Demostración de un biosensor flexible basado en grafeno para la detección rápida y sensible de células de cáncer de ovario

Introducción

El cáncer de ovario es el segundo cáncer ginecológico más común y tiene la mayor mortalidad entre los cánceres ginecológicos [1, 2]. Hasta ahora, los pacientes con cáncer de ovario generalmente se diagnostican muy tarde debido a los síntomas inespecíficos del cáncer de ovario y la falta de métodos de detección precoces eficaces. Las imágenes combinadas con el antígeno carbohidrato CA125 se pueden utilizar en la detección y el diagnóstico de recurrencias después de la cirugía o la quimioterapia. El CA125 no es un único marcador preciso para el cáncer de ovario porque se ve afectado por numerosos factores y tiene un alto valor predictivo de falsos positivos. La sensibilidad del CA125 elevado (> 35 U / mL) que usamos en el diagnóstico de la recurrencia del cáncer de ovario es inferior al 70% [3]. El examen de ultrasonido y el examen radiológico tampoco tienen una sensibilidad ni especificidad adecuadas en la detección temprana y el diagnóstico de recurrencia. Las tasas de supervivencia a 5 años del cáncer de ovario en los estadios I y II son del 90% y del 70% por separado [4]. A pesar del avance en el tratamiento quirúrgico y la terapia adyuvante, la tasa de supervivencia a 5 años del cáncer de ovario en estadio avanzado es inferior al 30% [4]. La detección temprana del cáncer de ovario está relacionada con la tasa de supervivencia a 5 años obviamente más alta, y el diagnóstico temprano de la recurrencia también es importante. Se ha informado que varios enfoques nuevos, como el autoanticuerpo TP53, los ensayos de metilación del ADN, los algoritmos de microARN y el análisis citológico tipo Pap, mejoran la sensibilidad de la detección precoz del cáncer de ovario [5]. Sin embargo, es urgente pero aún desafiante desarrollar un nuevo método de detección con mayor sensibilidad para todas las etapas del cáncer de ovario.

Recientemente, los investigadores encontraron que los tumores en etapa temprana pueden diseminarse hacia las células cancerosas en el torrente sanguíneo y causar metástasis [6]. Las células ingresan al torrente sanguíneo periférico a través de la intravasación de tumores primarios, recurrencias o metástasis llamadas células tumorales circulantes que pueden usarse como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico para tumores sólidos [7]. Las CTC son raras en sangre periférica y los métodos de detección necesitan una alta sensibilidad y especificidad. En los últimos años, se informó de la separación inmunomagnética, la separación de microfluidos, los métodos basados ​​en filtros y la PCR dirigida a ligandos en la detección de CTC [8,9,10,11]. Hasta la fecha, el sistema de búsqueda de células de Janssen Diagnostics es el único método de detección de CTC aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA), que puede usarse para monitorear pacientes con cánceres metastásicos de mama, colorrectal y de próstata [12,13,14]. La detección de CTC en el cáncer de ovario proporciona un método de diagnóstico no invasivo y tiene una ventaja cuando es difícil realizar una biopsia. Sin embargo, la tasa de detección de CTC en las primeras etapas del cáncer de ovario sigue siendo baja. Aún se necesitan los nuevos métodos para detectar CTC con mayor sensibilidad. Si podemos detectar fácilmente CTC en pacientes con cáncer de ovario, puede ser útil tanto en la detección temprana de tumores como en el seguimiento de la recurrencia y el efecto del tratamiento.

