Un biosensor de ADN electroquímico altamente sensible de nanocompuesto acrílico-oro para la determinación del género del pez Arowana

Métodos

Aparatos y electrodos

Todas las mediciones electroquímicas se realizaron con DPV utilizando potenciostato / galvanostato Autolab PGSTAT 12 (Metrohm) a un potencial de paso de 0,02 V dentro de la ventana de potencial de −1,0 V a −0,1 V. Se utilizó SPE de Scrint Technology Co Malaysia modificado con AcMP y AuNP como el electrodo de trabajo. Se utilizaron un electrodo de platino (Pt) en forma de varilla y un electrodo de Ag / AgCl relleno con 3,0 M de solución interna de KCl como electrodos auxiliares y de referencia, respectivamente. Se utilizó un baño de sonicador Elma S30H para preparar soluciones homogéneas.

Productos químicos

La 2-2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPP) se adquirió de Fluka. El diacrilato de 1,6-hexanodiol (HDDA), el acrilato de n-butilo (nBA) y el cloruro de Au (III) trihidrato fueron suministrados por Sigma-Aldrich. Las AuNP coloidales se sintetizaron de acuerdo con el método informado por Grabar et al. (1995). El dodecilsulfato de sodio (SDS) y el NaCl se obtuvieron de Systerm. NAS y la sal sódica monohidrato del ácido antraquinona-2-sulfónico (AQMS) se adquirieron de Acros. Se utilizó agua Milli-Q (18 mΩ) para preparar todas las soluciones químicas y biológicas. La solución madre de la sonda de ADN se diluyó con 0,05 M de tampón de fosfato de K (pH 7,0) mientras que las soluciones de ADN complementario (cDNA) y no complementarias (ncDNA) se prepararon con 0,05 M de tampón de fosfato de sodio a pH 7,0 que contenía 1,0 mM de AQMS. El tampón de fosfato de K facilita la inmovilización máxima de la sonda de ADN en el material acrílico funcionalizado con succinimida, mientras que el tampón de fosfato de sodio proporciona una condición óptima para la reacción de hibridación del ADN [21, 22].

Síntesis de microesferas acrílicas

Las AcMP se prepararon de acuerdo con los métodos descritos anteriormente con ligeras modificaciones [22]. Brevemente, se disolvió una mezcla de 450 μL de HDDA, 0.01 g de SDS, 0.1 g de DMPP, 7 mL de monómero nBA y 6 mg de NAS en 15 mL de agua Milli-Q y se sonicó a temperatura ambiente (25 ° C ) durante 10 min. Después de eso, la solución de emulsión se fotocuró con luz ultravioleta durante 600 s bajo un flujo continuo de N ₂ gas. Las microesferas de poli (nBA-NAS) resultantes se recogieron luego mediante centrifugación a 4000 rpm durante 30 minutos, seguido de lavado en tampón de fosfato K (0,05 M, pH 7,0) tres veces y se dejaron secar a temperatura ambiente.

Fabricación de biosensor de ADN utilizando microesferas acrílicas

Antes de la modificación de la superficie, el SPE de carbono se enjuagó a fondo con agua desionizada, se recubrió con microesferas de polímero acrílico a 3 mg / ml y se dejó secar al aire en condiciones ambientales, seguido de un vertido por goteo con 5 mg / ml de AuNP coloidales. La característica electroquímica del carbono SPE antes y después de la modificación con AcMP y AuNP se examinó con el método CV. La Figura 1 muestra el método, que se compone de la fabricación de 3 pasos de biosensor de ADN electroquímico y la detección de ADNc de arowana en 1 paso. En primer lugar, se depositaron aproximadamente 10 μL de AuNP coloidales (1 mg / 300 μL) en un SPE de carbono y se secaron al aire a 25 ° C. Como las AcMP (1 mg) se suspendieron fácilmente en etanol (100 μL) para formar una dispersión estable, se recubrieron gota a gota 10 μL de suspensión de AcMP sobre la SPE modificada con AuNP. El SPE de carbono modificado con AcMP-AuNP se sumergió en 300 μL de solución de sonda de ADN de arowana 5 μM durante 6 h para que tuviera lugar el proceso de inmovilización del ADN y se lavó cuidadosamente con tampón de fosfato K (0,05 M, pH 7,0) tres veces para Retire la sonda de captura no unida. La sonda de ADN inmovilizada se sumergió posteriormente en 300 μL de solución de ADN diana que contenía 2 M de NaCl y 1 mM de AQMS para permitir que ocurrieran reacciones de hibridación e intercalación del ADN en una hora, seguido de un enjuague secuencial con agua Milli-Q y fosfato de sodio. tampón (0,05 M, pH 7,0) para la eliminación de fragmentos de ADN no hibridados y una unión específica del marcador electroquímico AQMS. Todas las mediciones de DPV se realizaron en 4,5 ml de tampón de fosfato K 0,05 M a pH 7,0 y temperatura ambiente.

