Biosensor electroquímico de ADN ultra-sensible usando nanocompuesto acrílico-oro para determinación rápida del género del pez arowana

Resumen

Este estudio presenta un biosensor electroquímico de ADN ultra-sensible que identifica el género del arowana asiático (Scleropages formosus) con un límite de detección en el rango atto-molar. El sensor emplea microesferas acrílicas funcionalizadas con grupos succinimida y nanopartículas de oro coloidales (AcMP-AuNP) inmovilizadas en un electrodo de carbono impreso en pantalla. Una sonda de ADN aminada se ancla covalentemente a las AcMP, y la hibridación del ADN diana de arowana se cuantifica mediante voltametría de pulso diferencial (DPV) usando ácido antraquinona-sulfónico como etiqueta redox. Bajo condiciones optimizadas, el sensor alcanza un límite de detección de 1,0 × 10⁻¹⁸ M y un rango lineal de 1,0 × 10⁻¹⁸ - 1,0 × 10⁻⁸ M (R² = 0,99) en una hora, constituyendo una herramienta ligera, rentable para diagnóstico in situ en piscicultura.

Antecedentes

El arowana asiático (Scleropages formosus) es una especie de agua dulce apreciada por su valor ornamental y significado cultural en el sudeste asiático y partes de Oceanía. Debido a su alta demanda de mercado, las poblaciones silvestres han sido explotadas intensamente, llevando a su clasificación como en peligro por CITES y la Lista Roja de la UICN. La determinación precisa del género en etapa juvenil es crítica para programas de cría y regulación de mercado, sin embargo, los métodos visuales tradicionales son poco fiables y lentos, y los enfoques PCR convencionales son laboriosos y requieren infraestructura de laboratorio sofisticada.

Los avances recientes en biosensores basados en nanomateriales ofrecen una alternativa prometedora. Al integrar microesferas de polímero acrílico con nanopartículas de oro, podemos crear una plataforma conductiva de alta área superficial que mejora la carga de sondas y la transferencia de electrones, mejorando así la sensibilidad y reduciendo el tiempo de ensayo.

Métodos

Aparatos y electrodos

Las mediciones DPV se realizaron en un potenciostato Autolab PGSTAT 12 usando un electrodo de carbono impreso en pantalla (SPE) modificado con AcMP y AuNP. Se emplearon un electrodo auxiliar de platino y un electrodo de referencia Ag/AgCl (3,0 M KCl). Las soluciones se sonicaron en un baño Elma S30H para asegurar homogeneidad.

Reactivos

Los reactivos clave incluyeron 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPP), 1,6-hexanodiol diacrilato (HDDA), n-butil acrilato (nBA), cloruro de Au(III) trihidrato y NAS. Las nanopartículas de oro coloidales se sintetizaron según Grabar et al. (1995). Las sondas de ADN se prepararon en tampón K-fosfato 0,05 M (pH 7,0) e hibridaron en tampón Na-fosfato 0,05 M (pH 7,0) conteniendo 1,0 mM AQMS y 2,0 M NaCl.

Síntesis de microesferas acrílicas

Las AcMP se produjeron mediante fotopolimerización iniciada por UV en un solo paso de una mezcla conteniendo HDDA, nBA, DMPP y NAS en emulsión acuosa. Tras 10 min de sonicación y 600 s de curado UV bajo N₂, las microesferas se recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces con tampón K-fosfato y se secaron al aire.

Fabricación del biosensor de ADN usando microesferas acrílicas

La superficie del SPE se recubrió primero por gota con una dispersión de AcMP a 3 mg/mL, luego con AuNP coloidales a 5 mg/mL. El electrodo modificado se incubó en una solución de sonda de ADN de arowana aminada a 5 µM durante 6 h, seguido de enjuague exhaustivo. La hibridación con ADNc diana (5 µM) en presencia de 1 mM AQMS y 2 M NaCl procedió durante 1 h antes del análisis DPV en tampón K-fosfato 0,05 M a temperatura ambiente.

Optimización del biosensor electroquímico de ADN de arowana

La inmovilización de la sonda se optimizó variando tiempos de incubación (1-18 h) y tiempos de hibridación (10-100 min). Temperatura, pH, fuerza iónica y valencia del catión se examinaron sistemáticamente para maximizar la respuesta DPV. Las condiciones óptimas fueron: 6 h incubación de sonda, 30 min hibridación a 25 °C, pH 7,0, tampón Na-fosfato 0,05 M, 2 M NaCl y 1 mM AQMS.

Extracción de ADN y análisis de ADN de arowana

Quince muestras de tejido de arowana se extrajeron usando el kit QIAquick PCR Purification. El ADN genómico se amplificó por PCR y verificó en geles de agarosa al 1,5%. Los mismos extractos se probaron con el biosensor; corrientes DPV por encima de la línea base indicaron ADN masculino, mientras que corrientes en la línea base correspondieron a ADN femenino. La significancia estadística se evaluó mediante prueba t (95% confianza).

Resultados y discusión

Las imágenes SEM confirmaron AcMP uniformes y esféricas con distribución de tamaño estrecha. La caracterización electroquímica del SPE modificado demostró un proceso redox reversible, controlado por difusión, con relación lineal entre corriente pico y raíz cuadrada de la velocidad de barrido (R² = 0,996). La respuesta DPV mostró un aumento pronunciado de corriente solo tras hibridación con ADN complementario, confirmando la especificidad de la sonda.

Los estudios de optimización revelaron que la inmovilización de la sonda se estabilizó tras 6 h, mientras que la hibridación alcanzó el equilibrio en 30 min a temperatura ambiente. Temperaturas superiores a 25 °C aceleraron la hibridación pero arriesgaron desnaturalización, por lo que 25 °C se eligió como óptimo. La dependencia del pH mostró señal DPV máxima en pH neutro 7,0; pH más bajos o altos redujeron la eficiencia de hibridación. Entre los cationes probados, Na⁺ proporcionó la mejor mejora, probablemente debido a precipitación mínima y apantallamiento electrostático favorable. El análisis de fuerza iónica identificó 2 M NaCl y tampón Na-fosfato 0,05 M como tampón de hibridación óptimo.

Determinación del género del pez arowana con biosensor de ADN

Al aplicarse a muestras de campo, las asignaciones de género del biosensor coincidieron con los resultados de PCR, confirmando su fiabilidad para uso rápido in situ.

Conclusiones

El biosensor electroquímico de ADN desarrollado ofrece sensibilidad excepcional, amplio rango dinámico y bajo límite de detección para ADN de arowana. Su capacidad de detección rápida a nivel atto-molar, combinada con formato ligero y desechable, lo hace ideal para integración en dispositivos de punto de uso que pueden apoyar operaciones de piscicultura permitiendo identificación temprana de género y color.