El grafeno, un semiconductor bidimensional, fue aislado por Andre Geim y Kostia Novoselov en 2004 [15]. Recientemente, los materiales 2D similares al grafeno se han aplicado ampliamente en la detección y la biosección, la conversión y el almacenamiento de energía, la catálisis, los compuestos y recubrimientos, la electrónica y el campo biomédico [15]. El sensor de grafeno es un candidato prometedor para detectar biomarcadores de cáncer debido a su estructura única y excelente rendimiento eléctrico, que ha sido desarrollado para detectar antígeno carcinoembrionario, antígeno prostático específico, antígeno carbohidrato 19–9 y 15–3 [16,17,18,19 ]. En comparación con los biosensores convencionales basados ​​en grafeno fabricados en SiO ₂ rígido / Sustratos de Si mediante fotolitografía convencional, evaporación de electrodos, proceso de despegue y paquete de sensores utilizando instalaciones preciosas, es importante desarrollar un enfoque fácil y de bajo costo para fabricar biosensores flexibles basados ​​en grafeno con alta sensibilidad y velocidad de detección rápida.

Para abordar estos problemas, en el presente documento, desarrollamos un enfoque novedoso y sencillo para fabricar un biosensor flexible basado en grafeno en un sustrato de PET. Se fabricaron dos electrodos directamente sobre grafeno / PET utilizando pasta de plata, y el conjunto de células se construyó directamente utilizando gel de silicona; Este biosensor flexible se puede fabricar a mano en cualquier laboratorio sin necesidad de un proceso de fotolitografía ni de instalaciones preciosas. Sorprendentemente, nuestros biosensores flexibles basados ​​en grafeno demuestran ser muy sensibles y pueden detectar rápidamente células de cáncer de ovario. Hasta donde sabemos, todavía no hay informes sobre biosensores flexibles basados ​​en grafeno para la detección de células de cáncer de ovario.

Materiales y métodos

Crecimiento y transferencia de película de grafeno

En este trabajo, la película de grafeno se hizo crecer en la superficie de una lámina de Cu (Alfa Aesar, nº 13382) mediante deposición química en fase de vapor (CVD) [20]. En primer lugar, se eliminó el óxido superficial de la hoja de Cu con una solución de ácido clorhídrico al 20% durante 5 min; luego, la hoja de Cu se limpió con agua desionizada varias veces y luego se secó con flujo de nitrógeno. La lámina de Cu limpia se colocó en un bote de cuarzo y se colocó en el tubo de cuarzo del horno CVD. La cámara del horno se bombeó hasta 1 × 10 ^–2 Pa. Se aumentó la temperatura del horno hasta 1000 ° C durante 20 min con 50 sccm de 99,999% H ₂ y luego, se introdujeron 50 sccm de metano al 99,999% en el tubo para el crecimiento de la película de grafeno de gran superficie durante 20 min. Finalmente, el horno CVD se enfrió a temperatura ambiente con CH ₄ / H ₂ flujo de gas.

La lámina de grafeno / Cu de gran superficie se cortó en muchas piezas deseadas. Luego, el PMMA se revistió por rotación sobre la superficie de la lámina de grafeno / Cu, formando la estructura tipo sándwich de PMMA / grafeno / Cu. Posteriormente, la lámina de Cu subyacente se grabó con FeCl ₃ 1 M solución. El PMMA / grafeno se limpió en agua desionizada durante 30 minutos y luego se transfirió al sustrato de PET. Finalmente, se eliminó el PMMA con acetona y se obtuvo una muestra de grafeno / PET.

Fabricación de biosensores basados ​​en grafeno

El procedimiento de fabricación de biosensores basados ​​en grafeno se describe a continuación. En primer lugar, se transfirió una película de grafeno de aproximadamente 1 cm x 2 cm sobre una lámina de Cu sobre un sustrato de PET de 1 cm x 2 cm mediante el método de transferencia en húmedo asistido por PMMA. Luego, se fabricaron dos electrodos cerca del centro de la película de grafeno / PET utilizando pasta de plata. Finalmente, para probar la respuesta eléctrica de la solución de células cancerosas, se construyó un grupo de células con varios milímetros de largo y ancho, y aproximadamente 1 mm de altura con gel de silicona en el borde del electrodo. Una vez que el gel de silicona del conjunto de células se solidifica por completo, se puede utilizar el analizador de semiconductores Agilent 4155B para comprobar si el biosensor de grafeno puede funcionar con normalidad.