El procedimiento de fabricación del biosensor electroquímico de ADN arowana basado en un electrodo modificado con AcMP-AuNP

Optimización del biosensor electroquímico de ADN Arowana

Los electrodos de ADN modificados con los respectivos compuestos AcMP, AuNP y AcMP-AuNP se utilizaron en las pruebas de ADNc (5 μM) y ncDNA (5 μM) con el método electroanalítico DPV en presencia de 1 mM de AQMS y 2 M de NaCl en la velocidad de exploración de 0,5 V / s frente al electrodo de referencia Ag / AgCl. La duración de la inmovilización de la sonda de ADN se determinó empapando por separado nueve unidades de SPEs modificadas con AcMP-AuNP en 300 μL de solución de sonda de ADN arowana 5 μM durante 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12 y 18 h, antes reacción con 5 μM de ADNc en tampón de hibridación de ADN (0,05 M de tampón de fosfato de sodio a pH 7,0) que contiene 1 mM de intercalador redox de antraquinona y 2 M de NaCl. El tiempo de hibridación del ADN se investigó sumergiendo el electrodo de ADN en 300 μL de solución de ADNc 5 μM en presencia de 2 M de NaCl y 1 mM de AQMS durante 10 a 100 min. El efecto de la temperatura sobre la duración de la hibridación del ADN se realizó midiendo la respuesta del biosensor de ADN de arowana a 4, 25, 40 y 50 ° C durante un período experimental de 5-90 min en el tampón de medición utilizando la técnica DPV. Para el estudio del efecto del pH, el biosensor de ADN de arowana se sumergió en 5 μM de solución de ADNc preparada a partir de tampón de fosfato de sodio 0,05 M acondicionado con 2 M de NaCl y 1 mM de AQMS entre pH 5,5 y pH 8,0 seguido de medición de DPV. El efecto de varios iones cargados positivamente (es decir, Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ y Fe ³⁺ iones) en la respuesta electroquímica del biosensor de ADN arowana se llevó a cabo agregando CaCl ₂ , NaCl, KCl y FeCl ₃ en 0,05 M de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) antes de la reacción de hibridación del ADN y la medición de DPV. La fuerza iónica del tampón de hibridación se optimizó variando el tampón de fosfato de sodio y las concentraciones de NaCl de 0,002 a 0,1000 M a 1,52 a 5,50 M, respectivamente. A continuación, se estableció la curva de calibración lineal del biosensor de ADN de arowana mediante la medición cuantitativa de una serie de concentraciones de ADNc de 1,0 × 10 ⁻¹⁸ a 2,0 × 10 ⁻² μM a través del método DPV. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Extracción de ADN y análisis de ADN de Arowana

El Instituto de Investigación Pesquera (FRI) del Departamento de Pesca de Malasia proporcionó amablemente un total de 15 muestras de tejido de peces arowana. Todas las muestras de tejido de pescado se almacenaron en etanol al 70% en un enfriador a 4 ° C y se enviaron al laboratorio. Las muestras de tejido de pescado se lavaron con agua Milli-Q y se cortaron en trozos pequeños y se secaron en condiciones ambientales antes de guardarlas en el congelador a -20 ° C. El ADN de Arowana de cada muestra de tejido (35-40 mg cada uno) se extrajo por separado utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Manchester, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se almacenó a -20 ° C cuando no se estaba usando. A continuación, se realizó la amplificación por PCR del fragmento de ADN genómico usando un termociclador de PCR Bio-Rad (PTC-100, Hercules, EE. UU.). Los fragmentos de ADN del producto de PCR se separaron luego con electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los extractos de ADN de arowana también fueron analizados por el biosensor de ADN electroquímico para determinar el género. Las respuestas de DPV obtenidas se compararon con la corriente basal obtenida sin la presencia de ADN de arowana. A t Se aplicó la prueba para determinar la diferencia significativa entre la respuesta del biosensor de ADN y la corriente de referencia a 4 grados de libertad y un nivel de confianza del 95%. La respuesta del biosensor de ADN obtenida a una corriente significativamente más alta que la línea de base indicó que se detectó un pez arowana macho y viceversa.

