vesículas pequeñas, uniformemente dimensionadas con amplio núcleo interno para carga fármacos. Espectroscopía UV-Vis confirmó pico absorción fuerte 600–650 nm (Fig. 1a), atribuible a acoplamiento plasmónico entre AuNP adyacentes. Dispersión dinámica luz reveló distribución tamaño estrecha centrada 166 ± 83 nm (Fig. 1b), mientras imágenes SEM/TEM mostraron vesículas intactas, esféricas (~200 nm) con AuNP claramente visibles embebidas en bicapa (Fig. 1c,d). Eficiencia captura (EE) ALA alcanzó 20 %, superando valores reportados formulaciones ES convencionales (<10 %). Estas características sugieren A/A-ES adecuado para atravesar matriz colágeno densa CH.

a Espectros UV-Vis ES, ALA, y A/A-ES. b Distribución tamaño A/A-ES. c, d Imágenes SEM y TEM A/A-ES

Estudio penetrabilidad transdérmica in vitro A/A-ES

Usando celdas difusión Franz, cuantificamos retención ALA y AuNP en tejido CH recién exciado. Ambos agentes alcanzaron pico 2 h, llegando 48 % dosis ALA aplicada dentro tejido (Fig. 2a). Declive concurrente thereafter refleja permeación transdérmica completa. Imágenes TEM (Fig. 2b–d) confirmaron vesículas intactas en dermis, seguidas liberación AuNP que agregaron in-situ —favorable para generación calor bajo irradiación láser. Estos datos establecen A/A-ES como transportador efectivo co-entrega ALA y AuNP en tejido CH.

a Retención ALA y AuNP. b Distribución A/A-ES en tejido CH. c Distribución ES y AuNP. d Acumulación AuNP en tejido CH

PDT/PTT in vitro para FCH

Ensayo biocompatibilidad

Ensayos viabilidad celular revelaron no citotoxicidad significativa A/A-ES concentraciones ≤2,0 mM, supervivencia >90 % tras 12 h (Fig. 3). Dosis mayores causaron solo reducciones modestas, confirmando perfil seguridad formulación y guiando concentración terapéutica 2,0 mM (≈14 % v/v) para experimentos subsiguientes.

Viabilidad celular FCH tras 12 h exposición ALA-ES, Au-ES, y A/A-ES en oscuridad.

PDT/PTT para FCH

Microscopía confocal mostró acumulación robusta protoporfirina IX (PpIX) en FCH tratados ALA-ES y A/A-ES; Au-ES produjo PpIX despreciable (Fig. 4). Bajo irradiación láser 632 nm, fluorescencia PpIX disminuyó mientras señales ROS se intensificaron, especialmente en células tratadas A/A-ES —evidencia generación ROS mejorada vía LSPR AuNP. Cambios morfológicos, como abombamiento membrana, pronunciados en células tratadas A/A-ES, indicando muerte celular. Termografía infrarroja confirmó ALA-ES, Au-ES, y A/A-ES elevaron temperatura local 41,3 °C (Au-ES/A/A-ES) y 36,5 °C (ALA-ES) bajo irradiación, con enfriamiento rápido thereafter (Fig. 5). Estos hallazgos subrayan acciones duales fotodinámica y fototérmica A/A-ES.

Imágenes confocales FCH tratadas ALA-ES, Au-ES, y A/A-ES antes y tras irradiación láser 632 nm.

Imágenes infrarrojas FCH tratadas ALA-ES, Au-ES, y A/A-ES durante y tras irradiación.

Ensayo apoptosis y necrosis

Citometría flujo células teñidas Annexin V/PI reveló A/A-ES irradiado indujo fracción necrótica más alta (61,8 %) comparado ALA-ES (47,7 %) y Au-ES (24,3 %) (Fig. 6). Apoptosis temprana y tardía también elevadas en A/A-ES, reflejando efecto sinérgico amplificación ROS y estrés fototérmico. Estos resultados demuestran cuantitativamente superioridad enfoque combinado PDT/PTT sobre modalidades individuales.

Ensayo apoptosis FCH tratadas ALA-ES, Au-ES, y A/A-ES con/sin láser. Análisis estadístico células vivas, apoptosis temprana, apoptosis tardía, y necróticas.

Visualización A/A-ES en FCH

Microscopía electrónica transmisión reveló agregación extensa AuNP dentro citoplasma FCH tratadas A/A-ES, consistente con fusión vesícula eficiente y liberación carga. Imágenes post-irradiación mostraron abombamientos membrana característicos, mitocondrias hinchadas, y membranas externas rotas —sellos muerte celular (Fig. 7). Estos cambios ultraestructurales confirman A/A-ES entrega efectivamente ALA y AuNP a FCH, llevando muerte celular sinérgica fotodinámica y fototérmica.

Microscopía óptica FCH antes y tras irradiación (a,b). Imágenes TEM antes y tras irradiación (c,d).