Cultivo de células de cáncer de ovario SKOV3

La serie de células de cáncer de ovario SKOV3 (proporcionada por el laboratorio público del Second Affiliated Hospital of West China) se cultivó en medio completo RPMI-1640 (Transgene, Francia) que contenía suero de ternera al 10% (MRC, EE. UU.) En condiciones de CO al 5% ₂ y 37 ° C.

Preparación de la solución celular y medición eléctrica

Las células cancerosas se diluyeron hasta una concentración específica con medio de cultivo celular. Lleve 50μL de solución celular con una pipeta a la ranura para la medición. La señal eléctrica fue registrada por el analizador de semiconductores Agilent 4155B.

Resultados y discusión

La fotografía de 10 × 10 cm ² En la Fig. 1 a se muestra una película de grafeno de gran superficie cultivada con CVD sobre una hoja de Cu. En la Fig. 1a, se puede observar que en comparación con la lámina de Cu desnudo con un color metálico brillante, el color del grafeno / Cu es un poco más oscuro. El correspondiente espectro Raman de grafeno / Cu se muestra en la Fig. 1b. Como se muestra en la Fig. 1b, el Raman alcanza un máximo de 1580 cm ⁻¹ y 2680 cm ⁻¹ corresponden a los picos G y 2D de la película de grafeno. Para verificar aún más la calidad de la película de grafeno, hemos medido el espectro Raman de la película de grafeno monocapa transferida a SiO ₂ / Sustrato de Si, como se muestra en la Fig. 1c. Se puede observar que la relación entre I _G y yo _2D es inferior a 0,5, lo que confirma que el grosor del grafeno es monocapa; También se puede observar que el pico D es muy bajo y casi no se puede observar, lo que sugiere que la calidad de la película de grafeno es muy alta y los defectos son muy pocos.

un Fotografía de lámina de Cu desnudo (panel izquierdo) y grafeno cultivado en lámina de Cu (panel derecho), b Espectro Raman de grafeno / Cu y c Espectro Raman de grafeno / SiO ₂ / Si

Las fotografías de biosensores de grafeno flexibles sobre sustratos de PET se muestran en la Fig. 2. La solución de células cancerosas se puede agregar al conjunto de células y la señal eléctrica del biosensor de grafeno se puede obtener a partir de dos electrodos de pasta de plata. Se midió la respuesta eléctrica para el medio de cultivo celular y la solución de CTC.

Fotografía del biosensor de grafeno / PET

La dependencia del tiempo de la respuesta de corriente para tales líquidos se registra a un voltaje fijo de 0.01 V antes y después de ponerlos en el grupo de celdas. Como se muestra en la Fig. 3, se puede observar que antes de sumergir dicho líquido, la corriente se mantiene constante; cuando estos líquidos se introducen en el grupo de células, la corriente disminuye rápidamente y luego se mantiene lentamente un nuevo equilibrio. La respuesta se define como η =( yo ₀ - yo ) / yo ₀ * 100%, donde I ₀ es la corriente justo antes de sumergir el líquido, y I es el valor máximo (o mínimo) después de sumergir el líquido en algún momento. Se puede ver que después de poner tales líquidos, aumenta la resistencia del grafema. La respuesta eléctrica para el medio de cultivo de células desnudas y la solución de CTC antes y después de sumergir la solución 200 s son 2,96% y 37,04%, respectivamente. Obviamente, en comparación con el medio de cultivo de células desnudas, la respuesta eléctrica para la solución de CTC incluso con 30 células / ml es muy significativa, lo que sugiere que el biosensor flexible basado en grafeno es muy sensible para la detección de células cancerosas.

un Respuesta eléctrica para medio de cultivo de células desnudas y b solución de cáncer con 30 células

La dependencia del tiempo de la señal eléctrica para el medio de cultivo de células desnudas y la solución de CTC con 30 células cancerosas / ml se analiza más a fondo a partir de la Fig. 3. Como se muestra en la Fig. 4, se puede observar que, en comparación con el medio de cultivo de células desnudas, el La respuesta para la solución de CTC (incluso 30 células / ml) es muy sensible y rápida. Después de sumergir la solución celular, solo necesita 2.1, 2.0, 4.5, 7.5, 10.5, 28.5 s para alcanzar una respuesta del 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, mientras que la respuesta del cultivo celular correspondiente medio solo aumenta de 0,15 a 1,3%. Eso significa que el biosensor de grafeno flexible es muy adecuado para una detección rápida y sensible en 5 s.