Resultados y discusión

Las AcMP como sintetizadas se observaron (Fig. 2) bajo microscopio electrónico de barrido (SEM, LEO 1450VP). La distribución de tamaños de las miscropsheres acrílicos preparados a partir de la fotopolimerización se ilustra en la Fig. 3.

Imagen SEM de microesferas de polímero acrílico

Distribución de tamaño de microesferas acrílicas preparadas a partir de fotopolimerización

El efecto de las diferentes velocidades de exploración del SPE de carbono que contiene AcMPs-AuNPs en presencia de K ₃ Fe (CN) ₆ mostró que las corrientes pico de oxidación y reducción aumentaron con el aumento de la velocidad de exploración de 0.05 a 0.30 V / s (Fig. 4). Por lo tanto, se espera que el proceso de transferencia de electrones en la superficie del electrodo sea reversible [22,23,24,25].

Voltamogramas cíclicos de 1,0 mM K ₃ Fe (CN) ₆ en tampón de fosfato de sodio 0,05 M de pH 7,0 con diferentes velocidades de exploración (0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25 y 0,30 V / s) para un SPE de carbono modificado que contiene material AcMP-AuNP en la superficie del electrodo

Según la ecuación de Randles-Sevcik,

$$ \ mathrm {ip} =0.4463 \ \ mathrm {nFAC} \ {\ left (\ mathrm {nFvD} / \ mathrm {RT} \ right)} ^ {1/2} $$ (1)

Se encontró una buena linealidad entre el pico de corriente redox y la raíz cuadrada de la velocidad de escaneo con un coeficiente de correlación ( R ² ) de 0,996 dentro del rango de 50 a 300 mV / s como se muestra en la ecuación. 2 y Fig. 5a.

$$ \ mathrm {ip} =1.463 {\ mathrm {v}} ^ {1/2 \ hbox {-}} 2.451 $$ (2)

Gráfico de las corrientes de pico de oxidación (ip / μA) frente a la raíz cuadrada de la velocidad de exploración ((mV / s) ^1/2 ) ( a ) y gráfico del logaritmo de las corrientes de pico de oxidación (ip / μA) frente al logaritmo de las velocidades de exploración (log (mV / s)) ( b )

Esto indica que la reacción en la superficie del electrodo modificado fue una reacción de difusión controlada [22, 23, 24, 25].

Además, según la Fig.5b, cuando se graficaba el valor logarítmico de la corriente de oxidación frente al valor logarítmico de la velocidad de exploración, se obtuvo una línea lineal con una pendiente de 0,65, que estaba cerca del valor teórico de 0,50 para el proceso de difusión controlada. . Por lo tanto, el estudio ha demostrado que la reacción en la superficie del SPE modificado está principalmente controlada por difusión.

Para el caso ideal de un proceso de transferencia rápido, reversible y de un electrón, ΔEp =0.059 V a 298 K. Sin embargo, los cambios de potencial pico que aumentaron con la velocidad de exploración demostraron separaciones de potencial pico más grandes de más de 0.059 V (Fig 4 ). Esto implica que el proceso de transferencia de electrones en la superficie del electrodo es lento [22, 25, 26], probablemente debido a la resistencia creada por la presencia de material AcMP que cubre la superficie del electrodo.

La Figura 6 muestra la respuesta de DPV del biosensor de ADN de arowana basado en SPEs de carbono modificado con AcMP, AuNP y AcMP-AuNP. La diferencia significativa de corriente de DPV observada entre los experimentos (a) y (c) revela que las sondas de ADN de arowana se injertaron con éxito en las AcMP mediante fuertes enlaces covalentes entre el grupo funcional succinimida de AcMP y el grupo funcional amina de la sonda de ADN aminado, y el inmovilizado La sonda de ADN arowana fue selectiva solo para su ADNc [19, 20]. Los AuNP desempeñaron un papel para ayudar a la conductividad electrónica del AQMS intercalado a la superficie del electrodo fabricado. Sin la inclusión de AuNP en el material compuesto (f), solo las nanopartículas de oro (e) y las nanopartículas de oro y el compuesto AcMP (d), solo se puede observar una respuesta de corriente muy pequeña. Las bajas corrientes de DPV adquiridas en el experimento (b) se debieron a que no se produjo una reacción de hibridación de ADN con ncDNA, lo que también indica que no hay absorciones específicas del indicador redox AQMS en la superficie del electrodo [27, 28].

