Biosensor electroquímico de ADN ultra-sensible para detección Vibrio cholerae usando nanopartículas poliestireno-ácido acrílico y nanopartículas oro

Resumen

Reportamos un biosensor electroquímico de ADN altamente sensible para detectar ADN Vibrio cholerae. El sensor usa nanoesferas látex poliestireno-co-ácido acrílico (PSA) cargadas con nanopartículas oro (AuNPs) como matriz portadora ADN. Voltametría pulso diferencial (DPV) con etiqueta oligonucleótido basada antraquinona mide señal hibridación. AuNPs amplifican significativamente corriente faradaica, produciendo respuesta lineal reproducible 1,0×10^-21 a 1,0×10^-8 M (RSD = 4,5%, n = 5) y límite detección (LOD) 1,0×10^-21 M (R² = 0,99). Recuperación muestras espigadas 91% a 109% (n = 3). Sensor retiene 95% respuesta original tras 58 días y reutilizable seis veces con RSD 5% (n = 5).

Antecedentes

Vibrio cholerae sigue siendo amenaza salud global, especialmente entornos bajos recursos. Métodos tradicionales basados cultivo son lentos y laboriosos, mientras PCR requiere equipo costoso y operadores calificados. Diagnósticos rápidos, baratos y altamente sensibles son esenciales para control oportuno brotes. Biosensores electroquímicos ADN ofrecen alta sensibilidad, especificidad y potencial miniaturización, ideales para pruebas punto-atención.

Métodos

Reactivos químicos

Poliestireno, ácido acrílico, HAuCl₄·3H₂O, citrato trisódico y otros reactivos de Fluka, Sigma-Aldrich y Riedel-De Haën. Oligonucleótidos diana, mismatch y reportero sintetizados por Bio Service Unit (NSTDA) y Bioneer.

Aparatos

Medidas DPV realizadas en electrodo carbono impreso pantalla (SPE) con referencia Ag/AgCl y contraelectrodo platino, usando potenciostato Autolab PGSTAT12. Parámetros electroquímicos: paso 0,02 V, barrido 0,5 V s⁻¹, tampón fosfato 0,05 M, pH 7.

Síntesis AuNPs y partículas látex PSA

AuNPs preparados por reducción citrato (método Turkevich). Esferas látex PSA sintetizadas por copolimerización emulsión jabón-libre estireno y ácido acrílico, produciendo partículas sub-micrón (~186 nm) con abundantes grupos carboxilo para unión ADN.

Modificación electrodo e inmovilización ADN

Partículas PSA depositadas por gota sobre SPE, seguido deposición AuNPs. Acoplamiento EDC/NHS en tampón pH 5 activó grupos carboxilo, luego sonda captura 5 µM inmovilizada. Hibridación con 1 µM ADN diana y etiqueta 5 mM antraquinona (AQMS) procedió en dos etapas: captura-diana y unión reportero, cada 1 h.

Optimización

Carga sonda (1-6 µM) y concentración AQMS (0,1-5 mM) optimizadas; 4 µM sonda y 1 mM AQMS dieron respuesta máxima. pH 7, tampón fosfato 0,05 M y 2,0 M NaCl proveyeron condiciones iónicas óptimas. Tiempo hibridación 60 min e inmovilización sonda 8 h seleccionados.

Evaluación rendimiento

Sensor demostró rango lineal 1,0×10^-21 a 1,0×10^-8 M con LOD 1,0×10^-21 M. Tests recuperación muestras espigadas (1,0×10^-4 a 1,0×10^-6 µg µL⁻¹) produjeron 91,4%-108,9% (n = 3). Estudios vida útil mostraron 95% actividad tras 58 días; sensor regenerable con 0,1 M NaOH y reutilizable seis veces con 5% RSD.

Resultados y discusión

SEM confirmó esferas PSA uniformes (~186 nm). Análisis DPV mostró carga AuNP redujo separación potencial pico (ΔEₚ), indicando transferencia electrón mejorada. Experimentos hibridación revelaron aumento marcado corriente pico DPV solo cuando ambas sondas diana y reportero presentes, confirmando especificidad tipo sándwich. Carga sonda óptima y concentración AQMS identificadas; mayores densidades sonda llevaron respuesta meseta, mientras AQMS excesivo causó ruido fondo. pH 7, iones Na⁺ y alta fuerza iónica (2,0 M NaCl) maximizaron eficiencia hibridación.

Curva calibración exhibió excelente linealidad (R² = 0,99). LOD sub-zeptomolar sensor supera sistemas previos basados PSA o avidina-biotina, manteniendo tiempo ensayo rápido (~60 min). Tests estabilidad demostraron pérdida señal mínima 58 días, y protocolos regeneración restauraron actividad completa hasta seis ciclos.

Conclusiones

Hemos desarrollado robusto biosensor electroquímico ADN libre amplificación que detecta ADN V. cholerae concentraciones sub-zeptomolares con alta especificidad y reproducibilidad. Su fabricación simple, tiempo ensayo rápido y larga vida útil lo hacen adecuado despliegue campo entornos brote.