Dependencia del tiempo de la respuesta eléctrica para el medio de cultivo celular y la solución de CTC

Además, investigamos la respuesta eléctrica para dos tipos de células cancerosas CTC (células SUDHL8 y células OCILYS) con las mismas concentraciones de 10,000 (10 K) / ml. Como se muestra en la Fig. 5, la dependencia del tiempo de la corriente para dos células cancerosas diferentes con una tendencia un poco diferente y una gran diferencia en la respuesta eléctrica. Eso significa que el biosensor de grafeno promete usarse para identificar diferentes células cancerosas.

Dependencia del tiempo de la respuesta eléctrica para diferentes células cancerosas: a SUDHL8 y b OCILIAS

También se ha investigado la dependencia del tiempo de la corriente eléctrica y la respuesta para la solución de células cancerosas SUDHL 8 con varias concentraciones de células de 10.000 (10 K) / ml y 100 K / ml. Como se muestra en la Fig. 6, se puede observar que la solución con una concentración de células cancerosas más baja muestra una corriente más alta, lo que sugiere que la célula cancerosa tiende a ser aislante y muchas más células no son beneficiosas para las conductoras. La dependencia del tiempo de respuesta para dos soluciones de concentración muestra tendencias de cambio similares y la respuesta para una solución de menor concentración es un poco más alta que la de una solución de mayor concentración. Estos resultados muestran que el biosensor se puede utilizar para identificar la solución del cáncer con diferentes concentraciones.

Dependencia temporal de la corriente eléctrica ( a ) y respuesta ( b ) para células cancerosas SUDHL8 con diferentes concentraciones de 10 K y 100 K células / ml

Como se mencionó anteriormente, los resultados muestran que el biosensor a base de grafeno, barato y flexible, muestra una respuesta diferente para el medio de cultivo celular y la solución del cáncer, diferentes células cancerosas y la solución de células cancerosas con diferentes concentraciones, lo que sugiere que dicho biosensor flexible a base de grafeno es prometedor. se utiliza para detectar e identificar células de cáncer de ovario CTC.

Conclusión

Con el fin de desarrollar un método de detección precoz eficaz, especialmente para el cáncer de ovario, desarrollamos un biosensor flexible basado en grafeno muy simple sobre sustrato de PET. Este biosensor flexible consta de un grupo de celdas y dos electrodos y compara la señal eléctrica antes y después de agregar la solución de celda, lo que muestra una alta sensibilidad y una velocidad de detección rápida. Muestra respuestas obvias diferentes para el medio de cultivo celular y la solución de cáncer, diferentes células cancerosas y solución de células cancerosas con diferentes concentraciones. Nuestro trabajo indica que el biosensor flexible basado en grafeno promete ser utilizado para detectar / identificar de manera sensible y rápida las células de cáncer de ovario CTC.

Disponibilidad de datos y materiales

Los autores pueden confirmar que todos los datos relevantes están incluidos en el artículo y sus archivos de información complementaria.

Abreviaturas

CA:

Antígeno de carbohidratos

CTC:

Célula tumoral circulante

PET:

Tereftalato de polietileno

FDA:

Administración de Alimentos y Medicamentos

CVD:

Deposición de vapor químico

Peapods fullerenos La bifurcación de susceptibilidad magnética en el aislante topológico Sb2Te3 dopado con Ni con orden antiferromagnético acompañado de una alineación ferromagnética débil