La señal DPV del electrodo de ADN basado en AcMP-AuNP tras la hibridación con ADNc ( a ) y ADN no complementario ( b ), la respuesta DPV de las AcMP ( f ) y SPE modificado con AuNP ( e ) y SPE modificado con compuesto AcMP-AuNP, así como la respuesta del biosensor de ADN basado en SPE de ADN de sonda modificada con compuesto AcMP-AuNP ( c ) antes de la reacción con ADNc en presencia de AQMS 1 mM a una velocidad de barrido de 0,5 V / s frente al electrodo de referencia Ag / AgCl

Para la duración de la inmovilización de la sonda de ADN, la figura 7a muestra que la respuesta del biosensor de ADN aumentó lentamente durante las primeras 1-3 h del tiempo de inmovilización de la sonda de ADN y el aumento abrupto en la respuesta del biosensor de ADN se puede ver entre 3 y 6 h de duración de la inmovilización de la sonda de ADN. . Esto se debió a que se requirió un tiempo de inmovilización más largo para promover que una mayor cantidad de sondas de ADN se unieran al electrodo modificado con AcMP-AuNP. Con una prolongación adicional del tiempo de inmovilización de la sonda de ADN, no se percibió ningún cambio notable en la respuesta del biosensor de ADN ya que los sitios de unión de las AcMP inmovilizadas se habían unido completamente con las sondas de ADN. La respuesta del biosensor de ADN de arowana también depende del tiempo de hibridación del ADN. El perfil de respuesta del biosensor ilustrado en la Fig. 7b muestra una tendencia de respuesta de corriente de DPV creciente con una duración de hibridación de ADN de 10 a 60 minutos, después de lo cual la respuesta de corriente se vuelve casi meseta. En esta etapa, las sondas de ADN inmovilizadas en el electrodo se han hibridado por completo con el ADNc [29].

Efectos del tiempo de inmovilización de la sonda de ADN ( a ) y tiempo de hibridación del ADN ( b ) en la respuesta del biosensor de ADN de arowana utilizando una sonda de ADN 5 μM y ADNc en presencia de AQMS 1 mM a una fuerza iónica 2 M

También se observa que el tiempo de hibridación del ADN del biosensor de ADN de arowana fabricado dependía de la temperatura y, como gran ventaja, obtuvimos una respuesta de corriente máxima a temperatura ambiente en 30 minutos (Fig. 8). A baja temperatura, es decir, 4 ° C, se requirió mucho tiempo para una reacción de hibridación completa del ADN porque la temperatura fría ralentizó la velocidad de la reacción de hibridación del ADN. Se podría lograr un tiempo de hibridación de ADN más rápido a una temperatura superior a 25 ° C atribuida a la mayor velocidad de reacción de hibridación de ADN que se produjo entre la sonda de ADN inmovilizada y el ADNc para formar el ADN dúplex a altas temperaturas. Sin embargo, la alta temperatura podría deformar permanentemente la estructura de doble hélice del ADN y la regeneración de la molécula de ADN no es posible incluso después del reajuste de la temperatura al valor óptimo [28, 30].

Efecto de la temperatura sobre el tiempo de hibridación del ADN del biosensor de ADN de arowana. La respuesta de DPV se midió en tampón de fosfato de K 0,05 M (pH 7,0) a 4, 25, 40 y 50 ° C durante un período experimental de 5 a 90 min

Como parte de la optimización de la respuesta del biosensor de ADN de arowana, se investigó el efecto del pH de la solución en la reacción de hibridación del ADN. El biosensor de ADN mostró un cambio de corriente insignificante entre pH 5,5 y pH 6,5 debido a la protonación del esqueleto fosfodiéster del ADN, que redujo la solubilidad de las moléculas de ADN en un ambiente acuoso (Fig. 9). Aumento adicional en el pH del medio de hibridación de ADN, la respuesta del biosensor de ADN de arowana aumentó abruptamente a pH 7.0, después de lo cual se pudo discernir una fuerte disminución en la corriente de DPV a medida que el entorno de pH cambiaba a condición básica debido a la desnaturalización irreversible del ADN en el pH más alto intervalo [23, 24, 31,32,33]. Dado que la respuesta máxima de DPV se obtuvo a un pH neutro, la siguiente evaluación electroquímica de la respuesta del biosensor de ADN de arowana se mantuvo a un pH de 7,0 utilizando 0,05 M de tampón de fosfato de sodio.