Conclusiones

Hemos desarrollado vesícula etosomal biocompatible, sintetizada ultrasónicamente, 5-ALA/AuNP-cargada (A/A-ES) que demuestra fuerte absorción 600–650 nm, alta captura ALA (~20 %), y entrega transdérmica eficiente a tejido CH. Estudios in vitro confirman A/A-ES mejora producción ROS y calentamiento fototérmico, rindiendo apoptosis y necrosis superiores FCH comparado con PDT o PTT solos. Estos hallazgos apoyan A/A-ES como plataforma tópica prometedora para terapia fotodinámica/fototérmica sinérgica cicatrices hipertróficas, justificando futura evaluación in vivo.

Experimentos y métodos

Preparación A/A-ES

Fosfatidilcolina (180 mg) disuelta en 1,8 mL etanol, 0,6 mL 10 mM HAuCl₄, y 3,6 mL 0,01 M tampón ALA-citrato (pH 4,0, 12 mg ALA). Mezcla agitada 700 rpm 10 min, luego sonicada 200 W 30 min hasta color vino-tinto apareció. Centrifugación (8000 rpm, 20 min) removió reactivos no reaccionados, y pellet redispersó en 3 mL solución 2 mg/mL ALA hidroalcohólica. Método carga gradiente pH transmembrana aplicado para atrapar ALA dentro núcleo vesícula, rindiendo A/A-ES final. Para comparación, ALA-ES y Au-ES preparados con idénticas concentraciones ALA o AuNP pero careciendo otro componente.

Caracterización A/A-ES

Tinción negativa 1,5 % p/p ácido fosfotúngstico seguida TEM (JEOL, 120 kV) evaluó morfología. SEM (JEOL, 10 kV) evaluó características superficie. Distribución tamaño medida DLS (Nicomp 380ZLS). Contenido ALA cuantificado vía derivatización fluorescamina, EE calculado por ultrafiltración. Espectros UV-Vis registrados en espectrofotómetro Varian Cary 50.

Estudio penetrabilidad in vitro por celdas Franz

Tejido CH (≤24 h post-excisión) montado en celda Franz con estrato córneo enfrentando compartimento donante. Un mililitro A/A-ES aplicado, y receptor mantenido 37 °C. Tras intervalos definidos, tejido lavado, homogeneizado, y ALA extraído diálisis 24 h. Retención AuNP cuantificada por ICP-MS. Tras 2 h exposición, tejidos procesados para seccionado ultrafino e imágenes TEM.

PDT/PTT in vitro para FCH

Cultivo celular

FCH aislados biopsias CH pacientes usando digestión colagenasa I y cultivados DMEM suplementado 10 % FBS a 37 °C, 5 % CO₂. Células usadas pasos 2–3.

Ensayo biocompatibilidad

FCH (2 × 10³ células/pozo) expuestas diluciones seriadas ALA-ES, Au-ES, o A/A-ES en medio libre FBS por 12 h. Viabilidad celular evaluada con CCK-8.

Procedimiento PDT/PTT

FCH (4 × 10⁴ células/pozo) incubadas 14 % v/v A/A-ES o controles 6 h, luego lavadas e irradiadas láser 632 nm, 40 mW/cm² He-Ne por 20 min. Post-irradiación, células cultivadas DMEM 10 % FBS 24 h antes ensayos subsiguientes.

Ensayo generación PpIX intracelular y ROS

PpIX y ROS visualizados por CLSM (Leica TCS SP5). Tinción DCFH-DA cuantificó ROS, mientras fluorescencia PpIX capturada excitación 405 nm/emisión 635 nm.

Ensayo apoptosis y necrosis

Doble tinción Annexin V-FITC/PI seguida citometría flujo BD FACSCalibur determinó tasas apoptosis y necrosis. Datos analizados con FlowJo 7.6.

Análisis estadístico

Datos presentados media ± DE. Prueba t Student determinó significancia (P < 0,05).

Abreviaturas

A/A-ES:

Vesícula etosomal cargada 5-aminolevulínico/Au nanopartícula

ALA:

Ácido 5-aminolevulínico

ALA-ES:

ES cargada ALA

ALA-PDT:

PDT basado ALA

Au-ES:

ES cargada AuNP

AuNP:

Nanopartículas oro

CLSM:

Microscopía confocal barrido láser

DLS:

Dispersión dinámica luz

DMEM:

Medio Modificado Eagle Dulbecco

EE:

Eficiencia captura

ES:

Vesículas etosomales

FBS:

Suero bovino fetal

CH:

Cicatriz hipertrófica

FCH:

Fibroblastos cicatriz hipertrófica

ICP-MS:

Espectrometría masas plasma acoplado inductivamente

LSPR:

Resonancia plasmónica superficie localizada

PDT:

Terapia fotodinámica

PDT/PTT:

Terapia fotodinámica/fototérmica

PpIX:

Protoporfirina IX

PTT:

Terapia fototérmica

ROS:

Especies reactivas oxígeno

SEM:

Microscopía electrónica barrido

TEM:

Microscopio electrónico transmisión