La respuesta DPV del biosensor de ADN de arowana basado en SPE de carbono modificado compuesto AcMP-AuNP entre pH 5,5 y pH 8,0. La medición de DPV se realizó en tampón de fosfato K 0,05 M (pH 7,0) a 25 ° C y una velocidad de exploración de 0,5 V / s frente al electrodo de referencia Ag / AgCl

El efecto de la valencia de los cationes hacia la reacción de hibridación del ADN se realizó usando diferentes cationes de sales, p. Ej. Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ y Fe ³⁺ iones en el tampón de hibridación de ADN. Los iones cargados positivamente podrían interactuar electrostáticamente con la cadena fosfodiéster cargada negativamente de la molécula de ADN para superar el obstáculo estérico y la repulsión electrostática entre la sonda de ADN inmovilizada y el ADN diana, facilitando así el proceso de hibridación del ADN [34]. La Figura 10 demuestra que la reacción de hibridación del ADN fue favorable en presencia de cationes del orden de Na ⁺ > K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . La presencia de Ca ²⁺ y Fe ³⁺ Se notó que los iones causan una disminución notable en la respuesta de corriente del biosensor de ADN de arowana en comparación con Na ⁺ y K ⁺ iones. Estos fenómenos se atribuyeron a la formación de sales de fosfato cálcico y fosfato ferrum (III) escasamente solubles en el tampón de hibridación del ADN [22], lo que redujo el contenido iónico de la solución y provocó una alta repulsión electrostática entre las moléculas de ADN. Como resultado, la tasa de hibridación del ADN se redujo y condujo a un rendimiento deficiente del biosensor. La respuesta más alta del biosensor de ADN se obtuvo cuando Na ⁺ Se agregaron iones al tampón de fosfato de hibridación de ADN debido a su pequeño tamaño y fuerte afinidad hacia el enlace fosfodieter de ADN.

El efecto de Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ y Fe ³⁺ iones en el tampón de hibridación de ADN (tampón de fosfato de sodio 0,05 M a pH 7,0) en la respuesta de DPV del biosensor de ADN arowana

La concentración de tampón de NaCl y fosfato de sodio (pH 7,0) también debe optimizarse para proporcionar una fuerza iónica óptima para el tampón de hibridación. La Figura 11b indica que la fuerza iónica por debajo y por encima de 2 M no pudo superar la alta repulsión electrostática entre las hebras de ADN. Se encontró que aproximadamente 0,05 M de tampón de fosfato de sodio (Fig. 11a) y 2 M de NaCl proporcionan la fuerza iónica óptima para el ensayo de ADN diana de arowana con el máximo rendimiento del biosensor. Las condiciones óptimas del tampón de hibridación en términos de pH, capacidad tampón y fuerza iónica permitirían que la reacción de hibridación del ADN ocurriera con el impedimento estérico más mínimo [30].

Las tendencias de respuesta del biosensor de ADN de arowana como a Concentración de tampón de fosfato de sodio y b La fuerza iónica del tampón de hibridación varió de 0,002 a 0,100 M y de 1,52 a 5,50 M, respectivamente

El biosensor de ADN optimizado se utilizó para la detección de una serie de concentraciones de ADNc de arowana entre 1.0 × 10 ⁻¹² y 1.0 × 10 ⁻² μM. El biosensor de ADN mostró un amplio rango de respuesta lineal de 1.0 × 10 ⁻¹⁸ a 1.0 × 10 ⁻⁸ M ( R ² =0,99). El límite de detección (LOD) obtenido a 1.0 × 10 ⁻¹⁸ M se calculó sobre la base de tres veces la desviación estándar de la respuesta del biosensor en la curva de respuesta que se aproxima al LOD dividida por la pendiente de calibración lineal. El tamaño de partículas homogéneas de AcMP dentro del rango de micrómetros exhibió una influencia significativa en la sensibilidad y reproducibilidad del biosensor de ADN (RSD =5.6%). The large binding surface area of the immobilised NAS-functionalised AcMPs permitted a large number of DNA molecules to bind covalently to the electrode surface, thereby increasing the DNA biosensor analytical performance with respect to dynamic linear range and detection limit of the arowana DNA biosensor (Fig. 12).

The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 ⁻¹⁸ to 1.0 × 10 ⁻² μM cDNA at pH 7.0

Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor

The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.

Conclusions

The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.

Nanohelices de oro depositadas oblicuamente en superficies de nanosembrado preparadas sin litografía Crecimiento directo de estructuras de ZnO similares a plumas mediante una técnica de solución fácil para la aplicación de fotodetección